一种低电导率低渗透压电穿孔缓冲液及应用的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，尤其是涉及一种低电导率低渗透压电穿孔缓冲液。


背景技术：

2.外泌体(exosomes)是一种直径在30-150nm之间的茶托型结构的小囊泡，包含rna、蛋白质、microrna、dna片段等多种成分。全部真核细胞和一些原核细胞均可分泌，主要分布在血液、唾液、尿液、羊水和母乳等多种体液中。它是由细胞质膜内陷形成早期的核内体，核内体内陷包裹物质形成多泡体，而后多泡体在与质膜融合后得以释放。正是外泌体的结构(磷脂双分子层和囊泡状结构)和生理特性，使它们具有很好的生物相容性。并且外泌体可以自由的穿过血脑屏障（bbb），低免疫原性和毒性使其可以很容易的被任何器官和组织中的细胞摄取，且不会引起机体的免疫反应，具有无毒、生物相容性好、组织和肿瘤靶向性和循环半衰期长等优点，是新型药物递送系统的理性候选者。
3.外泌体装载策略大致分两类：被动和主动装载。主动装载中使用最为广泛、稳定性好且具有放大潜力的是使用电穿孔仪装载的策略。电穿孔是利用瞬时电场使外泌体膜磷脂分子发生重排导致产生诸多的小孔，同时利用药物和外泌体在电场中向正极移动的速度不同使药物进入外泌体中，再利用磷脂膜的流动性使小孔恢复完成药物装载。现阶段，常用的电穿孔缓冲液是由英国牛津大学matthew j a wood 教授提供的：包含1.15mm磷酸二氢钾和25mm的碘化钾的21%(vol/vol, ph=7.2)碘克沙醇溶液。此电穿孔缓冲液配方的k

浓度为26.15 mm，属于高k

的缓冲液。正是钾离子浓度过高提升了整个溶液的电导率，极易在高电压的情况下对外泌体产生损伤，破坏了外泌体形态。另外钾离子的浓度过高导致缓冲液的渗透压高于外泌体中的渗透压，也不利于药物的进入。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供一种低电导率低渗透压电穿孔缓冲液及应用。
5.本发明采用的技术方案是：一种低电导率低渗透压电穿孔缓冲液，包括包括3-9mg/ml nacl或0.1-1mg/ml的kcl，10-40mg/ml 蔗糖，ph为1-2。
6.优选地，ph为2。
7.一种细胞外囊泡电穿孔处理方法，用低电导率低渗透压电穿孔缓冲液处理细胞外囊泡。
8.优选地，将细胞外囊泡分散在缓冲液中，37℃孵育后进行电穿孔。
9.优选地，电穿孔电压为100-250v，电穿孔脉冲时程为3000-5000us。
10.优选地，电穿孔电压为150v，电穿孔脉冲时程为4000us。
11.优选地，孵育时长1h。
12.优选地，所述细胞外囊泡为外泌体。
13.细胞外囊泡电穿孔处理方法在细胞外囊泡装载中的应用。
14.优选地，装载sirna。
15.本发明具有的优点和积极效果是：本发明提供一种低渗低电导率电穿孔缓冲液，由于其低渗、低电导率的性质，可以达到较高的电穿孔效率；经比较转染效率的试验证明，低渗低电导率缓冲液在用量相同情况下转染效率显著高于高钾离子的缓冲液；另外，本发明所公开的低渗低电导率电穿孔缓冲液，配置简便，价格低廉，转染效率显著高，易于推广；本发明同时提供一种能够提高细胞外囊泡电穿孔载药效率的电转条件，使用此条件制备的载药外泌体性质未发生明显改变：形态完整、粒径、颗粒数和表面标志物无明显变化，但装载效率要明显更高。
附图说明
16.图1si-egfp pc-cy3功能验证；其中a图为gfp/293t细胞的流式检测；b图为gfp/293t细胞转染si
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egfp pc-cy3后的流式细胞检测；c图为gfp mrna的表达检测；图2 si-egfp pc-cy3定量方法的建立；图3牛奶外泌体鉴定；其中a图为牛奶外泌体的形态学表征；b图为牛奶外泌体的粒径分布检测；c图为牛奶外泌体的纯度检测；图4不同电穿孔电压对外泌体装载si-egfp pc-cy3的装载效率的影响；图5不同电穿孔脉冲时程对外泌体装载si-egfp pc-cy3的装载效率影响；图6不同孵育温度对外泌体装载si-egfp pc-cy3的装载效率影响；图7不同孵育时间对外泌体装载si-egfp pc-cy3的装载效率影响；图8不同电穿孔缓冲液的ph值对外泌体装载si-egfp pc-cy3装载效率的影响；图9电穿孔后外泌体表征；其中a图为载si-egfp pc-cy3牛奶外泌体的形态学表征；b图为载si-egfp pc-cy3牛奶外泌体的阳性率检测；图10外泌体载si-egfp pc-cy3功能验证：其中a图为gfp/293t细胞对外泌体载si-egfp pc-cy3的摄入；其中b图为gfp mrna的表达检测。
具体实施方式
17.下面结合具体实施例对本发明做出进一步说明。
18.本发明公开一种低电导率低渗透压电穿孔缓冲液，能够用于电穿孔过程。缓冲液包括3-9mg/ml nacl，10-40 mg/ml 蔗糖，调其ph为1-2；或者，缓冲液可由0.1-1mg/ml的kcl和10-40mg/ml 蔗糖组成，调其ph为1-2。在细胞外囊泡电穿孔处理方法中，可用低电导率低渗透压电穿孔缓冲液处理细胞外囊泡，作用于细胞外囊泡外膜，从而提高其电穿孔效率。具体为将细胞外囊泡分散在缓冲液中，37℃孵育后进行电穿孔，优选孵育1h；电穿孔条件为：电压为100-250v，脉冲时程为3000-5000us；其中电压优选为150v，脉冲时程优选为4000us。
19.小干扰rna (small interfering rna, sirna)也称为短干扰rna或沉默rna，是一类双链rna分子，长度为20-25个碱基，类似于mirna，常用作于细胞内降低靶mrna的含量。外源sirna进入到细胞质后，在 dicer 的帮助下与 ago2 等结合，构成 sirna 诱导沉默复合体(sirna-induced silencing complex，sirisc)，sirisc 中的 sirna 经 ago2 作用分解成两条单链，正义链被释放出去，反义链则留在 sirisc 中。仅含反义链的 sirisc 被激活，在反义链的引导下通过碱基互补配对原则与靶基因mrna结合，进而诱导靶基因的沉默。沉默发生后，靶基因被释放，使得 sirisc 能与另一个靶基因结合，开始诱导新一轮的基因
沉默。
20.但是外源sirna作为药物本身有诸多局限性。一是尺寸，sirna 的长度约为 7-8nm，直径约为 2-3nm，加之呈现净负电导致sirna无法穿过细胞膜。但又小到足以被肾小球自由清除，因为很容易被过滤到尿液中，排出体外。二是稳定性：sirna血液中循环时，血清中的蛋白吸附和内源性的 rnase a的降解使得sirna作为药物的另一个急需解决的问题。所以，安全有效的将外源性sirna递送到细胞质中是sirna药物开发中的重中之重。
21.本发明还公开一种牛奶外泌体载sirna药物的制备方法，通过上述缓冲液和电转条件，可以提高牛奶外泌体对sirna药物装载的装载效率的方法，并且规避了外泌体载药策略中导致膜破裂和载药量低等问题。外泌体作为sirna药物载体，其低免疫原性和毒性使其可以很容易的被任何器官和组织中的细胞摄取，且不会引起机体的免疫反应，具有无毒、生物相容性好、组织和肿瘤靶向性和循环半衰期长等优点。可以很好的保护sirna免受降解和清除，提高了体内循环时间和体内稳定性。在电穿孔装载外泌体过程中，没有破坏sirna的结构，sirna没有结团或者发生降解的想象发生，同时此外泌体的可以很好的发挥sirna递送载体的功能，可以有效的降低目的mrna的表达。
22.本发明某些实施例中，细胞外囊泡为外泌体，外泌体为牛奶来源，可大规模生产，且不受奶源的影响。牛奶外泌体中牛源的核酸残留量低，性质稳定可耐酸、耐胃蛋白酶、不会引起机体的免疫反应，并且牛奶外泌体极易被肠道吸收。
23.下面以外泌体装载sirna为例，对本发明方案做出说明，其中，未具体说明操作步骤的实验方法，均按照相应商品说明书进行，实施例中所用到的仪器、试剂、耗材如无特殊说明，均可从商业公司购买得到。
24.实施例1：缓冲液的制备取600mgnacl、2.05g蔗糖充分溶解于100ml纯水中，调整ph为2，滤器过滤除菌，即得。
25.本发明制备得到的缓冲液在成本上具有明显优势，市售碘克沙醇溶液的价格较高，折合100ml电穿孔的价值为300元左右，而本实施例的低渗低电导率缓冲液的价值不足1元。
26.实施例2：si-egfp pc-cy3功能验证在进行sirna药物装载前要对sirna进行筛选，选择能对gfp mrna有敲降作用的sirna。本实施例中最终筛选得到的是广州市锐博生物科技有限公司的egfp阳性sirna(si-egfp pc)。为了方便检测，对si-egfp pc进行端位红色荧光修饰(si-egfp pc-cy3)。
27.考察si-egfp pc-cy3抗egfp的效果，具体方法如下：取对数生长期的gfp/293t细胞，接种于24孔培养板(30000个细胞/孔)。放入在37℃细胞培养箱中恒温培养24h后，使用lipofectamine3000对gfp/293t细胞进行转染si-egfp pc-cy3，具体步骤可参照lipofectamine3000使用说明。放入在37℃细胞培养箱中恒温培养48h后，使用胰酶消化并分成两部分，一部分进行流式细胞仪检测，另外一部分细胞提取mrna、反转录和qpcr检测gfp mrna含量。流式细胞仪检测结果所示：在通过lipofectamine3000转染细胞gfp/293t细胞48h后，细胞呈现98%的双阳性(图1中a图、图1中b图)。qpcr结果显示：si-egfp pc-cy3在转染48h后，可以明显的降低gfp/293t细胞中egfp的mrna的含量(降低至50%)(图1中c图)。
28.实施例3：sirna定量方法的建立
建立sirna的定量方法是对外泌体装载si-egfp pc-cy3的装载效率评价前提。本实施例中使用的茎环法对si-egfp pc-cy3进行定量的茎环引物、反转和qpcr，试剂盒(c10211-2)均采购于瑞博公司。
29.具体做法如下：反转录：取3.5ulsi-egfp pc-cy3(20um) 与1ul茎环引物、2ul 5x反转buffer、2ul 5x反转酶混合，加rnase-free h2o补充至10ul，瞬时离心，反转条件：42℃ 60min，70℃ 10min。
30.qpcr：将上述反转产物按照10倍梯度依次稀释直至单位体积内拷贝数为个位数。分别将每个稀释梯度的反转产物按照如下步骤和qpcr程序进行操作，表1 qpcr反应体系(冰上制备)表2 qpcr反应程序结果如图2显示：引物有很高的专属性，并且扩增效率在90-105%之间，定量下限为842，在梯度稀释时整体线性较好。
31.实施例4：牛奶外泌体制备与表征将新鲜牛奶通过酸沉、离心、层析方法分离牛奶外泌体，并通过观察外泌体的形态和检测纯度来对此方法分离的外泌体进行评估。而后，使用nta分析粒径和颗粒数。如图3所示，通过tem和高效液相色谱的结果可知，牛奶外泌体有标准的外泌体茶托状结构，纯度为97.85%。
32.另外，作为sirna药物递送载体，应保证最低的宿主残留，包括：宿主蛋白和宿主核酸残留。通过上述方法制备的牛奶外泌体中的宿主核酸残留极低。通过elisa方法可以对上述方法制备的牛奶外泌体中宿主蛋白残留进行检测，结果如表3所示，其中1-3号样本为不同批次从牛奶中提取得到的外泌体样本，4号样本为鲜牛奶；
表3 牛奶外泌体中牛奶的宿主蛋白残留检测实施例5：不同电穿孔缓冲液ph值对外泌体装载sirna的装载量的影响为了增加外泌体对si-egfp pc-cy3的装载量，本实施例中考察了电穿孔装载中缓冲液ph对装载量的影响。
33.如实施例1方法制备缓冲液，通过hcl对缓冲液的ph值进行调节，分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12。采用缓冲液重悬外泌体，37℃孵育1h；电转条件为：电穿孔电压为150v，电穿孔时程为4000us。
34.结果如图8所示，当电穿孔所用的缓冲液ph值为2时，si-egfp pc-cy3的装载量最多。
35.后续实施例均采用ph值为2的电穿孔条件。
36.实施例6：不同电穿孔电压对外泌体装载sirna的装载量的影响为了增加外泌体对si-egfp pc-cy3的装载量，本实施例中考察了不同电穿孔电压对装载量的影响。电转方法如实施例5，条件设置如下：电穿孔电压分别为50v、100v、150v、200v、250v、300v、350v，电穿孔时程为2000us，电穿孔缓冲液为实施例1制备所得。
37.结果如图4所示，当电穿孔电压为150v时，si-egfp pc-cy3的装载量最多。
38.实施例7：不同电穿孔时程对外泌体装载sirna的装载量的影响为了增加外泌体对si-egfp pc-cy3的装载量，本实施例中考察了不同电穿孔时程对装载量的影响。电转方法如实施例5，条件设置如下：电穿孔时程为1000us、2000us、3000us、4000us、5000us、6000us，电穿孔电压为150v，电穿孔缓冲液为实施例1制备所得。
39.结果如图5所示，电穿孔电压为150v，当电穿孔时程为4000us时si-egfp pc-cy3的装载量最多。
40.实施例8：不同孵育温度对外泌体装载sirna的装载量的影响为了增加外泌体对si-egfp pc-cy3的装载量，本实施例中考察了电穿孔装载后的孵育温度对装载量的影响。电转方法如实施例5，条件设置如下：孵育温度为24、37、42℃，孵育时间为30min，电穿孔电压为150v，电穿孔时程为4000us，电穿孔缓冲液为实施例1制备所得。
41.结果如图6所示，孵育温度为42℃时si-egfp pc-cy3的装载量最多，比孵育温度37℃时的装载量仅高5%，由于孵育温度设置为37℃可以有利于提高外泌体和si-egfp pc-cy3的稳定性，综合考虑，其他验证实施例中依然设置为37℃。
42.实施例9：不同孵育时间对外泌体装载sirna的装载量的影响；为了增加外泌体对si-egfp pc-cy3的装载量，本实施例中考察了电穿孔装载后的
孵育时间对装载量的影响。电转方法如实施例5，条件设置如下：孵育温度为37℃，孵育时间设置为30、60、120min，电穿孔电压为150v，电穿孔时程为4000us，电穿孔缓冲液为实施例1制备所得。
43.结果如图7所示，孵育时间为60min时si-egfp pc-cy3的装载量最多。
44.实施例10：电穿孔后牛奶外泌体表征如实施例1方法制备缓冲液，通过hcl调节缓冲液的ph值为2。采用缓冲液重悬外泌体，37℃孵育1h；电转条件为：电穿孔电压为150v，电穿孔时程为4000us，对si-egfp pc-cy3进行装载。
45.通过透射电子显微镜观察载si-egfp pc-cy3外泌体的形态。而后，使用纳米流式检测电穿孔装载后的外泌体中si-egfp pc-cy3所占的比例。如图9所示，通过tem结果可知，牛奶外泌体电穿孔后没有改变其原始的外泌体茶托状结构，而有si-egfp pc-cy3信号的外泌体占总体的60%（图9）。
46.通过对载si-egfp pc-cy3外泌体进行si-egfp pc-cy3抽提、反转、qpcr之后，并结合si-egfp pc-cy3的标准曲线和包封率的公式计算包封率，公式如下：包封率(%)=w1/w0其中，w1为外泌体载si-egfp pc-cy3的量，w0为投入si-egfp pc-cy3的量。
47.通过计算可得：通过本专利的方法获得的载si-egfp pc-cy3外泌体的包封率为30%。
48.实施例11：外泌体载si-egfp pc-cy3功能验证考察外泌体载si-egfp pc-cy3抗egfp的效果，具体方法如下：取对数生长期的gfp/293t细胞，接种于24孔培养板(30000个细胞/孔)。放入在37℃细胞培养箱中恒温培养24h后，将载si-egfp pc-cy3牛奶外泌体加入到细胞中，使用lipofectamine3000对gfp/293t细胞进行转染si-egfp pc-cy3作为阳性对照。放入在37℃细胞培养箱中恒温培养48h后，使用胰酶消化并分成两部分，一部分进行流式细胞仪检测，另外一部分细胞提取mrna、反转录和qpcr检测gfp mrna含量。流式细胞仪检测结果所示：加入载si-egfp pc-cy3牛奶外泌体48h后，细胞呈现98.5%的双阳性（图10）。qpcr结果显示：加入载si-egfp pc-cy3牛奶外泌体48h后，可以明显的降低gfp/293t细胞中egfp的mrna的含量（图10）。
49.以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。