1.本发明属于生物医药
技术领域：
：，具体涉及一种条件控制的可剪接嵌合抗原受体分子及其编码核酸分子、载体、宿主细胞，和它们在治疗乏氧性疾病中的应用。
背景技术：
：：2.癌症免疫治疗涉及单克隆抗体、疫苗、基因治疗、细胞治疗等疗法，其中靶向肿瘤抗原的单克隆抗体、免疫检查点抑制剂、t细胞受体修饰t细胞(tcellreceptortcells，tcr-tcells)、嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptortcells，car-tcells)等免疫治疗方法在临床研究中显示出令人瞩目的抗肿瘤效果。然而，在细胞治疗方面，由于肿瘤特异性抗原缺乏而带来的脱靶效应往往可能造成致死性副作用(morganra,yangjc,kitanom,etal.casereportofaseriousadverseeventfollowingtheadministrationoftcellstransducedwithachimericantigenreceptorrecognizingerbb2[j].molther.2010,18:843-851)，从而大大限制了细胞治疗在实体瘤中的临床应用。因此，有必要进一步开发可调控的、具有时空特异性的细胞免疫治疗技术，方可降低对正常组织的损伤，提高对肿瘤病灶的治疗特异性。[0003]先前的研究报道了一种模块化的car设计，研究者将完整的car分子分成两个模块，分别是定位于细胞膜上的抗原识别模块，其用于识别肿瘤细胞表面的抗原；另外一个是胞内的信号传导模块。模块化car的激活基于两个条件，一是工程化t细胞要通过抗原识别模块识别肿瘤细胞表面的抗原，工程化t细胞结合到肿瘤细胞，但本身不能激活，只有在外界小分子化合物出现的时候，抗原识别模块和信号传导模块偶联方可传递激活信号，才能够杀伤肿瘤细胞(wucy,roybalkt,puchnerem,onufferj,limwa.remotecontroloftherapeutictcellsthroughasmallmolecule-gatedchimericreceptor[j].2science.2015,350(6258):aab4077)。然而，上述模块化car的激活严格依赖外界小分子化合物的添加，施加和停用外界小分子化合物的合适时机给临床应用提出了巨大的挑战。[0004]现代医学研究发现，缺氧与关节炎、糖尿病性视网膜病变、缺血性心脏病、中风等诸多疾病，特别是实体瘤密切相关。由于实体瘤内异常血管结构引起的供血不足以及肿瘤细胞的过度增殖，从而营造了一个相对缺氧的肿瘤微环境，肿瘤组织内的氧气水平常常低于2％(brownjm,wilsonwr.exploitingtumourhypoxiaincancertreatment[j].natrevcancer,2004,4:437–447)，所以缺氧是多种实体瘤的一个共有特征信号。因此，如何通过利用肿瘤微环境与正常组织微环境的差异，从而以此为影响因素严格控制模块化car的活化驱动，实现其在肿瘤治疗中的临床应用，可解决现有技术中依赖于外界施加小分子化合物驱动模块化car的活化造成的不便利和不精确的问题。技术实现要素：[0005]鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种条件控制的可剪接嵌合抗原受体(car)分子及其在实体瘤等乏氧性疾病的治疗，特别是在实体瘤的car-t细胞治疗中的应用。[0006]在本发明中，对部分术语的说明或定义如下：[0007]术语“可剪接的”是指蛋白质分子可以被剪切后重新接合。[0008]术语“抗原识别单元”是指能够特异性结合和识别靶抗原的蛋白质分子。[0009]术语“信号转导单元”是指能够传递信号的蛋白质分子。[0010]术语“抗原识别结构域”是指能够特异性识别靶抗原的功能域，通常包括单链抗体(single-chainfragmentvariable，scfv)、单域抗体(singledomainantibody，sdab)和受体的胞外端等。[0011]术语“跨膜结构域”是指蛋白质序列中跨越细胞膜的区域。[0012]术语“共刺激信号域”是指参与适应性免疫的免疫细胞表面所表达的不同共刺激分子及其配体相互结合而产生共刺激信号的结构域，通常为选自cd27、cd28、4-1bb、ox40和icos等共刺激分子的共刺激信号域。[0013]术语“n端剪接域”是指内含肽的n端结构域，可与c端剪接域进行剪接。[0014]术语“降解子”是指一段特定的氨基酸序列，其可被细胞内的蛋白酶识别，以介导目标蛋白的降解清除。[0015]术语“条件信号响应结构域”是指一段特定的氨基酸序列，其可以响应特定条件信号并调控目标蛋白的降解和富集，特定条件信号包括氧含量、光照和温度。[0016]术语“c端剪接域”是指内含肽的c端结构域，可与n端剪接域进行剪接。[0017]术语“信号传导结构域”是指含有多个免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif，itam)的t细胞受体的信号传导结构域，包括cd3γ，cd3δ，cd3ε和cd3ζ。[0018]术语“乏氧性疾病”是指组织氧含量低于1％的疾病，特别是实体肿瘤。[0019]本发明的目的是通过以下技术方案实现的：[0020]第一方面，本发明提供了一种条件控制的可剪接嵌合抗原受体分子，其包括抗原识别单元和信号转导单元，其中所述抗原识别单元包括抗原识别结构域、跨膜结构域、共刺激信号域、n端剪接域和降解子；所述信号转导单元包含条件信号响应结构域、c端剪接域和信号传导结构域。[0021]本发明提供的条件控制的可剪接嵌合抗原受体分子能够响应特定条件信号，例如缺氧，从而实现抗原识别单元和信号转导单元的剪接。其中，所述抗原识别单元可自发/诱发降解，减少在正常组织中的滞留，而所述信号传导单元可以响应特定条件信号，例如缺氧，并且具有在正常组织环境下低表达，而在肿瘤微环境下富集的特点。[0022]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，所述抗原识别结构域所结合的抗原可以选自cd47、axl、egfr、cd7、cd24、fap、cd147、her2、ror1、ror2、cd133、epha2、cd171、cea、epcam、tag72、il-13rα、egfrviii、gd2、frα、psca、psma、gpc3、caix、claudin18.2、vegfr2、pd-l1、msln、muc1、c-met、b7-h3或trop2抗原中的一种或多种。优选地，所述抗原识别结构域所结合的抗原为cd47抗原。[0023]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，所述跨膜结构域可以选自cd3ζ、cd4、cd8、cd28或cd137/4-1bb跨膜结构域中的一种或多种。优选地，所述跨膜结构域为cd28跨膜结构域。[0024]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，所述抗原识别单元中的共刺激结构域可以选自cd2、cd27、cd28、cd40、ox40、cd137/4-1bb、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、tlr11或dap10共刺激结构域中的一种或多种。优选地，所述抗原识别单元中的共刺激结构域选自cd28或cd137/4-1bb共刺激结构域中的一种或多种。[0025]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，所述n端剪接域可以选自蛋白质内含子或spytag/spycatcher自组装子中的一种或多种。优选地，所述n端剪接域为蛋白质内含子intn。[0026]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，所述降解子可以选自二氢叶酸还原酶(dhfr)、雌激素受体(er)、沙门氏菌iii型分泌系统效应蛋白(sope)、植物激素诱导蛋白降解子、不稳定域(ad)或光敏蛋白降解子中的一种或多种。优选地，所述降解子选自雌激素受体或沙门氏菌iii型分泌系统效应蛋白中的一种或多种。更优选地，所述降解子为突变型雌激素受体(erm)。[0027]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，所述条件信号响应结构域可以选自氧依赖降解结构域(odd)、温度敏感结构域、ph敏感结构域、光敏结构域或炎症因子响应结构域中的一种或多种。优选地，所述条件信号响应结构域为氧依赖降解结构域。[0028]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，所述c端剪接域可以选自蛋白质内含子或spytag/spycatcher自组装子中的一种或多种。优选地，所述c端剪接域为蛋白质内含子intc。[0029]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，所述信号传导结构域可以选自cd3ξ、fcγriii、fcεri、fc受体信号传导结构域或携带免疫受体酪氨酸活化基序(itam)信号传导分子中的一种或多种。优选地，所述信号传导结构域为cd3ξ信号传导结构域。[0030]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，优选地，所述信号转导单元还包含共刺激信号结构域。更优选地，所述信号转导单元中的共刺激信号结构域可以选自cd2、cd27、cd28、cd40、ox40、cd137/4-1bb、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、tlr11或dap10共刺激信号结构域中的一种或多种。[0031]根据本发明的一个优选实施方案，所述抗原识别单元的氨基酸序列如seqno：1或seqno：2所示。[0032]根据本发明的一个优选实施方案，所述信号转导单元的氨基酸序列如seqno：3所示。[0033]第二方面，本发明提供了一种编码上述根据本发明的嵌合抗原受体分子的核酸分子。[0034]在根据本发明的核酸分子中，优选地，编码所述信号转导单元的核苷酸序列还包含编码条件信号响应元件的核苷酸序列。优选地，所述条件信号响应元件选自缺氧反应元件(hre)、温度敏感元件、ph敏感元件、光敏元件或炎症因子响应元件中的一种或多种。更优选地，所述条件信号响应元件为缺氧反应元件(hre)。所述信号转导单元在作为缺氧反应元件的核苷酸序列调控下，可以进一步在核酸水平上加强条件信号的响应能力。[0035]根据本发明的一个优选实施方案，编码所述信号转导单元的核苷酸序列如seqno：4所示。[0036]根据本发明的一个优选实施方案，所述核酸分子的核苷酸序列如seqno：5或6所示。[0037]第三方面，本发明提供了一种载体，其包含上述根据本发明的核酸分子。[0038]根据本发明的载体可以选自质粒、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、森林脑炎病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体、新城疫病毒载体或转座子中的一种或多种。优选地，所述载体为慢病毒载体。[0039]第四方面，本发明提供了一种基因工程化的宿主细胞，其包含在其染色体中整合的外源性的上述根据本发明的核酸分子，或包含上述根据本发明的载体。[0040]根据本发明的宿主细胞可以选自分离获得的人源细胞或基因工程化的免疫细胞中的一种或多种。[0041]优选地，所述分离获得的人源细胞选自胚胎干细胞、脐带血来源干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、t细胞、nk细胞、nkt细胞或巨噬细胞中的一种或多种。[0042]优选地，所述基因工程化的免疫细胞选自基因工程化的t细胞、nk细胞、nkt细胞或巨噬细胞中的一种或多种。更优选地，所述基因工程化的免疫细胞为基因工程化的t细胞。[0043]根据本发明的一个优选实施方案，所述基因工程化的免疫细胞选自嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)、嵌合抗原受体nk细胞(car-nk细胞)、嵌合抗原受体nkt细胞(car-nkt细胞)、嵌合抗原受体巨噬细胞或t细胞受体t细胞(tcr-t细胞)中的一种或多种。根据本发明的一个更优选实施方案，所述基因工程化的免疫细胞为嵌合抗原受体t细胞。[0044]根据本发明基因工程化的的宿主细胞经过转导上述根据本发明的核酸分子或转染上述根据本发明的载体，能够在缺氧环境下驱动模块化car的剪接。[0045]本发明还提供了一种上述根据本发明的基因工程化宿主细胞的制备方法，其包括将上述根据本发明的核酸分子和/或载体导入宿主细胞内。[0046]在根据本发明的制备方法中，所述导入可以为转染或转导。[0047]第五方面，本发明提供了上述根据本发明的条件控制可剪接的嵌合抗原受体分子、核酸分子、载体或基因工程化的宿主细胞在制备细胞免疫治疗药物中的用途。[0048]相应地，本发明提供了一种细胞免疫治疗方法，其包括：[0049]将上述根据本发明的核酸分子和/或载体导入宿主细胞内，向有需要的对象给予治疗有效量的所述宿主细胞，或者[0050]向有需要的对象给予治疗有效量的上述根据本发明的基因工程化的宿主细胞。[0051]优选地，所述导入为同时、先后或依次导入。[0052]优选地，在上述根据本发明的用途或方法中，所述细胞免疫治疗药物或方法用于治疗乏氧性疾病。优选地，所述乏氧性疾病为癌症。更优选地，所述癌症为实体瘤，例如神经母细胞瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、子宫颈癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、鼻咽癌、小肠癌、大肠癌、结直肠癌、膀胱癌、骨癌、前列腺癌、甲状腺癌或脑癌中的一种或多种。[0053]本发明人经研究发现，利用肿瘤微环境的内在特征信号驱动模块化car的活化更具临床应用价值。肿瘤缺氧微环境信号有望用于实体瘤等乏氧性疾病的治疗新技术的开发，通过缺氧微环境信号驱动模块化car的激活，可以提升肿瘤治疗的特异性，避免或减少对正常组织的损伤。[0054]本发明提供的条件控制的可剪接的嵌合抗原受体分子包含抗原识别单元和信号转导单元，其响应特定条件信号(如缺氧)并实现抗原识别单元和信号转导单元的剪接，体现出以下三大优势：[0055]1)抗原识别单元可自发/诱发降解，减少了在正常组织中的滞留，降低了对正常组织的损伤；[0056]2)信号传导单元可以响应特定条件信号(如缺氧)，具有在正常组织环境下低表达，而在肿瘤微环境下富集的特点；[0057]3)条件控制的模块化car剪接实现了肿瘤微环境下的特异性激活，有效降低了car-t细胞靶向非肿瘤组织所引起的on-targetoff-tumor毒副作用。[0058]应理解，在本发明范围内，本发明的上述各项技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各项技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅限制，在此不再一一赘述。附图说明[0059]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：[0060]图1示出传统的cd47car(cd47-28bbz，图1a)、融合氧依赖降解结构域odd的缺氧调控的cd47car-odd(cd47-28bbz-odd，图1b)、抗原识别单元1(cd47-28bb-intn-sope，图1c)、抗原识别单元2(cd47-28bb-intn-erm，图1d)、缺氧调控的信号转导单元(odd-intc-cd3z，图1e)、二合一的条件控制(缺氧调控)的可剪接系统1(cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z，图1f)和二合一的条件控制(缺氧调控)的可剪接系统2(cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z，图1g)的慢病毒表达质粒图谱。[0061]图2a-c示出抗原识别单元1(cd47-28bb-intn-sope)和抗原识别单元2(cd47-28bb-intn-erm)的自发降解。其中，图2a示出抗原识别单元的结构及其组成部分；图2b为单独融合氧依赖降解结构域odd的cd47car、融合降解子sope的抗原识别单元1和融合降解子erm的抗原识别单元2在293t细胞膜上的流式细胞术检测结果；图2c为图2b流式细胞术检测数据的统计结果，降解子sope和erm的自发降解能力明显优于氧依赖降解结构域odd，且erm的降解能力最佳。[0062]图3a-d示出抗原识别单元1(cd47-28bb-intn-sope)和抗原识别单元2(cd47-28bb-intn-erm)的剪接活性。其中，图3a示出降解子融合car和缺氧调控信号传导单元odd-intc-cd3z的结构及其组成；图3b示出整合car和缺氧调控的信号传导单元odd-intc-cd3z的工程化293t细胞和整合降解子融合car和缺氧调控的信号传导单元odd-intc-cd3z的工程化293t细胞于缺氧条件下的car表达水平，其中blank为阴性293t细胞的流式检测结果，mock表示未加入缺氧调控的信号传导单元odd-intc-cd3z的工程化293t细胞，即空载病毒转导的工程化293t细胞；图3c为缺氧条件下剪接后的car表达水平的诱导倍数；图3d为同时整合缺氧调控的信号传导单元odd-intc-cd3z的三种基因工程化293t细胞分别放置于常氧(21％o2)和缺氧条件(1％o2)下培养24h，培养结束后收集细胞进行蛋白质免疫印迹检测的结果。[0063]图4示出转导cd47car(cd47-28bbz，其中z代表cd3ζ信号传导结构域)、抗原识别单元1(cd47-28bb-intn-sope)、二合一的条件控制(缺氧调控)的可剪接系统1(cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z)、抗原识别单元2(cd47-28bb-intn-erm)和二合一的条件控制(缺氧调控)的可剪接系统2(cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z)的工程化t细胞膜上的car分子流式细胞术检测结果。图4b为图4a流式检测数据的统计结果。[0064]图5示出转导cd47car(cd47-28bbz)、抗原识别单元1(cd47-28bb-intn-sope)、二合一的条件控制(缺氧调控)的可剪接系统1(cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z)、抗原识别单元2(cd47-28bb-intn-erm)和二合一的条件控制(缺氧调控)的可剪接系统2(cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z)的工程化t细胞的常氧和缺氧依赖的细胞杀伤结果。图5a的靶细胞为卵巢癌肿瘤细胞系skov3；图5b的靶细胞为肺癌肿瘤细胞系nci-h292。[0065]图6示出转导二合一的条件控制(缺氧调控)的可剪接系统1(cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z)和二合一的条件控制(缺氧调控)的可剪接系统2(cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z)的工程化t细胞的体内抗肿瘤活性。图6a为实验流程图，图6b为工程化t细胞输注30天的肿瘤大小统计结果。具体实施方式[0066]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。[0067]以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。以下实施例中所使用的实验材料，若无特殊说明，均为常规生化试剂，由销售公司购买所得，其中：[0068]dmem培养基、rpmi1640培养基均购自corning公司；淋巴细胞培养基x-vivo15购自lonza公司。[0069]t细胞生长培养基的具体配制方法参见中国发明专利申请cn201910163391.1，由基础培养基和细胞因子组成，基础培养基为淋巴细胞培养基x-vivo15，额外添加细胞因子5ng/mlil-7、10ng/mlil-15或30ng/mlil-21。其中，细胞因子il-7和il-15购自r&d公司，il-21购自近岸蛋白质科技有限公司。[0070]胎牛血清购自bi公司。[0071]turbofect转染试剂盒购自thermofisherscientific公司。[0072]lenti-x慢病毒浓缩试剂购自takara公司。[0073]基因合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。[0074]空白慢病毒表达质粒(pxw-ef1α-mcs-p2a-egfp和pxw-ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2)来源于购自康霖生物科技(杭州)有限公司的商业化质粒abpcclsin-ef1α-mcs，分别在该商业化质粒上重组了绿色荧光蛋白基因和蓝色荧光蛋白基因，从而获得所述空白慢病毒表达质粒，包装质粒pspax2和包膜质粒pmd2.g购自addgene公司。[0075]stable3化学感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。[0076]无内毒素质粒小提试剂盒和无内毒素质粒中提试剂盒分别购自omega公司和machereynagel公司。[0077]荧光素酶底物购自普洛麦格生物技术有限公司。[0078]293t细胞、a549肺癌细胞、skov3卵巢癌细胞和nci-h292肺癌细胞购自美国atcc。稳定整合萤火虫荧光素酶基因的skov3-luc和nci-h292-luc通过采用携带萤火虫荧光素酶基因的慢病毒转导skov3卵巢癌细胞和nci-h292肺癌细胞获得。[0079]重症联合免疫缺陷小鼠(b-ndg)购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司。[0080]实施例1条件控制可剪接的嵌合抗原受体分子的组成[0081]所述抗原识别单元的氨基酸序列如seqno：1或seqno：2所示，seqno：1或seqno：2分别由cd47抗原识别结构域、cd28跨膜结构域、cd28和4-1bb共刺激信号域、n端剪接域和降解子的序列组成。具体的cd47抗原识别结构域、cd28跨膜结构域、cd28和4-1bb共刺激信号域、n端剪接域和降解子的氨基酸序列如表1所示。[0082]表1抗原识别单元的氨基酸序列[0083][0084][0085]所述信号转导单元的氨基酸序列如seqno：3所示，seqno：3由缺氧条件信号响应结构域(氧依赖降解结构域odd)、c端剪接域、cd3ζ信号传导结构域的序列组成。具体的缺氧条件信号响应结构域(氧依赖降解结构域odd)、c端剪接域和cd3ζ信号传导结构域的氨基酸序列如表2所示。[0086]表2信号转导单元的氨基酸序列[0087][0088]所述包含缺氧反应元件的信号转导单元的核苷酸序列如seqno：4所示，seqno：4由缺氧条件信号响应结构域(氧依赖降解结构域odd)、c端剪接域、cd3ζ信号传导结构域和缺氧反应元件的序列组成。具体的缺氧条件信号响应结构域(氧依赖降解结构域odd)、c端剪接域、cd3ζ信号传导结构域和缺氧反应元件的核苷酸序列如表3所示。[0089]表3信号转导单元的核苷酸序列[0090][0091][0092]所述条件控制可剪接的嵌合抗原受体分子的核苷酸序列如seqno：5或seqno：6所示，seqno：5由cd47抗原识别结构域的核酸编码序列、cd28跨膜结构域的核酸编码序列、cd28和4-1bb共刺激信号域的核酸编码序列、n端剪接域的核酸编码序列、降解子sope的核酸编码序列、缺氧反应元件(hre)、缺氧条件信号响应结构域(氧依赖降解结构域odd)的核酸编码序列、c端剪接域的核酸编码序列和cd3ζ信号传导结构域的核酸编码序列组成；seqno：6由cd47抗原识别结构域的核酸编码序列、cd28跨膜结构域的核酸编码序列、cd28和4-1bb共刺激信号域的核酸编码序列、n端剪接域的核酸编码序列、降解子erm的核酸编码序列、缺氧反应元件(hre)、缺氧条件信号响应结构域(氧依赖降解结构域odd)的核酸编码序列、c端剪接域的核酸编码序列和cd3ζ信号传导结构域的核酸编码序列组成。具体的cd47抗原识别结构域的核酸编码序列、cd28跨膜结构域的核酸编码序列、cd28和4-1bb共刺激信号域的核酸编码序列、n端剪接域的核酸编码序列、降解子sope/erm的核酸编码序列、缺氧反应元件(hre)、缺氧条件信号响应结构域(氧依赖降解结构域odd)的核酸编码序列、c端剪接域的核酸编码序列和cd3ζ信号传导结构域的核酸编码序列如表4所示。[0093]表4条件控制可剪接的嵌合抗原受体分子的核苷酸序列[0094][0095][0096][0097][0098]实施例2慢病毒表达质粒的构建[0099]由上海捷瑞生物工程有限公司合成seqno：7-9所示的核酸序列，并分别克隆至空白慢病毒表达质粒，获得：[0100]用pxw-ef1α-mcs-p2a-egfp进行重组，获得了携带核酸序列seqno：7的pxw-ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp重组质粒，即重组了cd47-28bbz基因的传统cd47car的慢病毒表达质粒(缩写为pxw-cd47car)。其中，seqno：7所示的核苷酸编码cd47抗原识别结构域、cd28跨膜结构域、cd28共刺激信号域、4-1bb共刺激信号域和cd3ζ信号传导结构域(各组成部分的具体序列参见表1和2)。[0101]用pxw-ef1α-mcs-p2a-egfp进行重组，获得了携带核酸序列seqno：8的pxw-ef1α-cd47-28bbz-odd-p2a-egfp重组质粒，即融合氧依赖降解结构域odd的缺氧调控cd47car-odd的慢病毒表达质粒(缩写为pxw-cd47car-odd，重组了cd47-28bbz-odd基因)。其中，seqno：8所示的核苷酸编码cd47抗原识别结构域、cd28跨膜结构域、cd28共刺激信号域、4-1bb共刺激信号域，cd3ζ信号传导结构域和缺氧条件信号响应结构域(即氧依赖降解结构域odd)(各组成部分的具体序列参见表1和2)。[0102]用pxw-ef1α-mcs-p2a-egfp进行重组，获得了携带核酸序列seqno：9的pxw-ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp重组质粒，即抗原识别单元1的慢病毒表达质粒(缩写为pxw-cd47car-intn-sope，重组了cd47-28bb-intn-sope基因)。其中，seqno：9所示的核苷酸编码cd47抗原识别结构域、cd28跨膜结构域、cd28共刺激信号域、4-1bb共刺激信号域，n端剪接域和降解子sope(各组成部分的具体序列参见表1和2)。[0103]用pxw-ef1α-mcs-p2a-egfp进行重组，获得了携带核酸序列seqno：10的pxw-ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp重组质粒，即抗原识别单元2的慢病毒表达质粒(缩写为pxw-cd47car-intn-erm，重组了cd47-28bb-intn-erm基因)。其中，seqno：10所示的核苷酸编码cd47抗原识别结构域、cd28跨膜结构域、cd28共刺激信号域、4-1bb共刺激信号域，n端剪接域和降解子erm(各组成部分的具体序列参见表1和2)。[0104]用pxw-ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2进行重组，获得了携带核酸序列seqno：11的pxw-ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z，即缺氧调控的信号转导单元odd-intc-cd3z的慢病毒表达质粒(缩写为pxw-odd-intc-cd3z，重组了odd-intc-cd3z基因)。其中，seqno：11所示的核苷酸编码缺氧条件信号响应结构域(氧依赖降解结构odd)、c端剪接域和cd3ζ信号传导结构域(各组成部分的具体序列参见表1和2)。[0105]用pxw-ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2进行重组，获得了同时携带核酸序列seqno：9和seqno：11的pxw-ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z(缩写为pxw-cd47car-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z)(各组成部分的具体序列参见表1、2和3)。[0106]用pxw-ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2进行重组，获得了同时携带核酸序列seqno：10和seqno：11的pxw-ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z(缩写为pxw-cd47car-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z)(各组成部分的具体序列参见表1、2和3)。[0107]各个重组质粒图谱如图1所示。[0108]实施例3慢病毒的包装、浓缩和滴度测定[0109]1.1慢病毒的包装[0110]293t细胞处理：转染前24h，收集处于对数生长期的293t细胞，将其接种于10cm细胞培养皿中(6-8×106个细胞)，细胞在含有10ml的完全dmem培养基中生长，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养18-24h，细胞密度达到70-90％即可进行质粒转染。[0111]293t细胞转染：在15ml离心管中加入1ml基础dmem培养基，按照质量比为慢病毒表达质粒：包装质粒(pspax2)：包膜质粒(pmd2.g)＝1：3：1以实施例2中制备的7种质粒配制转染混合液，质粒总量合计15μg/皿。分别以质粒量(μg)：转染试剂(μl)＝1：2的比例加入turbofect转染试剂30μl，室温下孵育15-20min后加至铺有293t细胞的培养皿中，置于37℃、5％co2细胞培养箱中继续培养48h后，收集病毒上清，1000×g，4℃离心10min，弃去管底沉淀并收集病毒上清。[0112]1.2慢病毒的浓缩[0113]使用0.45μm滤器进一步过滤经离心收集的病毒上清，加入1/3病毒上清体积的lenti-x慢病毒浓缩试剂，颠倒混匀数次，4℃下孵育过夜，2000×g，4℃下离心45min，离心管底部可见白色沉淀，即为浓缩后的病毒颗粒。小心弃除上清，以原病毒上清的1/20体积的空白rpmi1640培养基重悬白色沉淀，以250μl分装并于-80℃冻存备用。[0114]1.3慢病毒滴度测定[0115]将jurkatt细胞按照1×105个/孔接种于96孔u底板上，将所收集的慢病毒浓缩液按10倍递增稀释。将100μl的病毒稀释液加入到相应孔中，加入促感染试剂硫酸鱼精蛋白并调整浓度至10μg/ml，1000×g，32℃下离心感染90min，过夜培养后更换新鲜的rpmi1640完全培养基，继续培养48h，流式细胞仪检测荧光阳性细胞比例。采用下面的公式计算病毒滴度：[0116]病毒滴度(tu/ml)＝1×105×荧光阳性细胞比例/100×1000×相应的稀释倍数。[0117]实施例4基因工程化t细胞的制备[0118]实施例3经浓缩获得了以下慢病毒载体：[0119]lv-ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp(由pxw-ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp获得)；[0120]lv-ef1α-cd47-28bbz-odd-p2a-egfp(由pxw-ef1α-cd47-28bbz-odd-p2a-egfp获得)；[0121]lv-ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp(由pxw-ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp获得)；[0122]lv-ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp(由pxw-ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp获得)；[0123]lv-ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2(由pxw-ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2获得)；[0124]lv-ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z(由pxw-ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z获得)；[0125]lv-ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z(由pxw-ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z获得)；[0126]lv-ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z(由pxw-ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z获得)。[0127]分别将上述各种慢病毒载体均以moi＝5加至同一个铺有1×106个预先用等数量的免疫磁珠活化3天的外周血单个核细胞的48孔平底板中，添加促感染试剂硫酸鱼精蛋白并将工作浓度调至10μg/ml，1000×g，32℃下离心感染90min，过夜培养后，更换新鲜的t细胞生长培养基继续培养。[0128]每2-3天添加新鲜的t细胞生长培养基，并调整细胞密度至0.5-2×106个细胞/ml。感染后6-7天，移除活化t细胞的免疫磁珠，继续培养、扩增基因工程化的t细胞，待细胞静息后(磁珠去除后9-14天)进行后续的功能实验。[0129]实施例5降解子融合car分子的表达水平检测[0130]为了验证本发明的降解子的自发降解能力，本实施例在293t细胞中进行了质粒转染实验。[0131]将293t细胞按5×104个细胞/孔铺到48孔板内，待第二天细胞贴壁后进行转染。分别转染0.5μg的重组表达质粒pxw-cd47car、pxw-cd47car-odd、pxw-cd47car-intn-sope或pxw-cd47car-intn-erm，以质粒量(μg)：转染试剂(μl)＝1：2的比例加入turbofect转染试剂，室温下孵育15-20min后加至细胞培养板中，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养48h后检测流式检测细胞膜上car分子的表达情况。结果如图2所示。[0132]图2a示出降解子融合car的结构，降解子sope或erm置于c端，n端剪接域intn连接信号缺失的car分子和降解子。[0133]图2b示出阳性对照cd47car(cd47-28bbz)、氧依赖降解结构域odd融合cd47car(cd47car-odd)和两种降解子融合car的表达水平的流式细胞术检测结果。结果表明，虽然各组间的car阳性率差异不大，但是降解子sope或erm融合car的表达水平显著低于阳性对照cd47car，也低于cd47car-odd。[0134]图2c的统计结果进一步证实，降解子sope或erm融合car的表达水平仅为阳性对照cd47car的10％或7％，自发降解率高达90％或93％，且同样优于氧依赖降解结构域odd融合cd47car的54％降解率。[0135]实施例6条件控制的可剪接系统的剪接活性[0136]采用实施例2构建的慢病毒表达质粒、实施例3的慢病毒载体制备方法获得相应的慢病毒载体。[0137]本实施例在293t细胞中进行了慢病毒载体转导实验并测试条件控制的可剪接系统的剪接活性。分别将上述各种重组慢病毒载体和空载病毒载体(lv-)均以moi＝5单独或混合加至铺有1×106个293t细胞的6孔平底板中，添加促感染试剂多聚凝胺(polybrene)并将工作浓度调至10μg/ml，过夜培养后，更换新鲜的细胞生长培养基继续培养获得了稳定整合1)ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp、2)ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp、3)ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp、4)ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp和缺氧调控的信号传导单元ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z、5)ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp和缺氧调控的信号传导单元ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z、6)ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp和缺氧调控的信号传导单元ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z、7)ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp和ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2(mock)、8)ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp和ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2(mock)、9)ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp和ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2(mock)的9种不同的基因工程化293t细胞。将以上9种基因工程化293t细胞放置于缺氧条件(1％o2)下培养24h，培养结束后收集细胞并用facs缓冲液洗脱1遍，加入2μg/ml流式抗体pe-anti-dykddddk，室温下避光孵育20min，结束后用facs缓冲液洗脱2遍，300μlfacs缓冲液重悬混匀，然后使用流式细胞仪检测car分子表达。另外，稳定整合1)ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp、2)ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp、3)ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp、4)ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp和缺氧调控的信号传导单元ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z、5)ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp和缺氧调控的信号传导单元ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z、6)ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp和缺氧调控的信号传导单元ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z的6种基因工程化293t细胞分别放置于常氧(21％o2)和缺氧条件(1％o2)下培养24h，培养结束后收集细胞用于蛋白质免疫印迹检测。结果如图3所示。[0138]图3a显示降解子融合car和缺氧调控信号传导单元odd-intc-cd3z的结构及其组成，odd-intc-cd3z由氧依赖降解结构域odd、c端剪接域intc和信号传导域cd3z构成。[0139]图3b的流式检测结果显示，同时整合降解子融合car和缺氧调控的信号传导单元odd-intc-cd3z的工程化细胞于缺氧条件下的car表达水平得到进一步提升，提示缺氧调控的信号传导单元odd-intc-cd3z于缺氧条件下富集并实现降解子融合car的剪接，释放出降解子。[0140]图3c为剪接后的car表达水平的诱导倍数，降解子sope或erm融合car诱导倍数分别为4或5倍，而对照cd47car表达水平并无变化。[0141]图3d的westernblotting结果证实，缺氧条件下降解子融合car和信号传导单元的成功剪接，效率高达100％，缺氧条件(1％o2)下实现完全剪接，获得分子量小于未剪接分子的单一条带。[0142]实施例7条件控制的可剪接系统调控嵌合抗原受体的表达[0143]采用实施例2构建的慢病毒表达质粒、实施例3的慢病毒载体制备方法和实施例4所述的基因工程化t细胞的制备方法制备稳定整合ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp、ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp、ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z、ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp或ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z基因的5种工程化t细胞。将以上5种基因工程化t细胞分别置于常氧(21％o2)或缺氧条件(1％o2)下培养24h，结束后收集细胞并用facs缓冲液洗脱1遍，加入2μg/ml流式抗体pe-anti-dykddddk，室温下避光孵育20min，结束后用facs缓冲液洗脱2遍，300μlfacs缓冲液重悬混匀，然后使用流式细胞仪检测her2car分子的表达。结果如图4所示。[0144]图4a流式检测结果显示，常氧和缺氧条件下阳性对照cd47car-t细胞(cd47-28bbz)均高表达cd47car分子，而条件控制的可剪接系统调控的car分子于常氧环境下低表达，而在缺氧环境下诱导表达，特别是稳定整合ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z的工程化t细胞。[0145]图4b的统计结果证实，降解子sope或erm融合car在常氧下的阳性率分别为阳性对照的46％或24％，表达水平更是降低至对照的4％或2％，而在缺氧条件下显著上调，诱导倍数分别为9或3倍，提示基于降解子sope的条件控制的可剪接系统活性更佳。[0146]实施例8条件控制的可剪接系统调控嵌合抗原受体t细胞的肿瘤细胞杀伤[0147]肿瘤细胞杀伤效率由基于荧光素酶的细胞杀伤检测方法(luciferase-basedcytotoxicityassay)进行评估。首先，将1×104个skov3-luc(萤火虫荧光素酶基因修饰的人卵巢癌细胞)或nci-h292-luc(萤火虫荧光素酶基因修饰的人肺癌细胞)接种于96孔平底黑板上，每孔100μl培养基，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养18h。第二天，以效应细胞：靶细胞为1：4(0.25)、1：2(0.5)、1：1(1)或2：1(2)的比例加入实施例7制备的基因工程化t细胞及同期培养的未转导t细胞至含有靶细胞的孔中，分别置于常氧条件(21％o2)或缺氧条件(1％o2)下培养24h，共培养结束后使用微孔板发光检测仪检测靶细胞的荧光素酶活力值。结果如图5所示。[0148]细胞杀伤率的计算公式见下式：[0149]细胞杀伤率(％)＝(未转导t细胞组荧光素酶活力值-实验组荧光素酶活力值)/未转导t细胞组荧光素酶活力值×100[0150]cd47car-t细胞(阳性对照)在常氧或缺氧条件下均能有效杀伤skov3(图5a)和nci-h292肿瘤细胞(图5b)，并无明显的选择杀伤特性。[0151]条件控制的可剪接系统调控的cd47car-t细胞在常氧条件下的肿瘤杀伤活性较低，基于sope的条件控制的可剪接系统调控的cd47car-t细胞在效应细胞：靶细胞为1：1时的杀伤率为3％(skov3)和6％(nci-h292)，缺氧环境下则能选择性高效杀伤skov3肿瘤细胞(84％)和nci-h292肿瘤细胞(96％)，肿瘤细胞杀伤活性提升了28倍和16倍。基于erm的条件控制的可剪接系统调控的cd47car-t细胞在效应细胞：靶细胞为1：1时的杀伤率为3％(skov3)和6％(nci-h292)，缺氧环境下则能选择性高效杀伤skov3肿瘤细胞(58％)和nci-h292肿瘤细胞(96％)，肿瘤细胞杀伤活性提升了19倍和16倍。[0152]实施例9条件控制的可剪接系统调控的car-t细胞的体内抗肿瘤作用[0153]提前一天对无菌隔离器饲养的b-ndg小鼠进行背部局部脱毛，脱毛可以使用脱毛膏或动物剃毛器，使其暴露出肿瘤细胞接种部位的皮肤即可。左手固定小鼠，即左手同时抓紧小鼠的头部、颈部和背部皮肤，使其背部朝左翻，充分暴露背部右侧剃毛部位后，右手用酒精棉球对其进行消毒处理。1ml胰岛素注射器吹打混匀预先准备好的nci-h292肿瘤细胞后吸取125μl细胞悬液(5×106个肿瘤细胞)，将针头以针尖与皮肤呈30°‑40°角度斜着刺入小鼠皮下，缓慢推注细胞悬液，避免细胞溢漏。待125μl细胞悬液注射完毕，留针2-3秒后迅速拔出，可见注射部位的皮下鼓起一个清晰可见的小包。细胞接种后每隔2-3天观察小鼠的成瘤情况和健康状态，成瘤后用游标卡尺测量基线肿瘤体积并进行后续实验。[0154]分别于肿瘤细胞接种后第五天和第十一天静脉或瘤内注射5×106个条件控制的可剪接系统调控的car-t细胞和阴性对照t细胞(utd)，每隔2-3天测量肿瘤大小，用游标卡尺分别测量肿瘤的长径和短径。结果如图6所示。[0155]肿瘤体积的计算公式如下：体积＝(长径×短径2)/2。[0156]静脉回输和瘤内注射条件控制的可剪接系统调控的car-t细胞均能有效控制肺癌的生长，相对于utd治疗组，基于降解子sope的条件控制的可剪接系统调控的car-t细胞(稳定整合ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z或ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z)抑瘤效果更加显著，细胞回输后一个月的肿瘤抑制率分别为72.1％(静脉回输)和85.6％(瘤内注射)。[0157]以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已经以优选实施例揭示如上，然而其并非用以限定本发明。任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰以获得等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍落入本发明技术方案的范围内。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：，具体涉及一种条件控制的可剪接嵌合抗原受体分子及其编码核酸分子、载体、宿主细胞，和它们在治疗乏氧性疾病中的应用。
背景技术：
：：2.癌症免疫治疗涉及单克隆抗体、疫苗、基因治疗、细胞治疗等疗法，其中靶向肿瘤抗原的单克隆抗体、免疫检查点抑制剂、t细胞受体修饰t细胞(tcellreceptortcells，tcr-tcells)、嵌合抗原受体t细胞(chimericantigenreceptortcells，car-tcells)等免疫治疗方法在临床研究中显示出令人瞩目的抗肿瘤效果。然而，在细胞治疗方面，由于肿瘤特异性抗原缺乏而带来的脱靶效应往往可能造成致死性副作用(morganra,yangjc,kitanom,etal.casereportofaseriousadverseeventfollowingtheadministrationoftcellstransducedwithachimericantigenreceptorrecognizingerbb2[j].molther.2010,18:843-851)，从而大大限制了细胞治疗在实体瘤中的临床应用。因此，有必要进一步开发可调控的、具有时空特异性的细胞免疫治疗技术，方可降低对正常组织的损伤，提高对肿瘤病灶的治疗特异性。[0003]先前的研究报道了一种模块化的car设计，研究者将完整的car分子分成两个模块，分别是定位于细胞膜上的抗原识别模块，其用于识别肿瘤细胞表面的抗原；另外一个是胞内的信号传导模块。模块化car的激活基于两个条件，一是工程化t细胞要通过抗原识别模块识别肿瘤细胞表面的抗原，工程化t细胞结合到肿瘤细胞，但本身不能激活，只有在外界小分子化合物出现的时候，抗原识别模块和信号传导模块偶联方可传递激活信号，才能够杀伤肿瘤细胞(wucy,roybalkt,puchnerem,onufferj,limwa.remotecontroloftherapeutictcellsthroughasmallmolecule-gatedchimericreceptor[j].2science.2015,350(6258):aab4077)。然而，上述模块化car的激活严格依赖外界小分子化合物的添加，施加和停用外界小分子化合物的合适时机给临床应用提出了巨大的挑战。[0004]现代医学研究发现，缺氧与关节炎、糖尿病性视网膜病变、缺血性心脏病、中风等诸多疾病，特别是实体瘤密切相关。由于实体瘤内异常血管结构引起的供血不足以及肿瘤细胞的过度增殖，从而营造了一个相对缺氧的肿瘤微环境，肿瘤组织内的氧气水平常常低于2％(brownjm,wilsonwr.exploitingtumourhypoxiaincancertreatment[j].natrevcancer,2004,4:437–447)，所以缺氧是多种实体瘤的一个共有特征信号。因此，如何通过利用肿瘤微环境与正常组织微环境的差异，从而以此为影响因素严格控制模块化car的活化驱动，实现其在肿瘤治疗中的临床应用，可解决现有技术中依赖于外界施加小分子化合物驱动模块化car的活化造成的不便利和不精确的问题。技术实现要素：[0005]鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种条件控制的可剪接嵌合抗原受体(car)分子及其在实体瘤等乏氧性疾病的治疗，特别是在实体瘤的car-t细胞治疗中的应用。[0006]在本发明中，对部分术语的说明或定义如下：[0007]术语“可剪接的”是指蛋白质分子可以被剪切后重新接合。[0008]术语“抗原识别单元”是指能够特异性结合和识别靶抗原的蛋白质分子。[0009]术语“信号转导单元”是指能够传递信号的蛋白质分子。[0010]术语“抗原识别结构域”是指能够特异性识别靶抗原的功能域，通常包括单链抗体(single-chainfragmentvariable，scfv)、单域抗体(singledomainantibody，sdab)和受体的胞外端等。[0011]术语“跨膜结构域”是指蛋白质序列中跨越细胞膜的区域。[0012]术语“共刺激信号域”是指参与适应性免疫的免疫细胞表面所表达的不同共刺激分子及其配体相互结合而产生共刺激信号的结构域，通常为选自cd27、cd28、4-1bb、ox40和icos等共刺激分子的共刺激信号域。[0013]术语“n端剪接域”是指内含肽的n端结构域，可与c端剪接域进行剪接。[0014]术语“降解子”是指一段特定的氨基酸序列，其可被细胞内的蛋白酶识别，以介导目标蛋白的降解清除。[0015]术语“条件信号响应结构域”是指一段特定的氨基酸序列，其可以响应特定条件信号并调控目标蛋白的降解和富集，特定条件信号包括氧含量、光照和温度。[0016]术语“c端剪接域”是指内含肽的c端结构域，可与n端剪接域进行剪接。[0017]术语“信号传导结构域”是指含有多个免疫受体酪氨酸激活基序(immunoreceptortyrosine-basedactivationmotif，itam)的t细胞受体的信号传导结构域，包括cd3γ，cd3δ，cd3ε和cd3ζ。[0018]术语“乏氧性疾病”是指组织氧含量低于1％的疾病，特别是实体肿瘤。[0019]本发明的目的是通过以下技术方案实现的：[0020]第一方面，本发明提供了一种条件控制的可剪接嵌合抗原受体分子，其包括抗原识别单元和信号转导单元，其中所述抗原识别单元包括抗原识别结构域、跨膜结构域、共刺激信号域、n端剪接域和降解子；所述信号转导单元包含条件信号响应结构域、c端剪接域和信号传导结构域。[0021]本发明提供的条件控制的可剪接嵌合抗原受体分子能够响应特定条件信号，例如缺氧，从而实现抗原识别单元和信号转导单元的剪接。其中，所述抗原识别单元可自发/诱发降解，减少在正常组织中的滞留，而所述信号传导单元可以响应特定条件信号，例如缺氧，并且具有在正常组织环境下低表达，而在肿瘤微环境下富集的特点。[0022]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，所述抗原识别结构域所结合的抗原可以选自cd47、axl、egfr、cd7、cd24、fap、cd147、her2、ror1、ror2、cd133、epha2、cd171、cea、epcam、tag72、il-13rα、egfrviii、gd2、frα、psca、psma、gpc3、caix、claudin18.2、vegfr2、pd-l1、msln、muc1、c-met、b7-h3或trop2抗原中的一种或多种。优选地，所述抗原识别结构域所结合的抗原为cd47抗原。[0023]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，所述跨膜结构域可以选自cd3ζ、cd4、cd8、cd28或cd137/4-1bb跨膜结构域中的一种或多种。优选地，所述跨膜结构域为cd28跨膜结构域。[0024]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，所述抗原识别单元中的共刺激结构域可以选自cd2、cd27、cd28、cd40、ox40、cd137/4-1bb、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、tlr11或dap10共刺激结构域中的一种或多种。优选地，所述抗原识别单元中的共刺激结构域选自cd28或cd137/4-1bb共刺激结构域中的一种或多种。[0025]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，所述n端剪接域可以选自蛋白质内含子或spytag/spycatcher自组装子中的一种或多种。优选地，所述n端剪接域为蛋白质内含子intn。[0026]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，所述降解子可以选自二氢叶酸还原酶(dhfr)、雌激素受体(er)、沙门氏菌iii型分泌系统效应蛋白(sope)、植物激素诱导蛋白降解子、不稳定域(ad)或光敏蛋白降解子中的一种或多种。优选地，所述降解子选自雌激素受体或沙门氏菌iii型分泌系统效应蛋白中的一种或多种。更优选地，所述降解子为突变型雌激素受体(erm)。[0027]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，所述条件信号响应结构域可以选自氧依赖降解结构域(odd)、温度敏感结构域、ph敏感结构域、光敏结构域或炎症因子响应结构域中的一种或多种。优选地，所述条件信号响应结构域为氧依赖降解结构域。[0028]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，所述c端剪接域可以选自蛋白质内含子或spytag/spycatcher自组装子中的一种或多种。优选地，所述c端剪接域为蛋白质内含子intc。[0029]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，所述信号传导结构域可以选自cd3ξ、fcγriii、fcεri、fc受体信号传导结构域或携带免疫受体酪氨酸活化基序(itam)信号传导分子中的一种或多种。优选地，所述信号传导结构域为cd3ξ信号传导结构域。[0030]在根据本发明的嵌合抗原受体分子中，优选地，所述信号转导单元还包含共刺激信号结构域。更优选地，所述信号转导单元中的共刺激信号结构域可以选自cd2、cd27、cd28、cd40、ox40、cd137/4-1bb、tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、tlr11或dap10共刺激信号结构域中的一种或多种。[0031]根据本发明的一个优选实施方案，所述抗原识别单元的氨基酸序列如seqno：1或seqno：2所示。[0032]根据本发明的一个优选实施方案，所述信号转导单元的氨基酸序列如seqno：3所示。[0033]第二方面，本发明提供了一种编码上述根据本发明的嵌合抗原受体分子的核酸分子。[0034]在根据本发明的核酸分子中，优选地，编码所述信号转导单元的核苷酸序列还包含编码条件信号响应元件的核苷酸序列。优选地，所述条件信号响应元件选自缺氧反应元件(hre)、温度敏感元件、ph敏感元件、光敏元件或炎症因子响应元件中的一种或多种。更优选地，所述条件信号响应元件为缺氧反应元件(hre)。所述信号转导单元在作为缺氧反应元件的核苷酸序列调控下，可以进一步在核酸水平上加强条件信号的响应能力。[0035]根据本发明的一个优选实施方案，编码所述信号转导单元的核苷酸序列如seqno：4所示。[0036]根据本发明的一个优选实施方案，所述核酸分子的核苷酸序列如seqno：5或6所示。[0037]第三方面，本发明提供了一种载体，其包含上述根据本发明的核酸分子。[0038]根据本发明的载体可以选自质粒、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘苗病毒载体、单纯疱疹病毒载体、森林脑炎病毒载体、脊髓灰质炎病毒载体、新城疫病毒载体或转座子中的一种或多种。优选地，所述载体为慢病毒载体。[0039]第四方面，本发明提供了一种基因工程化的宿主细胞，其包含在其染色体中整合的外源性的上述根据本发明的核酸分子，或包含上述根据本发明的载体。[0040]根据本发明的宿主细胞可以选自分离获得的人源细胞或基因工程化的免疫细胞中的一种或多种。[0041]优选地，所述分离获得的人源细胞选自胚胎干细胞、脐带血来源干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞、t细胞、nk细胞、nkt细胞或巨噬细胞中的一种或多种。[0042]优选地，所述基因工程化的免疫细胞选自基因工程化的t细胞、nk细胞、nkt细胞或巨噬细胞中的一种或多种。更优选地，所述基因工程化的免疫细胞为基因工程化的t细胞。[0043]根据本发明的一个优选实施方案，所述基因工程化的免疫细胞选自嵌合抗原受体t细胞(car-t细胞)、嵌合抗原受体nk细胞(car-nk细胞)、嵌合抗原受体nkt细胞(car-nkt细胞)、嵌合抗原受体巨噬细胞或t细胞受体t细胞(tcr-t细胞)中的一种或多种。根据本发明的一个更优选实施方案，所述基因工程化的免疫细胞为嵌合抗原受体t细胞。[0044]根据本发明基因工程化的的宿主细胞经过转导上述根据本发明的核酸分子或转染上述根据本发明的载体，能够在缺氧环境下驱动模块化car的剪接。[0045]本发明还提供了一种上述根据本发明的基因工程化宿主细胞的制备方法，其包括将上述根据本发明的核酸分子和/或载体导入宿主细胞内。[0046]在根据本发明的制备方法中，所述导入可以为转染或转导。[0047]第五方面，本发明提供了上述根据本发明的条件控制可剪接的嵌合抗原受体分子、核酸分子、载体或基因工程化的宿主细胞在制备细胞免疫治疗药物中的用途。[0048]相应地，本发明提供了一种细胞免疫治疗方法，其包括：[0049]将上述根据本发明的核酸分子和/或载体导入宿主细胞内，向有需要的对象给予治疗有效量的所述宿主细胞，或者[0050]向有需要的对象给予治疗有效量的上述根据本发明的基因工程化的宿主细胞。[0051]优选地，所述导入为同时、先后或依次导入。[0052]优选地，在上述根据本发明的用途或方法中，所述细胞免疫治疗药物或方法用于治疗乏氧性疾病。优选地，所述乏氧性疾病为癌症。更优选地，所述癌症为实体瘤，例如神经母细胞瘤、肺癌、乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、子宫颈癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、鼻咽癌、小肠癌、大肠癌、结直肠癌、膀胱癌、骨癌、前列腺癌、甲状腺癌或脑癌中的一种或多种。[0053]本发明人经研究发现，利用肿瘤微环境的内在特征信号驱动模块化car的活化更具临床应用价值。肿瘤缺氧微环境信号有望用于实体瘤等乏氧性疾病的治疗新技术的开发，通过缺氧微环境信号驱动模块化car的激活，可以提升肿瘤治疗的特异性，避免或减少对正常组织的损伤。[0054]本发明提供的条件控制的可剪接的嵌合抗原受体分子包含抗原识别单元和信号转导单元，其响应特定条件信号(如缺氧)并实现抗原识别单元和信号转导单元的剪接，体现出以下三大优势：[0055]1)抗原识别单元可自发/诱发降解，减少了在正常组织中的滞留，降低了对正常组织的损伤；[0056]2)信号传导单元可以响应特定条件信号(如缺氧)，具有在正常组织环境下低表达，而在肿瘤微环境下富集的特点；[0057]3)条件控制的模块化car剪接实现了肿瘤微环境下的特异性激活，有效降低了car-t细胞靶向非肿瘤组织所引起的on-targetoff-tumor毒副作用。[0058]应理解，在本发明范围内，本发明的上述各项技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各项技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅限制，在此不再一一赘述。附图说明[0059]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：[0060]图1示出传统的cd47car(cd47-28bbz，图1a)、融合氧依赖降解结构域odd的缺氧调控的cd47car-odd(cd47-28bbz-odd，图1b)、抗原识别单元1(cd47-28bb-intn-sope，图1c)、抗原识别单元2(cd47-28bb-intn-erm，图1d)、缺氧调控的信号转导单元(odd-intc-cd3z，图1e)、二合一的条件控制(缺氧调控)的可剪接系统1(cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z，图1f)和二合一的条件控制(缺氧调控)的可剪接系统2(cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z，图1g)的慢病毒表达质粒图谱。[0061]图2a-c示出抗原识别单元1(cd47-28bb-intn-sope)和抗原识别单元2(cd47-28bb-intn-erm)的自发降解。其中，图2a示出抗原识别单元的结构及其组成部分；图2b为单独融合氧依赖降解结构域odd的cd47car、融合降解子sope的抗原识别单元1和融合降解子erm的抗原识别单元2在293t细胞膜上的流式细胞术检测结果；图2c为图2b流式细胞术检测数据的统计结果，降解子sope和erm的自发降解能力明显优于氧依赖降解结构域odd，且erm的降解能力最佳。[0062]图3a-d示出抗原识别单元1(cd47-28bb-intn-sope)和抗原识别单元2(cd47-28bb-intn-erm)的剪接活性。其中，图3a示出降解子融合car和缺氧调控信号传导单元odd-intc-cd3z的结构及其组成；图3b示出整合car和缺氧调控的信号传导单元odd-intc-cd3z的工程化293t细胞和整合降解子融合car和缺氧调控的信号传导单元odd-intc-cd3z的工程化293t细胞于缺氧条件下的car表达水平，其中blank为阴性293t细胞的流式检测结果，mock表示未加入缺氧调控的信号传导单元odd-intc-cd3z的工程化293t细胞，即空载病毒转导的工程化293t细胞；图3c为缺氧条件下剪接后的car表达水平的诱导倍数；图3d为同时整合缺氧调控的信号传导单元odd-intc-cd3z的三种基因工程化293t细胞分别放置于常氧(21％o2)和缺氧条件(1％o2)下培养24h，培养结束后收集细胞进行蛋白质免疫印迹检测的结果。[0063]图4示出转导cd47car(cd47-28bbz，其中z代表cd3ζ信号传导结构域)、抗原识别单元1(cd47-28bb-intn-sope)、二合一的条件控制(缺氧调控)的可剪接系统1(cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z)、抗原识别单元2(cd47-28bb-intn-erm)和二合一的条件控制(缺氧调控)的可剪接系统2(cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z)的工程化t细胞膜上的car分子流式细胞术检测结果。图4b为图4a流式检测数据的统计结果。[0064]图5示出转导cd47car(cd47-28bbz)、抗原识别单元1(cd47-28bb-intn-sope)、二合一的条件控制(缺氧调控)的可剪接系统1(cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z)、抗原识别单元2(cd47-28bb-intn-erm)和二合一的条件控制(缺氧调控)的可剪接系统2(cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z)的工程化t细胞的常氧和缺氧依赖的细胞杀伤结果。图5a的靶细胞为卵巢癌肿瘤细胞系skov3；图5b的靶细胞为肺癌肿瘤细胞系nci-h292。[0065]图6示出转导二合一的条件控制(缺氧调控)的可剪接系统1(cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z)和二合一的条件控制(缺氧调控)的可剪接系统2(cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z)的工程化t细胞的体内抗肿瘤活性。图6a为实验流程图，图6b为工程化t细胞输注30天的肿瘤大小统计结果。具体实施方式[0066]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。[0067]以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域的常规实验方法。以下实施例中所使用的实验材料，若无特殊说明，均为常规生化试剂，由销售公司购买所得，其中：[0068]dmem培养基、rpmi1640培养基均购自corning公司；淋巴细胞培养基x-vivo15购自lonza公司。[0069]t细胞生长培养基的具体配制方法参见中国发明专利申请cn201910163391.1，由基础培养基和细胞因子组成，基础培养基为淋巴细胞培养基x-vivo15，额外添加细胞因子5ng/mlil-7、10ng/mlil-15或30ng/mlil-21。其中，细胞因子il-7和il-15购自r&d公司，il-21购自近岸蛋白质科技有限公司。[0070]胎牛血清购自bi公司。[0071]turbofect转染试剂盒购自thermofisherscientific公司。[0072]lenti-x慢病毒浓缩试剂购自takara公司。[0073]基因合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成。[0074]空白慢病毒表达质粒(pxw-ef1α-mcs-p2a-egfp和pxw-ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2)来源于购自康霖生物科技(杭州)有限公司的商业化质粒abpcclsin-ef1α-mcs，分别在该商业化质粒上重组了绿色荧光蛋白基因和蓝色荧光蛋白基因，从而获得所述空白慢病毒表达质粒，包装质粒pspax2和包膜质粒pmd2.g购自addgene公司。[0075]stable3化学感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司。[0076]无内毒素质粒小提试剂盒和无内毒素质粒中提试剂盒分别购自omega公司和machereynagel公司。[0077]荧光素酶底物购自普洛麦格生物技术有限公司。[0078]293t细胞、a549肺癌细胞、skov3卵巢癌细胞和nci-h292肺癌细胞购自美国atcc。稳定整合萤火虫荧光素酶基因的skov3-luc和nci-h292-luc通过采用携带萤火虫荧光素酶基因的慢病毒转导skov3卵巢癌细胞和nci-h292肺癌细胞获得。[0079]重症联合免疫缺陷小鼠(b-ndg)购自百奥赛图江苏基因生物技术有限公司。[0080]实施例1条件控制可剪接的嵌合抗原受体分子的组成[0081]所述抗原识别单元的氨基酸序列如seqno：1或seqno：2所示，seqno：1或seqno：2分别由cd47抗原识别结构域、cd28跨膜结构域、cd28和4-1bb共刺激信号域、n端剪接域和降解子的序列组成。具体的cd47抗原识别结构域、cd28跨膜结构域、cd28和4-1bb共刺激信号域、n端剪接域和降解子的氨基酸序列如表1所示。[0082]表1抗原识别单元的氨基酸序列[0083][0084][0085]所述信号转导单元的氨基酸序列如seqno：3所示，seqno：3由缺氧条件信号响应结构域(氧依赖降解结构域odd)、c端剪接域、cd3ζ信号传导结构域的序列组成。具体的缺氧条件信号响应结构域(氧依赖降解结构域odd)、c端剪接域和cd3ζ信号传导结构域的氨基酸序列如表2所示。[0086]表2信号转导单元的氨基酸序列[0087][0088]所述包含缺氧反应元件的信号转导单元的核苷酸序列如seqno：4所示，seqno：4由缺氧条件信号响应结构域(氧依赖降解结构域odd)、c端剪接域、cd3ζ信号传导结构域和缺氧反应元件的序列组成。具体的缺氧条件信号响应结构域(氧依赖降解结构域odd)、c端剪接域、cd3ζ信号传导结构域和缺氧反应元件的核苷酸序列如表3所示。[0089]表3信号转导单元的核苷酸序列[0090][0091][0092]所述条件控制可剪接的嵌合抗原受体分子的核苷酸序列如seqno：5或seqno：6所示，seqno：5由cd47抗原识别结构域的核酸编码序列、cd28跨膜结构域的核酸编码序列、cd28和4-1bb共刺激信号域的核酸编码序列、n端剪接域的核酸编码序列、降解子sope的核酸编码序列、缺氧反应元件(hre)、缺氧条件信号响应结构域(氧依赖降解结构域odd)的核酸编码序列、c端剪接域的核酸编码序列和cd3ζ信号传导结构域的核酸编码序列组成；seqno：6由cd47抗原识别结构域的核酸编码序列、cd28跨膜结构域的核酸编码序列、cd28和4-1bb共刺激信号域的核酸编码序列、n端剪接域的核酸编码序列、降解子erm的核酸编码序列、缺氧反应元件(hre)、缺氧条件信号响应结构域(氧依赖降解结构域odd)的核酸编码序列、c端剪接域的核酸编码序列和cd3ζ信号传导结构域的核酸编码序列组成。具体的cd47抗原识别结构域的核酸编码序列、cd28跨膜结构域的核酸编码序列、cd28和4-1bb共刺激信号域的核酸编码序列、n端剪接域的核酸编码序列、降解子sope/erm的核酸编码序列、缺氧反应元件(hre)、缺氧条件信号响应结构域(氧依赖降解结构域odd)的核酸编码序列、c端剪接域的核酸编码序列和cd3ζ信号传导结构域的核酸编码序列如表4所示。[0093]表4条件控制可剪接的嵌合抗原受体分子的核苷酸序列[0094][0095][0096][0097][0098]实施例2慢病毒表达质粒的构建[0099]由上海捷瑞生物工程有限公司合成seqno：7-9所示的核酸序列，并分别克隆至空白慢病毒表达质粒，获得：[0100]用pxw-ef1α-mcs-p2a-egfp进行重组，获得了携带核酸序列seqno：7的pxw-ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp重组质粒，即重组了cd47-28bbz基因的传统cd47car的慢病毒表达质粒(缩写为pxw-cd47car)。其中，seqno：7所示的核苷酸编码cd47抗原识别结构域、cd28跨膜结构域、cd28共刺激信号域、4-1bb共刺激信号域和cd3ζ信号传导结构域(各组成部分的具体序列参见表1和2)。[0101]用pxw-ef1α-mcs-p2a-egfp进行重组，获得了携带核酸序列seqno：8的pxw-ef1α-cd47-28bbz-odd-p2a-egfp重组质粒，即融合氧依赖降解结构域odd的缺氧调控cd47car-odd的慢病毒表达质粒(缩写为pxw-cd47car-odd，重组了cd47-28bbz-odd基因)。其中，seqno：8所示的核苷酸编码cd47抗原识别结构域、cd28跨膜结构域、cd28共刺激信号域、4-1bb共刺激信号域，cd3ζ信号传导结构域和缺氧条件信号响应结构域(即氧依赖降解结构域odd)(各组成部分的具体序列参见表1和2)。[0102]用pxw-ef1α-mcs-p2a-egfp进行重组，获得了携带核酸序列seqno：9的pxw-ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp重组质粒，即抗原识别单元1的慢病毒表达质粒(缩写为pxw-cd47car-intn-sope，重组了cd47-28bb-intn-sope基因)。其中，seqno：9所示的核苷酸编码cd47抗原识别结构域、cd28跨膜结构域、cd28共刺激信号域、4-1bb共刺激信号域，n端剪接域和降解子sope(各组成部分的具体序列参见表1和2)。[0103]用pxw-ef1α-mcs-p2a-egfp进行重组，获得了携带核酸序列seqno：10的pxw-ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp重组质粒，即抗原识别单元2的慢病毒表达质粒(缩写为pxw-cd47car-intn-erm，重组了cd47-28bb-intn-erm基因)。其中，seqno：10所示的核苷酸编码cd47抗原识别结构域、cd28跨膜结构域、cd28共刺激信号域、4-1bb共刺激信号域，n端剪接域和降解子erm(各组成部分的具体序列参见表1和2)。[0104]用pxw-ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2进行重组，获得了携带核酸序列seqno：11的pxw-ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z，即缺氧调控的信号转导单元odd-intc-cd3z的慢病毒表达质粒(缩写为pxw-odd-intc-cd3z，重组了odd-intc-cd3z基因)。其中，seqno：11所示的核苷酸编码缺氧条件信号响应结构域(氧依赖降解结构odd)、c端剪接域和cd3ζ信号传导结构域(各组成部分的具体序列参见表1和2)。[0105]用pxw-ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2进行重组，获得了同时携带核酸序列seqno：9和seqno：11的pxw-ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z(缩写为pxw-cd47car-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z)(各组成部分的具体序列参见表1、2和3)。[0106]用pxw-ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2进行重组，获得了同时携带核酸序列seqno：10和seqno：11的pxw-ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z(缩写为pxw-cd47car-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z)(各组成部分的具体序列参见表1、2和3)。[0107]各个重组质粒图谱如图1所示。[0108]实施例3慢病毒的包装、浓缩和滴度测定[0109]1.1慢病毒的包装[0110]293t细胞处理：转染前24h，收集处于对数生长期的293t细胞，将其接种于10cm细胞培养皿中(6-8×106个细胞)，细胞在含有10ml的完全dmem培养基中生长，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养18-24h，细胞密度达到70-90％即可进行质粒转染。[0111]293t细胞转染：在15ml离心管中加入1ml基础dmem培养基，按照质量比为慢病毒表达质粒：包装质粒(pspax2)：包膜质粒(pmd2.g)＝1：3：1以实施例2中制备的7种质粒配制转染混合液，质粒总量合计15μg/皿。分别以质粒量(μg)：转染试剂(μl)＝1：2的比例加入turbofect转染试剂30μl，室温下孵育15-20min后加至铺有293t细胞的培养皿中，置于37℃、5％co2细胞培养箱中继续培养48h后，收集病毒上清，1000×g，4℃离心10min，弃去管底沉淀并收集病毒上清。[0112]1.2慢病毒的浓缩[0113]使用0.45μm滤器进一步过滤经离心收集的病毒上清，加入1/3病毒上清体积的lenti-x慢病毒浓缩试剂，颠倒混匀数次，4℃下孵育过夜，2000×g，4℃下离心45min，离心管底部可见白色沉淀，即为浓缩后的病毒颗粒。小心弃除上清，以原病毒上清的1/20体积的空白rpmi1640培养基重悬白色沉淀，以250μl分装并于-80℃冻存备用。[0114]1.3慢病毒滴度测定[0115]将jurkatt细胞按照1×105个/孔接种于96孔u底板上，将所收集的慢病毒浓缩液按10倍递增稀释。将100μl的病毒稀释液加入到相应孔中，加入促感染试剂硫酸鱼精蛋白并调整浓度至10μg/ml，1000×g，32℃下离心感染90min，过夜培养后更换新鲜的rpmi1640完全培养基，继续培养48h，流式细胞仪检测荧光阳性细胞比例。采用下面的公式计算病毒滴度：[0116]病毒滴度(tu/ml)＝1×105×荧光阳性细胞比例/100×1000×相应的稀释倍数。[0117]实施例4基因工程化t细胞的制备[0118]实施例3经浓缩获得了以下慢病毒载体：[0119]lv-ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp(由pxw-ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp获得)；[0120]lv-ef1α-cd47-28bbz-odd-p2a-egfp(由pxw-ef1α-cd47-28bbz-odd-p2a-egfp获得)；[0121]lv-ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp(由pxw-ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp获得)；[0122]lv-ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp(由pxw-ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp获得)；[0123]lv-ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2(由pxw-ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2获得)；[0124]lv-ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z(由pxw-ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z获得)；[0125]lv-ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z(由pxw-ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z获得)；[0126]lv-ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z(由pxw-ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z获得)。[0127]分别将上述各种慢病毒载体均以moi＝5加至同一个铺有1×106个预先用等数量的免疫磁珠活化3天的外周血单个核细胞的48孔平底板中，添加促感染试剂硫酸鱼精蛋白并将工作浓度调至10μg/ml，1000×g，32℃下离心感染90min，过夜培养后，更换新鲜的t细胞生长培养基继续培养。[0128]每2-3天添加新鲜的t细胞生长培养基，并调整细胞密度至0.5-2×106个细胞/ml。感染后6-7天，移除活化t细胞的免疫磁珠，继续培养、扩增基因工程化的t细胞，待细胞静息后(磁珠去除后9-14天)进行后续的功能实验。[0129]实施例5降解子融合car分子的表达水平检测[0130]为了验证本发明的降解子的自发降解能力，本实施例在293t细胞中进行了质粒转染实验。[0131]将293t细胞按5×104个细胞/孔铺到48孔板内，待第二天细胞贴壁后进行转染。分别转染0.5μg的重组表达质粒pxw-cd47car、pxw-cd47car-odd、pxw-cd47car-intn-sope或pxw-cd47car-intn-erm，以质粒量(μg)：转染试剂(μl)＝1：2的比例加入turbofect转染试剂，室温下孵育15-20min后加至细胞培养板中，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养48h后检测流式检测细胞膜上car分子的表达情况。结果如图2所示。[0132]图2a示出降解子融合car的结构，降解子sope或erm置于c端，n端剪接域intn连接信号缺失的car分子和降解子。[0133]图2b示出阳性对照cd47car(cd47-28bbz)、氧依赖降解结构域odd融合cd47car(cd47car-odd)和两种降解子融合car的表达水平的流式细胞术检测结果。结果表明，虽然各组间的car阳性率差异不大，但是降解子sope或erm融合car的表达水平显著低于阳性对照cd47car，也低于cd47car-odd。[0134]图2c的统计结果进一步证实，降解子sope或erm融合car的表达水平仅为阳性对照cd47car的10％或7％，自发降解率高达90％或93％，且同样优于氧依赖降解结构域odd融合cd47car的54％降解率。[0135]实施例6条件控制的可剪接系统的剪接活性[0136]采用实施例2构建的慢病毒表达质粒、实施例3的慢病毒载体制备方法获得相应的慢病毒载体。[0137]本实施例在293t细胞中进行了慢病毒载体转导实验并测试条件控制的可剪接系统的剪接活性。分别将上述各种重组慢病毒载体和空载病毒载体(lv-)均以moi＝5单独或混合加至铺有1×106个293t细胞的6孔平底板中，添加促感染试剂多聚凝胺(polybrene)并将工作浓度调至10μg/ml，过夜培养后，更换新鲜的细胞生长培养基继续培养获得了稳定整合1)ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp、2)ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp、3)ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp、4)ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp和缺氧调控的信号传导单元ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z、5)ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp和缺氧调控的信号传导单元ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z、6)ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp和缺氧调控的信号传导单元ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z、7)ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp和ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2(mock)、8)ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp和ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2(mock)、9)ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp和ef1α-bfp-mcs1-hre-mcs2(mock)的9种不同的基因工程化293t细胞。将以上9种基因工程化293t细胞放置于缺氧条件(1％o2)下培养24h，培养结束后收集细胞并用facs缓冲液洗脱1遍，加入2μg/ml流式抗体pe-anti-dykddddk，室温下避光孵育20min，结束后用facs缓冲液洗脱2遍，300μlfacs缓冲液重悬混匀，然后使用流式细胞仪检测car分子表达。另外，稳定整合1)ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp、2)ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp、3)ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp、4)ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp和缺氧调控的信号传导单元ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z、5)ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp和缺氧调控的信号传导单元ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z、6)ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp和缺氧调控的信号传导单元ef1α-bfp-hre-odd-intc-cd3z的6种基因工程化293t细胞分别放置于常氧(21％o2)和缺氧条件(1％o2)下培养24h，培养结束后收集细胞用于蛋白质免疫印迹检测。结果如图3所示。[0138]图3a显示降解子融合car和缺氧调控信号传导单元odd-intc-cd3z的结构及其组成，odd-intc-cd3z由氧依赖降解结构域odd、c端剪接域intc和信号传导域cd3z构成。[0139]图3b的流式检测结果显示，同时整合降解子融合car和缺氧调控的信号传导单元odd-intc-cd3z的工程化细胞于缺氧条件下的car表达水平得到进一步提升，提示缺氧调控的信号传导单元odd-intc-cd3z于缺氧条件下富集并实现降解子融合car的剪接，释放出降解子。[0140]图3c为剪接后的car表达水平的诱导倍数，降解子sope或erm融合car诱导倍数分别为4或5倍，而对照cd47car表达水平并无变化。[0141]图3d的westernblotting结果证实，缺氧条件下降解子融合car和信号传导单元的成功剪接，效率高达100％，缺氧条件(1％o2)下实现完全剪接，获得分子量小于未剪接分子的单一条带。[0142]实施例7条件控制的可剪接系统调控嵌合抗原受体的表达[0143]采用实施例2构建的慢病毒表达质粒、实施例3的慢病毒载体制备方法和实施例4所述的基因工程化t细胞的制备方法制备稳定整合ef1α-cd47-28bbz-p2a-egfp、ef1α-cd47-28bb-intn-sope-p2a-egfp、ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z、ef1α-cd47-28bb-intn-erm-p2a-egfp或ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z基因的5种工程化t细胞。将以上5种基因工程化t细胞分别置于常氧(21％o2)或缺氧条件(1％o2)下培养24h，结束后收集细胞并用facs缓冲液洗脱1遍，加入2μg/ml流式抗体pe-anti-dykddddk，室温下避光孵育20min，结束后用facs缓冲液洗脱2遍，300μlfacs缓冲液重悬混匀，然后使用流式细胞仪检测her2car分子的表达。结果如图4所示。[0144]图4a流式检测结果显示，常氧和缺氧条件下阳性对照cd47car-t细胞(cd47-28bbz)均高表达cd47car分子，而条件控制的可剪接系统调控的car分子于常氧环境下低表达，而在缺氧环境下诱导表达，特别是稳定整合ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z的工程化t细胞。[0145]图4b的统计结果证实，降解子sope或erm融合car在常氧下的阳性率分别为阳性对照的46％或24％，表达水平更是降低至对照的4％或2％，而在缺氧条件下显著上调，诱导倍数分别为9或3倍，提示基于降解子sope的条件控制的可剪接系统活性更佳。[0146]实施例8条件控制的可剪接系统调控嵌合抗原受体t细胞的肿瘤细胞杀伤[0147]肿瘤细胞杀伤效率由基于荧光素酶的细胞杀伤检测方法(luciferase-basedcytotoxicityassay)进行评估。首先，将1×104个skov3-luc(萤火虫荧光素酶基因修饰的人卵巢癌细胞)或nci-h292-luc(萤火虫荧光素酶基因修饰的人肺癌细胞)接种于96孔平底黑板上，每孔100μl培养基，置于37℃、5％co2细胞培养箱中培养18h。第二天，以效应细胞：靶细胞为1：4(0.25)、1：2(0.5)、1：1(1)或2：1(2)的比例加入实施例7制备的基因工程化t细胞及同期培养的未转导t细胞至含有靶细胞的孔中，分别置于常氧条件(21％o2)或缺氧条件(1％o2)下培养24h，共培养结束后使用微孔板发光检测仪检测靶细胞的荧光素酶活力值。结果如图5所示。[0148]细胞杀伤率的计算公式见下式：[0149]细胞杀伤率(％)＝(未转导t细胞组荧光素酶活力值-实验组荧光素酶活力值)/未转导t细胞组荧光素酶活力值×100[0150]cd47car-t细胞(阳性对照)在常氧或缺氧条件下均能有效杀伤skov3(图5a)和nci-h292肿瘤细胞(图5b)，并无明显的选择杀伤特性。[0151]条件控制的可剪接系统调控的cd47car-t细胞在常氧条件下的肿瘤杀伤活性较低，基于sope的条件控制的可剪接系统调控的cd47car-t细胞在效应细胞：靶细胞为1：1时的杀伤率为3％(skov3)和6％(nci-h292)，缺氧环境下则能选择性高效杀伤skov3肿瘤细胞(84％)和nci-h292肿瘤细胞(96％)，肿瘤细胞杀伤活性提升了28倍和16倍。基于erm的条件控制的可剪接系统调控的cd47car-t细胞在效应细胞：靶细胞为1：1时的杀伤率为3％(skov3)和6％(nci-h292)，缺氧环境下则能选择性高效杀伤skov3肿瘤细胞(58％)和nci-h292肿瘤细胞(96％)，肿瘤细胞杀伤活性提升了19倍和16倍。[0152]实施例9条件控制的可剪接系统调控的car-t细胞的体内抗肿瘤作用[0153]提前一天对无菌隔离器饲养的b-ndg小鼠进行背部局部脱毛，脱毛可以使用脱毛膏或动物剃毛器，使其暴露出肿瘤细胞接种部位的皮肤即可。左手固定小鼠，即左手同时抓紧小鼠的头部、颈部和背部皮肤，使其背部朝左翻，充分暴露背部右侧剃毛部位后，右手用酒精棉球对其进行消毒处理。1ml胰岛素注射器吹打混匀预先准备好的nci-h292肿瘤细胞后吸取125μl细胞悬液(5×106个肿瘤细胞)，将针头以针尖与皮肤呈30°‑40°角度斜着刺入小鼠皮下，缓慢推注细胞悬液，避免细胞溢漏。待125μl细胞悬液注射完毕，留针2-3秒后迅速拔出，可见注射部位的皮下鼓起一个清晰可见的小包。细胞接种后每隔2-3天观察小鼠的成瘤情况和健康状态，成瘤后用游标卡尺测量基线肿瘤体积并进行后续实验。[0154]分别于肿瘤细胞接种后第五天和第十一天静脉或瘤内注射5×106个条件控制的可剪接系统调控的car-t细胞和阴性对照t细胞(utd)，每隔2-3天测量肿瘤大小，用游标卡尺分别测量肿瘤的长径和短径。结果如图6所示。[0155]肿瘤体积的计算公式如下：体积＝(长径×短径2)/2。[0156]静脉回输和瘤内注射条件控制的可剪接系统调控的car-t细胞均能有效控制肺癌的生长，相对于utd治疗组，基于降解子sope的条件控制的可剪接系统调控的car-t细胞(稳定整合ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-sope-hre-odd-intc-cd3z或ef1α-bfp-cd47-28bb-intn-erm-hre-odd-intc-cd3z)抑瘤效果更加显著，细胞回输后一个月的肿瘤抑制率分别为72.1％(静脉回输)和85.6％(瘤内注射)。[0157]以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已经以优选实施例揭示如上，然而其并非用以限定本发明。任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰以获得等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何修改、等同变化与修饰，均仍落入本发明技术方案的范围内。当前第1页12当前第1页12
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
