用于鉴定三七或含三七制品的引物对、探针及方法与流程

1.本发明涉及中药材鉴定技术领域，具体涉及一种用于鉴定三七或含三七制品的引物对、探针及方法。


背景技术：

2.三七作为我国名贵的中药材，素有“南国神草”之称，是我国最早的药食同源植物之一。随着对三七成分和药理研究的深入，其在药用方面的价值日益凸显。
3.分子鉴定技术逐渐成为中药鉴定的主要手段，与传统鉴定方法相比，中药分子鉴定技术有其独特的优势。目前，三七的分子鉴定方法的开发主要是普通pcr方法，需要pcr仪和电泳仪等设备进行实验，耗时较长，并且易出现假阳性的现象。实时荧光pcr将pcr扩增反应与结果检测相结合，实现了全程在封闭的状态下进行扩增和产物的分析，减少了pcr后续处理，降低了pcr扩增产物污染的概率，提高了特异性，还避免了电泳时染料对人体的危害。
4.在三七鉴定方面，现有的基于pcr的分子鉴定方法和dna条形码技术均有不足，实现快速准确的鉴定体系还有待进一步的研究，三七鉴定检测技术还需要更多的研究和实践探索，才能达到更理想的结果。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种用于鉴定三七或含三七制品的引物对、探针及方法。
6.本发明所提供的用于鉴定三七或含三七制品的特异性引物对包括序列表中序列1所示的正向引物和序列表中序列2所示的反向引物；
7.序列1：5
’‑
cgacatgagaagagggctttta-3’；
8.序列2：5
’‑
atcattccctcgcgggagtc-3’。
9.本发明所提供的用于鉴定三七或含三七制品的探针为所述探针为5’端标记有荧光基团且3’端标记有猝灭基团的序列表中序列3所示的核酸分子；
10.序列表中的序列3：5
’‑
caaccaccacttgtcgtgac-3’。
11.其中，所述荧光基团为fam，所述猝灭基团为mgb。
12.本发明所提供的用于鉴定三七或含三七制品的方法，包括使用上述的引物对和探针进行实时荧光pcr以鉴定三七或含三七制品。
13.其中，当实时荧光pcr反应结果有荧光信号且有指数型增长的荧光扩增曲线，并且ct值小于等于30.0时，则判定为三七或含有三七成分。
14.其中，当实时荧光pcr反应结果没有荧光信号且没有指数型增长的荧光扩增曲线，则判定为不是三七或不含三七成分。
15.本发明将实时荧光pcr检测技术应用在三七鉴定中，并找到特异性强的引物来实现简单、快速、准确鉴定三七或含三七制品的方法，弥补了现有三七鉴定技术的不足。
附图说明
16.图1实时荧光pcr引物和探针筛选结果；
17.其中，图1a为第1对引物对和探针1实时荧光pcr扩增曲线，图1b为第2对引物对和探针1实时荧光pcr扩增曲线，图1c为第3对引物对和探针1实时荧光pcr扩增曲线，图1d为第4对引物对和探针1实时荧光pcr扩增曲线；图1e为第1对引物对和探针2实时荧光pcr扩增曲线，图1f为第2对引物对和探针2实时荧光pcr扩增曲线，图1g为第3对引物对和探针2实时荧光pcr扩增曲线，图1h为第4对引物对和探针2实时荧光pcr扩增曲线。
18.图2实时荧光pcr特异性实验扩增曲线。
19.图3实时荧光pcr灵敏度实验扩增曲线。
20.图4市售样品实时荧光pcr扩增曲线。
具体实施方式
21.下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
22.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
23.实施例1
24.实时荧光pcr引物对和探针筛选
25.在ncbi中检索三七、人参、西洋参的its2序列，运用blast进行比对，找到特异性位点its2序列(序列表中序列4所示)，its2序列作为植物类中药材鉴定的常用dna序列，具有种间变异，种内保守的特点，适合用于三七的鉴定。经primer express 5.0设计引物对和探针，并通过引入错配碱基优化引物，共设计了4对引物和两条探针，其中，第2对、第3对、第4对引物对的上游引物3’端引入错配，即第2对引物de上游引物3’端第三个碱基t替换成碱基c、第3对引物的上游引物3’端第三个碱基t替换成碱基g、第4对引物的上游引物3’端第三个碱基t替换成碱基a。并使用primer-blast进行评估。
26.4对引物和两条探针如下：
27.第1对its2-1f：5
’‑
cgacatgagaagagggctttta-3’；
28.its2-r：5
’‑
atcattccctcgcgggagtc-3’；
29.第2对its2-2f：5
’‑
cgacatgagaagagggctctta-3’；
30.its2-r：5
’‑
atcattccctcgcgggagtc-3’；
31.第3对its2-3f：5
’‑
cgacatgagaagagggctgtta-3’；
32.its2-r：5
’‑
atcattccctcgcgggagtc-3’；
33.第4对its2-3f：5
’‑
cgacatgagaagagggctatta-3’；
34.its2-r：5
’‑
atcattccctcgcgggagtc-3’；
35.探针1：5
’‑
fam-caaccaccacttgtcgtgac-mgb-3’；
36.探针2：5
’‑
fam-aaccaccacttgtcgtgac-mgb-3’。
37.选取三七及人参、西洋参、竹节参，采用改良ctab法(在改良ctab法中，ctab缓冲液含有2％聚乙烯吡咯烷酮pvp)提取dna，并采用以下反应体系和反应条件进行实时荧光pcr
反应，从而筛选引物对和探针。
38.实时荧光pcr反应体系，共20μl：
[0039][0040][0041]
其中，2
×
taq pro hs universal probe master mix购自南京诺唯赞公司，lightcycler480购自罗氏。
[0042]
实时荧光pcr反应条件：95℃预变性30s；95℃变性10s，59℃退火30s，35个循环。
[0043]
结果如图1所示，a、b、c、d分别代表第1对、第2对、第3对、第4对引物和探针1的荧光pcr扩增结果；e、f、g、h分别代表第1对、第2对、第3对、第4对引物和探针2的荧光pcr扩增结果。其中，通过对4套引物对和探针1的组合进行筛选，引入错配碱基的第2对、第3对、第4对引物和探针1与未引入错配的第1对引物和探针1的实时荧光pcr特异性试验的扩增曲线的指数增长期和阴性起峰ct值等没有较大差异(图1中a、b、c、d)，引入错配对结果的影响很小。通过将4套引物对和探针2的荧光pcr扩增结果(图1中e、f、g、h)与4套引物对和探针1的结果进行比较发现，前者相对荧光值较低，因此最终确定用第1对引物和探针1进行后续实验。
[0044]
最终确定用于鉴定三七或含三七制品的特异性引物和探针如下：
[0045]
正向引物：5
’‑
cgacatgagaagagggctttta-3’；
[0046]
反向引物：5
’‑
atcattccctcgcgggagtc-3’；
[0047]
探针为：5
’‑
fam-caaccaccacttgtcgtgac-mgb-3’。
[0048]
实时荧光pcr方法特异性验证
[0049]
选取三七及人参、西洋参、竹节参、珠子参、菊三七、白芨、莪术、姜黄共8种中药材，采用上述改良ctab法提取基因组dna，并时使用上述的反应体系和反应条件进行实时荧光pcr反应。
[0050]
实验结果如图2所示，只有三七有着明显的扩增曲线，ct值为18，小于30。空白对照无“s”型扩增曲线。阴性对照中人参、西洋参、珠子参无明显扩增曲线，ct分别为30、31、31，均大于30；竹节参、菊三七、莪术、白芨、姜黄无对数扩增曲线。
[0051]
基于上述结果，当实时荧光pcr反应结果有荧光信号且有指数型增长的荧光扩增曲线，并且ct值≤30.0时，则判定为三七或含有三七成分。当上述结果没有荧光信号及指数型增长的荧光扩增曲线，则判定为不是三七或不含三七成分。当30.0＜ct值≤35.0时，重复所述方法，如果ct值≤30.0时，则判定为三七或含有三七成分；如果ct值仍为30.0＜ct值≤35.0时，则判定结果为不是三七或不含有三七成分。
[0052]
实时荧光pcr方法灵敏度验证
[0053]
将上述提取三七的基因组dna到10ng/μl，并进行10倍梯度稀释，梯度浓度分别为：
1ng/μl、0.1ng/μl、0.01ng/μl，其中，10ng/μl和1ng/μl做两个平行实验，0.1ng/μl和0.01ng/μl做三个平行实验，采用上述的实时荧光pcr反应体系和条件进行扩增，验证本发明建立的实时荧光pcr方法的灵敏度。
[0054]
实验结果如图3所示，4个浓度的三七基因组dna平行之间均稳定检出，灵敏度可达0.01ng/μl。
[0055]
实时荧光pcr方法检测市售样品
[0056]
对31种市售样品(包括三七粉、三七压片和三七花)采用上述的实时荧光pcr反应体系和条件进行扩增，验证方法的实用性。
[0057]
市售样品信息及检测结果见表1。
[0058]
表1
[0059]
[0060][0061]
荧光pcr扩增实验结果如图4所示，可以实现对市售样品的检测，31种市售样品有指数型增长的荧光扩增曲线，且ct值≤30.0，判定为三七或含三七制品。
[0062]
本发明不局限于上述实例，根据本发明做出的变动和修改，均在本发明所要求的保护的范围内。