放线菌菌株SCAUT001及其应用的制作方法

放线菌菌株scaut001及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物领域，具体涉及一种放线菌菌株scaut001及其应用。


背景技术：

2.凉山州是四川省三大牧区之一，畜牧业历史悠久，是农牧民现金收入的主要来源之一，尤其在高山地区畜牧业现金收入占农村家庭收入的70％以上。由于凉山州具有冬春气候干燥，夏季多雨，干湿分明的气候特点，牲畜在越冬渡春期间缺乏青饲料的问题很突出。然而，在凉山州盆周山区尤其在海拔1700-3200m的中山和亚高山区，冬春期间土地却大量闲置。光叶紫花苕子(viciavillosa var.glabresens)是豆科巢菜属一年生或越年生草本植物，喜温凉湿润气候，较耐寒耐旱，适宜海拔1500-3200m地区，尤以海拔1800-2500m区间最为适宜，具有保水、保肥、改土、固氮增肥作用，改善生态环境等优点，是高寒山区推广的主要当家牧草。凉山州具有长期种植光叶紫花苕子的历史，可以在冬季空闲茬口种植光叶紫花苕子，具有充分利用光热资源和保墒的作用，增加土壤中有机质的含量，提升土壤质量，同时又很好解决了性畜越冬渡春缺乏青饲料的问题。
3.近年来化肥过量施用不仅污染了环境，也造成了土壤板结，肥力下降，农产品品质下降等一系列问题。土壤微生物在物质循环、有机物分解以及植物养分利用过程中发挥着重要的作用，天然存在于土壤并定殖于植物根际的促生菌(plant growth promoting rhizobacteria, pgpr)，不仅能改善土壤理化性质，还可以通过产生生长激素、固氮、溶磷作用促进植物生长，其次pgpr还可以通过产生几丁质酶、纤维素酶、抗生素等物质抵抗病原菌侵染，提高植物的抗逆性的方式促进植物生长。虽然光叶紫花苕子具有与根瘤菌共生结瘤固氮的能力，但生物固氮过程以光叶紫花苕子的生长过程也需要其它营养的参与，根际促生菌pgpr可以把土壤中不能被植物利用的无机元素转化植物利用的有机物质，促进植物营养元素的供应和生长。由于光叶紫花苕子是豆科牧草，以往的研究主要关注的是根瘤菌与光叶紫花苕子的共生关系，而有关根际促生菌对光叶紫花苕子生长的影响还尚未见报道。
4.放线菌是植物根际微生物群落的重要组成部分，在土壤物质转化过程中起着重要的作用，以溶磷固氮作用、分泌植物生长调节物质、合成铁载体、诱导植物产生抗性以及产生抗真菌代谢产物等方式促进植物生长，在农业生产中具有很大的应用潜力。以凉山州采集的光叶紫花苕子为研究对象，分离筛选高效pgpr菌株资源，为利用根际促生菌提高光叶紫花苕子的抗逆性，也为研制微生物肥料收集优良pgpr菌株资源，最大限度地发挥光叶紫花苕子的生态效益和经济价值，符合凉山州农牧业的可持续发展和生态环境保护的需求。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题为：为了挖掘和筛选能促进光叶紫花苕子生长的pgpr菌株资源，并将其应用于农业生产中，本发明目的之一提供一株具有抗逆、促生功能的根际放线菌，另一个目的是提供该菌株的应用。
6.本发明的技术方案为：放线菌菌株williamsia herbipolensis scaut001，简称 scaut001，该菌株已于2020年12月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：61375，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
7.含有放线菌菌株williamsia herbipolensis scaut001的微生物菌剂。
8.含有放线菌菌株williamsia herbipolensis scaut001的微生物肥。
9.放线菌菌株williamsia herbipolensis scaut001或含有该菌株的微生物菌剂或微生物肥在凉山光叶紫花苕子(vicia villosa roth var.glabrescenscv.liang shan)种植上的用途。
10.进一步地，所述种植是指在凉山州种植凉山光叶紫花苕子(vicia villosa rothvar.glabrescenscv.liang shan)。
11.本发明scaut001的菌株形态特征：在tsa培养基上28℃培养3d后，菌落较小、呈圆形凸状，边缘整齐，表面光滑，菌落颜色呈橙红色，易挑取，革兰氏染色阳性，需氧，短小杆菌，无芽孢，菌体大小为1.5
×
1.0um。
12.本发明scaut001菌株的16s rrna序列测定，所测序列提交ezbiocloud网站 (www.ezbiocloud.net)进行同源性比对，并利用mega 7.0软件进行系统发育分析。结果表明，菌株scaut001与williamsia herbipolensis的16s rrna核苷酸序列的同源性为100％。综合形态特征和16s rrna序列同源性分析等实验结果，鉴定scaut001为williamsiaherbipolensis。
13.本发明scaut001菌株的dna进行16s rrna基因系统发育分析，为序列表seq idno.1所示。
14.本发明scaut001菌株具有产iaa、产铁载体、产纤维素酶、产几质酶以及溶磷等促生功能，同时具有耐盐、耐旱及耐酸碱等抗逆能力。
15.砂培实验结果表，接种放线菌williamsia herbipolensis scaut001菌剂后，凉山光叶紫花苕子植株的株高、根长、地上部及地下部鲜重和干重、叶绿素都相较于不接种处理，分别提高了24.32％、23.70％、21.61％、19.05％、16.05％、13.33％、11.09％，说明菌株scaut001能明显的促进凉山光叶紫花苕子的生长，具有较好促生效果。
16.大田试验结果表明，接种放线菌williamsia herbipolensis scaut001菌剂后，凉山光叶紫花苕子的株高、根长、鲜重、干重、根重、根瘤数、叶绿素含量及粗蛋白含量均比对照提高了27.83％、30.15％、21.26％、20.10％、22.5％、26.45％、9.27％、10.04％，每亩产量较对照增加27.98％，凉山光叶紫花苕子白粉病发病率较不接种处理植株的发病率降低了58.68％；凉山光叶紫花苕子根际土壤中的碱解氮、速效钾、有效磷、有机质均较对照增加23.96％、 20.96％、17.71％、12.73％，土壤中脲酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶、蔗糖酶均较对照提升了45.83％、28.67％、43.80％、32.83％，根际土壤中可培养细菌、放线菌、真菌和根瘤菌数量与未接种处理相比分别提高52.89％、76.48％、59.32％、70.40％，根际土壤中细菌和真菌群落的丰富度较对照组均明显提高。
17.对后茬成熟期烤烟农艺性状、干物质积累以及根系结构等指标测定结果表明，前茬接种过根瘤菌的处理，后茬烤烟的株高、茎围、有效叶数、最大叶长、最大叶宽、最大叶面积较对照组分别增加了9.02％、12.91％、17.99％、12.09％、13.69％、24.13％，干物质积累
量较对照组增加了11.43％，总根长、总根面积、根平均直径、根体积、根毛数较对照组分别增加了11.77％、8.60％、12.35％、14.37％、13.72％。
18.接种放线菌williamsia herbipolensis scaut001菌剂后，促进了凉山光叶紫花苕子的生长，增加了结瘤能力，提高了植株的品质，改善了土壤的微生态条件，提升了土壤质量，促进了后茬烤烟的生长，为凉山光叶紫花苕子微生物菌剂的研发提供了菌种资源。
19.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
20.本发明分离筛选提供的williamsia herbipolensis scaut001具有产生iaa，铁载体，溶磷、降解纤维素和几丁质等促生能力，还同时具有耐盐、耐酸碱、耐旱等抗逆功能，通过在凉山光叶紫花苕子上的应用，获得能够促进凉山光叶紫花苕子结瘤和生长的效果，本发明不仅增加了牧草的产量同时也提升了土壤质量改良了植烟土壤，为后茬烟叶种植以及稳定烟叶品质提供了保障，在农业生产具有较好的应用潜力。
21.保藏信息：
22.放线菌菌株williamsia herbipolensis scaut001，简称scaut001，该菌株已于2020年 12月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmcc no：61375，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
附图说明
23.图1为光叶紫花苕子根际放线菌williamsia herbipolensis scaut001在isp4培养基上的菌落形态和菌体显微图；
24.图2为基于16s rrna基因序列构建的光叶紫花苕子根际放线菌williamsia herbipolensis scaut001系统发育树；
25.图3为光叶紫花苕子根际放线菌williamsia herbipolensis scaut001通过砂培方式促进光叶紫花苕子生长的效果，其中左边为不接种对照，右边为接种scaut001处理；
26.图4田间实验结果，左：对照；右：scaut001；
27.图5凉山光叶紫花苕子根际土壤细菌alpha多样性(a)和真菌alpha多样性(b)。
具体实施方式
28.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
29.实施例1根际放线菌scaut001的分离纯化
30.1.1凉山光叶紫花苕子根际放线菌的分离
31.2018年于四川省凉山彝族自治州会东县采集光叶紫花苕子，抖掉根系上多余的泥土，将根放入装有25ml磷酸缓冲液的50ml灭菌离心管中，用超声波(150w)处理10min 后在无菌条件下取出根，以3000g离心10min去上清，沉淀即为根际土，并作10-1
、10-2
、 10-3
梯度稀释，取100ul悬液均匀涂布于改良高氏培养基上进行分离，每一稀释浓度作3个重复，于28℃恒温培养箱中培养5-7d。挑取具有典型放线菌菌落特征的菌株，用稀释平板划线法，纯化直至获得纯化菌株。将纯化菌株接种至isp4液体培养基中，28℃振荡培养7 d后用30％甘油保种，-70℃冷冻保藏。
32.1.2菌株鉴定
33.1.2.1菌株形态
34.将菌株接种在isp4培养基上，置于28℃培养5天，观察菌株的菌落形态。
35.1.2.2菌株的分子鉴定
36.(1)试剂：溶菌酶，蛋白酶k，10
×
tae，1
×
te，3mol/l乙酸钠(ph4.8-5.2)，70％乙醇，(饱和酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1)，mix。
37.(2)引物
38.primer a:5
′‑
agagtttgatcctggctcag-3
′
(与16s rrna 5
′
端8-27位点碱基相同)；primer b:5
′‑
ttaaggtgatccagccgca-3
′
(与16s rrna 3
′
端1523-1504位点碱基相同)；
39.(3)放线菌dna提取
40.取少许菌体于无菌的1.5ml eppendorf管中，加入20μl(50mg/ml)终浓度达到2 mg/ml的溶菌酶，放入37℃摇床，200rmp/min，1-2h；加入20％sds 50μl及蛋白酶k 5 μl(20mg/ml)，混匀放入55℃摇床，200rmp/min处理1-2h；加入550μl(苯酚:氯仿: 异戊醇＝25:24:1)抽提，12000rmp/min离心10min，吸取上清(重复三次)；加入800μl 无水乙醇，80μl 3mol/l乙酸钠(ph 4.8-5.2)，混匀，于4℃沉淀dna，1h，12000 rmp/min，10min，弃上清；加入200μl 70％乙醇，清洗管壁1-2次，12000rmp/min，离心 5min，弃上清待乙醇挥发干后，加入50μl 1
×
te溶解dna，并于-20℃保存；1％琼脂糖凝胶电泳检测。
41.(4)放线菌16s rrna基因扩增
42.16s rrna基因扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性1min，56℃退火1min， 72℃延2min，30个循环，72℃总延伸10min。pcr产物经上海生工ez spin columnpcr product purification kit unlq-1柱式pcr产物纯化试剂盒(sk1142-n)纯化，按操作指南进行，纯化产物送生工生物工程有限公司测序。
43.(5)16s rrna基因序列分析及系统发育树构建
44.将测序后所得序列利用blast软件在ncbi中进行相似性搜索，选取相似性最高已发表菌株的16s rrna基因序列作为参比序列，采用clustal x软件进行多序列比对分析，并通过mega 7.0软件以n-j法构建系统发育树，确定放线菌的分类地位。
45.1.3实验结果
46.从凉山光叶紫花苕子根际土壤中分离获得放线菌scaut001，在isp4培养基上28℃培养3d后，菌落较小、呈圆形凸状，边缘整齐，表面光滑，菌落颜色呈橙红色，易挑取，革兰氏染色阳性，需氧，短小杆菌，无芽孢，菌体大小为1.5
×
1.0um(图1)。
47.菌株scaut001进行16s rrna序列测定，在ncbi数据库中进行blast同源性比对，该菌株与williamsia herbipolensis的相似性度达100％。综合形态特征、生理生化特征以及 16s rrna序列同源性分析等实验结果，鉴定scaut001为williamsia herbipolensis(图2)。
48.实施例2根际放线菌scaut001的促生功能筛选
49.2.1促生功能筛选
50.2.1.1产iaa能力测定
51.取20μl菌悬液接入含0.5mol/l色氨酸的isp4液体培养基中，3次重复，设置空白对照，28℃120r/min摇床培养3d，8000r/min离心24h，取1ml菌液上清，加入2mliaa显色液，25℃暗反应30min，530nm波长下比色，记录吸光度值。以未接菌的液体培养基为对照调零，以浓度0、5、20、40、60mg/l的吲哚乙酸标准液同上做标曲，计算出测定液中iaa的浓度。
52.2.1.2产铁载体能力测定
53.取0.012g铬天青溶于10ml双蒸水中，并与2ml 1mmol/l的fecl3·
6h2o溶液混匀，得到溶液a；取0.015g十六烷基三甲基溴化铵溶于8ml双蒸水中，得到溶液b；将溶液a 缓慢加到溶液b中，混合均匀，得到染液c；将10
×
mm9盐溶液20ml和6.04g哌嗪二乙磺酸加入盛有150ml双蒸水的三角瓶中混合均匀后用50％naoh调节ph到6.8，再加入 3.2g琼脂粉，得到培养基d；将染液c、培养基d及1mmol/l的cacl2，1mmol/l的 mgso4，20％的葡萄糖，10％的酪蛋白氨基酸分别在115℃灭菌20min，待各溶液温度降至 50-60℃时，取200μl cacl2，4ml mgso4，6ml酪蛋白氨基酸，2ml葡萄糖加入培养基d，再沿着瓶壁加入染液c，充分混匀切勿产生气泡即得蓝色检测培养基，倒板。用无菌竹签接种供试菌株，每板等距接种5个菌饼，每株菌重复3次，28℃，培养3d，观察记录橘黄色透明圈大小。
54.2.1.3溶磷能力检测
55.将生长良好的放线菌菌株用无菌打孔器(d＝5mm)制成菌饼，分别将其倒置于pko培养基上，菌饼距平板中心点2cm的4个方向，于28℃培养3d后，分别测量透明圈直径 (d)和菌落直径(d)，计算二者比值(d/d)，比值越大说明溶磷效果越显著。
56.2.1.4羧甲基纤维素酶(cmcase)活性测定
57.将初筛获得的菌株制成种子悬浮液，按10％的接种量接种于碳源为cmc-na的复筛培养基的三角瓶中，28℃恒温震荡培养，分别测定3、5、7、9、11d各菌株的羧甲基纤维素酶(cmcase)活力，设置3个重复。
58.(1)标准曲线的绘制
59.无水葡萄糖80℃烘干至恒重制成1mg/ml标准葡萄糖溶液，取6支试管分别加入标准葡萄糖溶液各0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml,补加蒸馏水至2.0ml，加入dns试剂1.5ml，沸水浴5min，冷却后定容至25ml，分光光度540nm下测定od值，绘制出标准曲线。
60.(2)粗酶液的制备
61.配制液体复筛培养基分装于250ml的三角瓶中，每瓶45ml，接入5ml的种子菌悬液，置于28℃的摇床中培养，在培养7d后分别取1.5ml发酵液于离心管中，10000r/min 离心10min得粗酶液。
62.(3)酶活力测定
63.酶活力测定方法：取0.1ml粗酶液，加入1.9ml质量分数为1％的cmc-na溶液。在45℃恒温下水解20min，加入1.5ml dns显色液进行沸水浴5min，定容至25ml，540 nm处比色，测其吸光度(od)值，与标准葡萄糖曲线对照，由od值计算出葡萄糖量 (m1)。另将上清液各0.1ml，加水1.9ml，再加1.5ml dns，沸水浴5min，定容至25 ml，540nm处比色，测得粗酶液的葡萄糖量(m2)。将葡萄糖量(m1)减去葡萄糖量 (m2)得到真正由cmc酶降解1％cmc溶液得到的葡萄糖量，由光密度值计算出的葡萄糖量a，通过公式计算菌株的酶活力。
64.2.1.5产几丁质酶检测
65.采用mm-chitin培养基，将供试菌株接种到培养基上，若产生水解圈，则证明是具有降解几丁质能力的菌株。
66.2.2抗逆功能筛选
67.2.2.1耐盐检测
68.将供试菌株划线于isp4培养基于28℃培养3-4d，用无菌水制成菌悬液。以nacl浓
度： 0％，1％，3％，5％，7％,，制作7种isp4固体培养基，将菌悬液用无菌竹签点到培养基上，做3个重复，28℃培养3-4d，观察每株根际放线菌的生长情况并记录结果，若在某一盐浓度下菌株能正常生长，则说明该菌株有耐该盐浓度的能力。
69.2.2.2耐酸碱性检测
70.将供试菌株划线于isp4培养基于28℃培养3-4d，用无菌水制成菌悬液。以isp4培养基配方为基础，用naoh、kh2po4、na2co3、kcl、nahco3、na2hpo4·
10h2o、柠檬酸钠、柠檬酸三钠配置ph反应缓冲液，使培养基的ph分别达到4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、 10.0、11.0、12.0，将菌悬液用无菌竹签点到培养基上，做3个重复，28℃培养3-4d，观察每株根际放线菌的生长情况并记录结果，若在某ph下菌株能正常生长，则说明该菌株有耐该酸碱度的能力。
71.2.2.3耐旱性检测
72.耐旱性的初筛试验采用聚乙二醇(peg)6000人工模拟干旱条件进行，试验设置以下4 个不同的peg 6000水平：
73.(1)不加peg 6000(对照)，仅使用isp4液体培养基；
74.(2)15％的peg 6000；
75.(3)25％的peg6000；
76.(4)35％的peg6000。
77.它们对应的水势分别为：0、-0.278、-0.699、-1.309mpa。供试菌株分别挑取1环接种到已灭菌的isp4液体培养基中，置于摇床28℃、200r/min振荡培养4d制成接种液，调整 od600值约0.7左右。吸取0.1ml接种液接入不同peg6000浓度isp4液体培养基中， 28℃、200r/min摇床培养7d，然后混匀取样，在600nm下测定其od值，以od值的大小评价其生长繁殖状况。测定前需用相应浓peg6000的isp4培养液对仪器进行调零。以未接菌的isp4液体培养基作为对照，若测定的od 600大于0，则表示该菌株在干旱条件下具有耐旱性。
78.2.3实验结果
79.经测定，放线菌williamsia herbipolensis scaut001的iaa产量为62.13mg/ml，并具有产纤维素酶，产几丁质酶以及溶磷的能力(表1)；此外，该菌株能在ph 5-11，盐浓度 0.5-2％，peg6000浓度为15％-25％的isp4培养基中生长(表2)。结果表明，放线菌 scaut001具有较好的促生和抗逆功能，具有进一步开发应用的潜力。
80.表1菌株scaut001促生功能
[0081][0082]
表2菌株scaut001抗逆功能
[0083][0084]
实施例3光叶紫花苕子水培实验
[0085]
3.1水培实验
[0086]
将供试放线菌菌株先接到isp4平板培养基上活化，然后转接于isp4液体培养基中过夜培养至对数期，其菌株的生长情况用平板法检测，计算含菌量。
[0087]
光叶紫花苕子种子浸泡过夜后进行表面消毒，用无菌镊子夹取种子植入装有滤纸与无菌蛭石的培养皿中，每个培养皿种植10粒，再加入无菌水保持水分，并保持空气流通。将试验所需的镊子、滤纸、培养皿、塑料杯、蛭石、石英砂、低氮营养液灭菌。
[0088]
低氮营养液配方：kno
3 10.1g,kh2po
4 2.2g，mnso4·
h2o 100.0mg，kcl 15.5g， znso4·
7h2o 25.0mg，mgso4·
7h2o 25.0mg，h3bo
3 25.0mg，cacl2·
2h2o 21.5g， cuso4·
5h2o 25.0mg，na2moo4·
2h2o 5.0mg，nano
3 3.0g，柠檬酸铁3.0g。
[0089]
将灭菌后的蛭石装入塞有纱布条的塑料杯中，在下层的玻璃瓶中注入营养液，并用保鲜膜封好接口。用无菌镊子夹取催芽后的种子植入装有无菌蛭石的塑料杯中，每杯种植3粒，再沿各种子根部加入该菌液2ml，加入菌液后在表层覆盖一层石英砂。每个菌设置三个重复，并设置对照处理。培养45d，不定时补充营养液。培养结束后，小心地将光叶紫花苕子从杯中取出，清水洗净根上附着的蛭石后，测定株高、根长、鲜重、干重等指标。
[0090]
3.2实验结果
[0091]
水培实验结果表明，接种放线菌williamsia herbipolensis scaut001的凉山光叶紫花苕子植株的株高、根长、地上部及地下部鲜重和干重、叶绿素都相较于不接种处理(ck)，分别提高了24.32％、23.70％、21.61％、19.05％、16.05％、13.33％、11.09％(表3，图3)，说明菌株scaut001能明显的促进凉山光叶紫花苕子的生长，具有较好促生能力。
[0092]
表3 scaut001水培实验结果(45d)
[0093][0094]
注：同列不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上的差异显著
[0095]
实施例4生物肥料的制备及田间应用效果
[0096]
放线菌williamsia herbipolensis scaut001菌株田间应用
[0097]
1、菌剂制备
[0098]
放线菌williamsia herbipolensis scaut001菌株接种在isp4斜面培养基上，于28℃恒温箱中培养至菌苔长满后，用无菌水洗下，接种于放线菌isp4液体培养基中，置于28℃，160 r/min的恒温震荡培养至菌悬液od值(λ＝600nm)达到0.9后，备用(注：明确每ml菌液的菌数，即5
×
10
10
cfu/ml)。以麦麸载体，按重量体积比加入，玉米粉1％，豆饼粉1％， kh2po
4 0.1％，caco
3 0.1％，ph 7.0，加水调节麦麸含水量至40％，121℃，0.1mpa蒸气灭菌30民；将制备好的菌悬液按20％(体积比)的接种量接种于固态培养基中混合均匀，使载体的含水量保持在50-60％，28℃静置培养至菌剂活菌数为2
×
10
10
cfu/g，即为scaut001 的固态发酵菌剂，菌剂在无菌条件下20℃保存6个月其活菌数》2
×
108cfu/g且不影响其促生活性。
[0099]
2、菌剂williamsia herbipolensis scaut001田间应用
[0100]
实验材料：凉山地方牧草品种凉山光叶紫花苕子。
[0101]
实验地点：凉山州会东县
[0102]
播种前半小时选择阴暗处进行拌种，将含有放线菌菌剂的麦皮载体置于清水搅拌均匀 (菌数》2
×
108cfu/ml)，光叶紫花苕子的种子置于网状尼龙袋中清洗后置于盛有放线菌菌剂的塑料盆中浸泡20-30min后取出，在阴暗处风干至不粘手即可播种。种植面积1亩，
同时进行不接种对照试验。在光叶紫花苕子的盛花期采集草样与土样，采用30cm
×
30cm的样方随机在小区内进行取样，为排除边际效应，小区两边各两行不取样。
[0103]
(1)凉山光叶紫花苕子生长和生理指标测定
[0104]
采集的光叶紫花苕子样本带回实验室，清洗去泥后，分别测定植株的株高、根长、鲜重、干重、根重、根瘤数、叶绿素含量、粗蛋白含量及其产量。
[0105]
(2)凉山光叶紫花苕子的发病率调查
[0106]
在接种和未接种处理的小区里随机取样调查光叶紫花苕子发病情况，取样50株调查所有叶片发病情况，并按以下公式计算发病率。
[0107]
发病率＝[病株(器官、叶)数/调查总株(器官、叶)数]
×
100％
[0108]
(3)土壤理化及酶活测定
[0109]
采集光叶紫花苕子根际土壤样品各分为3份，一份用于测定土壤中的碱解氮、速效钾、速效磷、有机质等理化指标，以及脲酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶、蔗糖酶等土壤酶活的测定。
[0110]
(4)土壤微生物数量及种群多样性分析
[0111]
采集的另外两份土壤样品，一份用土壤微生物的平板计数；另一份用spinkit for soil(mp bio laboratories,california,usa)试剂盒提取土壤总dna，采用引物515f (5'-gtgccagcmgccgcggtaa
ꢀ‑
3')和907r(5'-ccgtcaattcctttga gttt-3')对细菌16s的v4-v5区进行扩增，采用引物its3-2024f(5'-gca tcgatgaagaacgcagc
ꢀ‑
3')和its4-2409r(5'-tcctccgcttattgatatgc-3')对真菌进行its2测序扩增。扩增完成后，后续文库构建、miseq测序、序列拼接均在派诺森illumina miseq测序平台进行。高通量测序数据的生物信息学分在派诺森基因云(https://www.genescloud.cn/home)进行。根据序列相似度，将有效序列聚类为otu(97％相似度)，对otu进行物种注释获得各样品的分类学信息，计算细菌和真菌多样性并获得相关指数。
[0112]
3、菌剂scaut001田间应用效果分析
[0113]
(1)对凉山光叶紫花苕子生长的影响
[0114]
接种放线菌scaut001后，凉山光叶紫花苕子的株高、根长、鲜重、干重、根重、根瘤数、叶绿素含量及粗蛋白含量均比对照提高了27.83％、30.15％、21.26％、20.10％、 22.5％、26.45％、9.27％、10.04％(图4，表4)，每亩产量较对照增加27.98％(表5)。研究表明，很多促生菌能通过产生吲哚乙酸、赤霉素等植物激素调节植物生命活动，促进植物生长。菌株scaut001具有产iaa、溶磷等能力，接种凉山光叶紫花苕子后促进了植物的生长。此外，我们还发现接种放线菌scaut001提高了凉山光叶紫花苕子的结瘤率，这可能与放线菌scaut001具有溶磷和产铁载体等能力有关，土壤中可吸收的磷、铁的含量增加，增加了凉山光叶紫花苕子的根瘤数，促进了根系发育，提高了固氮效率和凉山光叶紫花苕子的品质。
[0115]
表4接种scaut001菌剂对光叶紫花苕子生长的影响
[0116][0117]
注：同列不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上的差异显著
[0118]
表5接种scaut001菌剂对光叶紫花苕子产量的影响
[0119][0120]
注：同列不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上的差异显著
[0121]
(2)对凉山光叶紫花苕子发病率分析
[0122]
接种放线菌scaut001和不接种处理的凉山光叶紫花苕子常见的白粉病发病率分别为5.37％和13.45％，接种处理较不接种处理植株的发病率降低了58.68％。研究发现，放线菌是产生抗生素等次生代谢产物的重要来源，这一特征有助于放线菌成为植物病原菌的活性拮抗剂，接种放线菌scaut001明显减少了凉山光叶紫花苕子的发病率，这可能与放线菌 scaut001产生某些抑菌次生代谢产物有关。
[0123]
(3)对土壤理化及酶活的影响
[0124]
接种放线菌scaut001后，凉山光叶紫花苕子根际土壤中的碱解氮、速效钾、有效磷、有机质均较对照增加23.96％，20.96％、17.71％、12.73％，土壤中脲酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶、蔗糖酶均较对照提升了45.83％、28.67％、43.80％、32.83％(表6)。结果表明，接种具有促生功能的放线菌scaut001后，不仅增加植株的根瘤数量和共生固氮效率，同时也增加了土壤中可利用氮素含量，促进了土壤微生物参与土壤中养分的转化，从而提高了土壤酶活性，提升了土壤质量，为植株生长提供了良好的营养条件。
[0125]
表6接种scaut001菌剂对凉山光叶紫花苕子根际土壤理化性质的影响
[0126][0127]
注：同列不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上的差异显著
[0128]
(4)对土壤微生物数量的影响
[0129]
接种放线菌scaut001处理的根际土壤中可培养细菌、放线菌、真菌和根瘤菌数量显著高于不接种处理(表7)，与未接种处理相比分别提高52.89％、76.48％、59.32％、70.4％，结果表明接种放线菌scaut001刺激了土壤中土著微生物的繁殖，提高了可培养微生物的数量，特别是改善了土壤的微生态条件。
[0130]
表7接种scaut001菌剂对凉山光叶紫花苕子根际土壤(单位：cfu/g)
[0131][0132]
注：同列不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上的差异显著
[0133]
(5)对土壤微生物菌群多样性的分析
[0134]
选取chao1、shannon、simpson以及observed_species指数来评估和分析接种放线菌 scaut001和未接种(对照组ck)的凉山光叶紫花苕子根际土壤微生物多样性和丰富度。由图5可以看出接种放线菌scaut001凉山光叶紫花苕子根际土壤中细菌和真菌的chao1 和observed_species指数均高于未接种的对照组(图5中a,b)(p《0.05)，说明接种放线菌 scaut001后，凉山光叶紫花苕子根际土壤中细菌和真菌群落的丰富度较对照组均明显提高，表明放线菌scaut001增加了凉山光叶紫花苕子根际土壤微生物的组成，提高了微生物
群落结构的复杂性，为植株健康生长构建了良好的土壤生态环境，促进了植株的生长。
[0135]
实施例5接种放线菌scaut001对后茬烟草生长的影响
[0136]
1.实验安排
[0137]
供试植物：烤烟云87
[0138]
在凉山州会东烟区收割完接种放线菌scaut001光叶紫花苕子后，在试验点继续种植烤烟，施肥量按正常水平减施10％。会东烟区烤烟种植正常施肥量：烟草专用复合肥30kg/亩 (n:p2o5:k2o为2：3：5)，商品有机肥50kg/亩，油枯20kg/亩。根据《yc/t 142-2010烟草农艺性状调查测量方法》于烤烟成熟期(烟苗移栽后70d)选取长势均匀一致且具代表性的5株烟株分别测定烤烟株高、茎围、有效叶片数等农艺性状，测定烤烟根系结构、活力及烤烟干物质含量。烤烟根系结构采用epson1680根系扫描仪(epson，longbeach，usa) 对各组样品根系进行扫描，扫描完成后，用winrhizo2005a根系分析软件进行分析，获得根系总根长度、总表面积、总体积和总根毛数等形态指标。烤烟根、茎、叶分别在105℃杀青 20min，75℃烘干至恒重后测定生物量。
[0139]
2.实验结果
[0140]
接种放线菌scaut001的凉山光叶紫花苕子收割后，在试验点继续种植烤烟云烟87，对其成熟期烤烟农艺性状测定结果表明，前茬接种过根瘤菌的处理，后茬烤烟的株高、茎围、有效叶数、最大叶长、最大叶宽、最大叶面积较对照组分别增加了9.02％、12.91％、17.99％、 12.09％、13.69％、24.13％(表8)，干物质积累量较对照组增加了11.43％(表9)，总根长、总根面积、根平均直径、根体积、根毛数较对照组分别增加了11.77％、8.60％、12.35％、 14.37％、13.72％(表10)。综合实例4的研究结果，说明前茬种植凉山光叶紫花苕子并接种根瘤菌后提高了土壤中氮素和其他土壤养分含量，优化了土壤微生物群落结构，改善了后茬烤烟根系生长环境，增强了根系活力，促进了烤烟对养分的吸收利，从而带动烤烟的生长和物质的积累。因此，接种放线菌scaut001不仅增加了当季凉山光叶紫花苕子的产量，也通过改善土壤质量，促进了后茬作物烤烟的生长。
[0141]
表8对烤烟农艺性状的影响
[0142][0143]
注：同列不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上的差异显著
[0144]
表9对烤烟干物质积累的影响
[0145][0146]
注：同列不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上的差异显著
[0147]
表10对烤烟根系结构的影响
[0148][0149]
注：同列不同小写字母表示不同处理间在0.05水平上的差异显著。