一种发酵产布雷费尔德菌素A的正青霉菌株及其应用的制作方法

brefeldianum fim
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e
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un88
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26，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院院实验大楼5楼，保藏编号为gdmcc no.61807，保藏日期为2021年7月14日。
9.本发明还公开了所述正青霉菌株在发酵生产布雷费尔德菌素a中的应用。
10.本发明还公开了一种发酵生产布雷费尔德菌素a的方法，即包括将所述正青霉菌株接种于适宜的发酵培养基中进行发酵培养的步骤。
11.具体的，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2
‑
4wt％、黄豆粉1
‑
3wt％、葡萄糖1
‑
3wt％、蛋白胨0.1
‑
0.5wt％、酵母膏0.2
‑
1.0wt％、kh2po
4 0.05
‑
0.8wt％、mgso4.7h2o 0.01
‑
0.12wt％、吐温80 0.02
‑
0.15wt％、碳酸钙0.05
‑
0.1wt％，ph6.0
‑
7.2。
12.优选的，所述发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉3wt％、黄豆粉2wt％、葡萄糖2wt％、蛋白胨0.2wt％、酵母膏0.5wt％、kh2po40.2wt％、mgso4.7h2o 0.04wt％、吐温80 0.05wt％、碳酸钙0.1wt％、ph6.5。
13.具体的，所述发酵培养步骤的条件包括：控制转速100
‑
250rpm，于24
‑
30℃进行发酵培养68
‑
120h。
14.具体的，所述发酵生产布雷费尔德菌素a的方法，还包括将所述正青霉菌株接种于种子培养基中进行种子液培养的步骤；
15.所述种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉2
‑
4wt％、黄豆粉1
‑
3wt％、葡萄糖1
‑
3wt％、蛋白胨0.1
‑
0.5wt％、酵母膏0.2
‑
1.0wt％、kh2po
4 0.1
‑
0.8wt％、mgso4.7h2o 0.01
‑
0.12wt％、吐温80 0.02
‑
0.15wt％，ph6.2
‑
7.0。
16.优选的，所述种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉3wt％、黄豆粉2wt％、葡萄糖2wt％、蛋白胨0.2wt％、酵母膏0.5wt％、kh2po
4 0.2wt％、mgso4.7h2o 0.04wt％、吐温80 0.05wt％、ph6.5。
17.具体的，所述种子液培养步骤的条件包括：控制转速100
‑
250rpm，于24
‑
30℃进行种子液培养32
‑
48h。
18.具体的，所述发酵生产布雷费尔德菌素a的方法，还包括将所述正青霉菌株接种于斜面培养基中进行活化的步骤；
19.所述斜面培养基为包括如下质量含量的组分：马铃薯15
‑
25wt％、葡萄糖1
‑
3wt％、琼脂2.0wt％，ph自然。
20.优选的，所述斜面培养基为pda培养基，包括如下质量含量的组分：马铃薯20wt％、葡萄糖2wt％、琼脂2.0wt％，ph自然。
21.具体的，所述斜面培养基活化步骤的条件包括：于24
‑
30℃进行恒温培养8
‑
12d。
22.本发明通过常压室温等离子体诱变技术筛选得到一株高产布雷费尔德菌素a的正青霉菌fim
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e
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26(penicillium brefeldianum)，其能够发酵高产布雷费尔德菌素a。在发酵实验中，所述正青霉菌fim
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26发酵产布雷费尔德菌素a的效价高达2152μg/ml，大幅度提高了布雷费尔德菌素a的产量，且发酵周期缩短至72h，更加适宜于工业化发酵生产；且本发明筛选的菌株fim
‑
e
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26稳定性良好，连续传代五代其产布雷费尔德菌素a效价基本稳定，维持在同一较高水平，能够作为进一步研究和开发的生产菌株。
附图说明
23.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
24.图1为诱变实验中artp射流时间与致死率的关系曲线；
25.图2本发明所述菌株fim
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e
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26的进化树。
具体实施方式
26.本发明下述实施例中，涉及的培养基包括：
27.分离平板培养基及斜面培养基包括如下质量含量的组分：马铃薯20％、葡萄糖2％、琼脂2.0％、余量为蒸馏水补足，ph自然，121℃高压蒸汽灭菌20min；
28.种子培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉3％、黄豆粉2％、葡萄糖2％、蛋白胨0.2％、酵母膏0.5％、kh2po
4 0.2％、mgso4.7h2o 0.04％、吐温80 0.05％、ph6.5，121℃高压蒸汽灭菌30min；
29.发酵培养基包括如下质量含量的组分：可溶性淀粉3％、黄豆粉2％、葡萄糖2％、蛋白胨0.2％、酵母膏0.5％、kh2po
4 0.2％、mgso4.7h2o 0.04％、吐温80 0.05％、碳酸钙0.1％、ph6.5，121℃高压蒸汽灭菌30min。
30.本发明下述实施例中，所述布雷费尔德菌素a含量的检测采用高效液相色谱法，其方法：取2ml发酵液离心，用等体积的甲醇萃取2次，合并上清液和萃取液，过有机滤膜后获发酵初提液，取10μl进行hplc检测。色谱条件：c18(4.6mm
×
250mm,5μm)色谱柱，检测波长230nm，以甲醇：水＝57：43(v/v)为流动相，流速1.0ml/min，柱温：30℃。以布雷费尔德菌素a标准品为对照品，根据样品峰面积/标准液峰面积
×
标准液浓度
×
稀释倍数计算效价，发酵效价取3次平均值。
31.实施例1诱变菌株fim
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e
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26的获得
32.以保存的遗传性状相对稳定的正青霉菌e
‑
un88菌株为出发菌株，并将该菌株转接至斜面培养基上，并于恒温培养箱中培养8
‑
12d，且培养温度为26℃；之后用生理盐水洗下斜面培养基上的孢子，玻璃珠打散，经纱布过滤，制成106个/ml的孢子悬液。
33.用移液枪吸取10μl上述制得的孢子悬液于直径为1cm的圆形铁片上，置于以氦气作为工作气体、电源功率为110w、工作气流量10l/min的常压室温等离子体诱变系统中，且处理距离为2mm，分别处理10s、15s、30s、40s、50s、60s、70s，将处理后的孢子悬液进行梯度稀释涂平板，制作致死率曲线(如图1所示)。从图1中可以看出，诱变处理剂量与菌株e
‑
un88菌株致死率之间存在明显的剂量效应关系，随着处理时间的延长，致死率逐渐升高。
34.根据上述致死率曲线，选择15s、40s、60s三个不同致死剂量的照射时间，对菌株e
‑
un88的孢子悬液进行等离子体诱变；并将前述三个不同处理时间的孢子悬液混合于装有生理盐水的试管中，混合均匀，得诱变孢子悬液，备用。
35.将上述所得诱变孢子悬液进行梯度稀释，控制稀释度分别为10
‑1、10
‑2、10
‑3、10
‑4、10
‑5、10
‑6，选取10
‑4、10
‑5、10
‑6三个稀释度的孢子悬液，分别涂布于分离平板培养基上，于28℃避光培养8
‑
12d。
36.将各个分离平板上长出的单菌落转接斜面培养基上28℃培养10天后，以约0.5cm*0.5cm菌苔接种于种子培养基中，于26℃、220r/min条件下培养36
‑
48h后得种子液；以5％的
接种量将种子液接种于发酵培养基中，于26℃、230r/min条件下培养72
‑
120h，得发酵液。
37.取所得发酵液适量，加入等体积的甲醇萃取2次，合并上清液和萃取液，过有机滤膜后获发酵初提液，利用高效液相色谱法测定布雷费尔德菌素a的产量，并确定本实施例发酵液中产物的结构正确。
38.通过此方法即筛选出产布雷费尔德菌素a量最大的菌株，为了方便描述，将筛选所得的菌株命名为菌株fim
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26，且菌株fim
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e
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26于甘油中保存。
39.实施例2菌株fim
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e
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‑
26的鉴定
40.生理生化特性鉴定
41.将获得的菌株fim
‑
e
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un88
‑
26在分离培养基平板上划线涂菌并插入盖玻片，28℃培养7
‑
20d，用光学显微镜、透射和扫描电子显微镜观察单菌落的形态特征及其菌丝。
42.得到该菌株fim
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e
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un88
‑
26的主要形态及生理生化特性如下：平板上菌落圆形，白色，表面绒毛状，不产可溶色性素，成熟时后菌落呈现放射性皱褶，中心略微隆起，背面为土黄色，镜下观察发现，分生孢子梗有横隔，顶端无膨大的顶囊，小梗顶端分生孢子成串状，分生孢子近球形。此菌株fim
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e
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un88
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26为高耗氧菌，最适生长温度为24
‑
30℃，最适生长ph为5.5
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7.5；在摇床转速为210
‑
280r/min，培养3
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5d时，布雷费尔德菌素a产量最高，发酵过程中溶氧对布雷费尔德菌素a的产生具有显著作用。
43.分子生物学鉴定
44.对菌株fim
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e
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26的its序列进行测序，并将所测的菌株的its序列与genbank数据库中已有序列进行比对，及进行同源性分析；在lpsn(http://www.bacterio.cict.fr)网站上选取相应的模式株its基因序列，系统进化分析用clustal
‑
x软件进行比对，生成的比对文件用mega软件邻接法进行系统进化分析，拓扑分析为1000次重复取样的结果；通过its序列分析表明，菌株fim
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e
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26与布雷正青霉菌(penicillium brefeldianum)的序列同源性为99.12％。
45.综合上述形态、生理生化特征与分子生物学鉴定，最终确定菌株fim
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e
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26为正青霉菌(penicilliumbrefeldianum)菌属，其分类命名为正青霉菌(penicillium brefeldianum)fim
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un88
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26，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址为广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为gdmcc no.61807，保藏日期为2021年07月14日。
46.实施例3菌株fim
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e
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un88
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26的遗传稳定性验证
47.将上述筛选的高产布雷费尔德菌素a的菌株fim
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26连续培养传代(f1、f2、f3、f4、f5、f6)，经500ml摇瓶发酵后测定发酵效价，以生长良好的原代菌株(f0)为对照，结果见如表1。
48.表1传代对菌株fim
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26产布雷费尔德菌素a的影响
49.菌株代数f0f1f2f3f4f5f6相对效价(％)100100.2100.499.398.897.093.3
50.由上表1可知，本发明筛选的菌株fim
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26传五代发酵水平无明显影响，其产布雷费尔德菌素a效价基本稳定，维持在同一较高水平，从而表明菌株fim
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26具有较好的遗传稳定特性。
51.实施例4出发菌株e
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un88发酵布雷费尔德菌素a
52.菌株e
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un88的活化：将采用甘油保存的菌株e
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un88转接至斜面培养基上，并于恒温培养箱中培养8
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12d，且培养温度为28℃。
53.制备e
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un88种子液：将上述菌株e
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un88活化所得的单菌落接种于种子培养基(500ml三角瓶内装50ml种子培养基)中，于26℃、250r/min条件下培养36h，得种子液。
54.发酵培养：将制得的种子液以5％(v/v)接种量接种于发酵培养基(500ml三角瓶内装100ml发酵培养基)中，于26℃、250r/min条件下发酵培养96h，之后将所得发酵液进行检测。
55.检测结果显示，三批摇瓶发酵布雷费尔德菌素a的产量分别为751μg/ml、733μg/ml及710μg/ml；进一步测定其发酵液中，布雷费尔德菌素a纯度分别达到65.0％、66.1％、67.8％。
56.实施例5诱变菌株fim
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e
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26发酵布雷费尔德菌素a
57.菌株fim
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e
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26的活化：将采用甘油保存的菌株fim
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e
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un88
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26转接至斜面培养基上，并于恒温培养箱中培养8
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12d，且培养温度为28℃。
58.制备fim
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e
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26种子液：将上述菌株fim
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e
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26活化所得的约0.5cm*0.5cm菌苔接种于种子培养基(500ml三角瓶内装50ml种子培养基)中，于26℃、220r/min条件下培养36h，得种子液。
59.发酵培养：将制得的种子液以5％(v/v)接种量接种于发酵培养基(500ml三角瓶内装100ml发酵培养基)中，于26℃、230r/min条件下发酵培养96h，之后将所得发酵液进行检测。
60.检测结果显示，三批摇瓶发酵布雷费尔德菌素a的产量分别为1980μg/ml、2060μg/ml及2031μg/ml；进一步测定其发酵液中，布雷费尔德菌素a纯度分别达到85.0％、86.3％、87.2％。可见，本发明筛选菌株不仅可以高效发酵布雷费尔德菌素a，且发酵液中布雷费尔德菌素a纯度更优。
61.实施例6诱变菌株fim
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26发酵生产布雷费尔德菌素a
62.摇瓶种子培养：将上述菌株fim
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26菌苔接种于种子培养基(1000ml三角瓶内装200ml种子培养基)中，于26℃、200r/min条件下培养36h，得摇瓶种子液。
63.种子罐种子培养：将摇瓶种子液按0.5％量接种于种子培养基(100l罐内装60l种子培养基)中，于培养温度26℃、罐压0.05mpa、空气流量1：1vvm、搅拌速度为100
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200r/min条件下培养32h，得种子罐种子液。
64.发酵罐发酵培养：将制得的种子液以5％(v/v)接种量接种于发酵培养基(1吨罐内装700l发酵培养基)中，于培养温度26℃、罐压0.05mpa、空气流量1：0.8
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1.5vvm、搅拌速度为100
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250r/min，过程控制溶氧不低于20％，发酵培养72h，放罐将所得发酵液进行检测。
65.检测结果显示，三批发酵生产的布雷费尔德菌素a产量分别为2139μg/ml、2152μg/ml及2098μg/ml；进一步测定其发酵液中，布雷费尔德菌素a纯度分别为不低于86.0％、86.6％、86.1％，进一步证明，本发明筛选菌株不仅可以高效发酵布雷费尔德菌素a，且发酵液中布雷费尔德菌素a纯度更优。
66.综上，本发明筛选的菌株fim
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e
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26产布雷费尔德菌素a最高可达2152μg/ml，1吨罐发酵周期仅为72h，且发酵液中布雷费尔德菌素a纯度不低于85％，有效控制杂质含量，更利于布雷费尔德菌素a的下游提纯。
67.可见，本发明筛选的突变菌株正青霉菌fim
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e
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26(penicillium brefeldianum)能够作为进一步研究和开发的生产菌株。
68.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。