一种基于S-TET蛋白表达系统的细胞合胞体病变模型及其制备方法与流程

一种基于s
‑
tet蛋白表达系统的细胞合胞体病变模型及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于s
‑
tet蛋白表达系统的细胞合胞体病变模型及其制备方法。


背景技术：

2.冠状病毒刺突蛋白(s蛋白)在病毒侵入细胞和感染细胞合胞体形成中起着重要作用；现有的研究方法和手段是通过假病毒感染或瞬时转染来实现；也有直接利用新冠病毒本身在bsl3实验室中实施。目前，尚无成功利用表达刺突蛋白的稳转细胞系进行冠状病毒感染研究的报道。
3.当前实验室中使用的所有研究s蛋白的方法和技术都无法达到高通量药物筛选的目的，因此无法用于快速筛选抗新冠病毒药物。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于s
‑
tet蛋白表达系统的细胞合胞体病变模型及其制备方法。
5.由于新冠病毒(sars cov
‑
2)的s蛋白会引起严重的细胞病变效应(cpe)，最终导致细胞死亡，因此，常用的转基因方法无法建立既有s蛋白高表达又能稳转的细胞系，此外，由于病毒侵染细胞有受体介导和非受体介导，以及内吞等多种复杂方式，致使研发冠状病毒侵入或与细胞融合的抑制剂面临更复杂化的挑战。为了简化其复杂性，高通量地筛选抗新冠病毒入侵和抑制已感染的细胞病变，我们发明了一种由四环素调控(tet
‑
on/off)蛋白表达的细胞模型，即s
‑
tet
‑
on/off的稳转细胞系。刺突蛋白(s蛋白)只能在添加四环素的条件下(tet
‑
on)大量表达。
6.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种基于s
‑
tet蛋白表达系统的细胞合胞体病变模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.s1.将编码新型冠状病毒s蛋白dna序列连接到含有tet on调控因子的慢病毒表达载体中，再将该表达载体和病毒包装辅助质粒共转染细胞，得到重组慢病毒；
8.s2.用所述重组慢病毒转导vero e6细胞，筛选获得由tet on调控表达s蛋白的稳转细胞株，即所述细胞合胞体病变模型；
9.所述s蛋白dna序列经过密码子优化策略优化修饰，并在上游添加了kozak consensus序列，起始密码子atg之后添加了一个丙氨酸密码子gcc，所述s蛋白dna序列的核苷酸序列如seq id no：2所示或其功能等价物，所述功能等价物与seq id no：2具有至少90％的同一性。
10.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述制备方法还包括步骤s3，所述步骤s3为将盐酸多西环素加入生长所述细胞合胞体病变模型的培养基中，诱导s蛋白大量表达，从而产生细胞融合体病变现象。
11.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述tet on调控因子的核苷酸序列如seq id no：5所示。
12.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述筛选为：所述慢病毒表达载体上含有嘌呤霉素的抗性基因，在培养基中加入嘌呤霉素进行筛选。
13.作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述慢病毒表达载体为plent
‑
tre3g
‑
hpgk
‑
rtta
‑
sv40
‑
puro。
14.本发明同时提供所述制备方法制备得到的细胞合胞体病变模型。
15.本发明还提供所述的细胞合胞体病变模型在筛选和鉴定抗新冠病毒药物中的应用。
16.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述筛选为通过观察细胞融合的程度变化，判断被筛选的药物在s蛋白与其相应的细胞受体蛋白ace2结合导致的细胞融合过程中是否对细胞起到保护作用。
17.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述细胞融合为在盐酸多西环素的诱导下快速大量生产s蛋白而产生。
18.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述盐酸多西环素的浓度为0.1
‑
1μg/ml。
19.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述s
‑
tet蛋白表达系统也适于采用tet off设计，使s蛋白表达仅仅在除去盐酸多西环素的调控下产生。由于常用牛血清混有残余的四环素，如用tet
‑
on调控s蛋白，必须使用特制的无四环素血清。而tet off设计则可消除血清中残余四环素的干扰，降低病变模型的实施成本。
20.本发明的有益效果：
21.(1)本发明提供了一种基于tet on系统，以vero e6细胞为背景，表达新型冠状病毒刺突蛋白(s)的稳转细胞系。该细胞系在含有嘌呤霉素的基础培养基中，可正常生长并稳定传代。一旦在培养基中加入微量的四环素类似物
‑
盐酸多西环素(doxycycline hydrochloride，dox)，tet on系统被激活，s基因即可转录并翻译产生大量的s蛋白。此系统s tet on稳转细胞系将为新型冠状病毒抗体和相关抗病毒药物的研发，以及病毒学研究提供理想的研究平台。
22.(2)本发明验证了用慢病毒转导vero e6细胞获得的s tet on稳转细胞系，可在生物安全2级实验室(bsl
‑
2)大量的培养增殖；验证了s tet on细胞系可在低剂量四环素类似物的诱导下迅速大量地表达刺突蛋白(s)；验证了不具致病性的s tet on细胞系在特定培养条件下，具有刺突蛋白的基本特点和免疫原性。
附图说明
23.图1：gfp tet on细胞经dox诱导24h后，大量gfp蛋白在蓝光下激发出绿色荧光，表明tet on系统可有效调控gfp蛋白的表达。
24.图2：s tet on细胞经dox诱导8h、16h、24h和32h后形成胞合体。
25.图3：s tet on细胞经dox诱导产生s蛋白。
26.图4：s tet on细胞经dox诱导，s蛋白大量表达时，细胞骨架蛋白tubulin的表达急剧下降甚至消失，表明细胞间出现合胞体现象。
27.图5：基础慢病毒表达载体plent
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tre3g
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hpgk
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rtta
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sv40
‑
puro的图谱。
28.图6：扩增后的目的片段结构图。
具体实施方式
29.为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
30.实施例1s tet on稳转细胞系的构建
31.s tet on稳转细胞系(对照组：gfp tet on稳转细胞系)的构建包括：tet on诱导型s蛋白慢病毒表达载体构建，慢病毒包装，慢病毒转导vero e6细胞，s tet on细胞系筛选，盐酸多西环素(dox)诱导gfp tet on细胞系表达gfp蛋白，dox诱导s tet on细胞表达s蛋白，dox诱导s tet on单克隆细胞系表达s蛋白以及细胞合胞体病变模型的建立。具体步骤如下：
32.(1)从ncbi数据库内获得s蛋白的dna序列信息，并人工合成经密码子优化修饰的s蛋白的dna片段，密码子优化修饰后的s蛋白的dna片段的核苷酸序列如seq id no：1所示。密码子优化后的s蛋白核苷酸序列与新冠病毒武汉株(ncbi数据库accession nc_045512region：21563..25384)的序列相比，同一性(identity percentage)为72％，而两者之间蛋白序列仍保持100％同一性。本发明将病毒刺突蛋白基因进行密码子优化可以达到以下目的：
①
提高生物安全性，彻底杜绝因同源重组产生病毒dna对人dna的“污染”；
②
提高s蛋白在稳转细胞中的表达。
33.(2)为了提高s蛋白表达效率，在s蛋白的dna片段上游添加了kozak consensus序列，kozak consensus序列的dna序列为：gccaccatgg。因为kozak序列中最后的g( 4位g)在翻译过程中对核糖体识别mrna阅读框起始位点具有重要作用，所以，在s蛋白的dna片段的起始密码子atg之后添加了一个丙氨酸密码子gcc。丙氨酸是最小的脂肪族氨基酸之一，其甲基侧链具无反应性，几乎从不直接参与任何蛋白功能，故排除了新增丙氨酸对病毒s蛋白产物的蛋白功能造成影响的可能性，或将之降至最低。最后得到的目的片段的核苷酸序列如seq id no：2所示。
34.(3)将步骤(2)中得到的目的片段连接到含有tet on调控系统的慢病毒表达载体中，再经与慢病毒包装辅助质粒共转染，获得tet on诱导型s蛋白表达的重组慢病毒。
35.为构建由tet
‑
on系统调控的，能将目的dna片段(编码s蛋白)稳定整合在宿主细胞基因组中以确保s蛋白长期表达的转基因载体，本发明采用了慢病毒转导设计。选用的基础载体为慢病毒表达载体plent
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tre3g
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hpgk
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rtta
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sv40
‑
puro(维真生物科技有限公司，http://www.weizhenbio.cn/cloneserviceztdetail.php？id＝122&pid＝11&cid＝&fk＝1)。
36.该基础载体的质粒图谱参见图5，该载体中与本发明直接相关的元件有：
37.1)tre3g(四环素反应元件3g启动子，genbank accession number：mn044710.1)，该诱导型启动子通过调控目标蛋白s的mrna转录水平，使s蛋白表达量从非常低的基础表达转为诱导后的最大量表达。该元件核苷酸序列如seq id no：4所示；
38.2)rtta(反向四环素控制的反式激活因子，即tet on调控因子，genbank accession number：u89930.1)，其核苷酸序列如seq id no：5所示。
39.该基础载体所含其它重要元件是：
40.1)puro(嘌呤霉素)，用于抗性细胞的筛选；
41.2)wpre(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)，用于增强转基因的表达；以下为慢病毒转导系统的基本元件：
42.3)cppt(中央多嘌呤束)，可增进载体的整合及转导效率；
43.4)psi(psi(ψ)序列)，是rna四茎环高级结构，对提高转基因效率起关键作用；
44.5)5’ltr和3’ltr(5’和3’长末端重复序列)，能促进转移质粒序列整合到宿主基因组中。
45.重组载体构建的具体步骤是，设计含有酶切位点bamhi和mlu i的引物，对步骤(2)中得到的目的片段进行扩增，扩增后的产物的核苷酸序列如seq id no：3所示(见图6)，随后用bamhi和mlu i酶分别对扩增后的产物以及载体plent
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tre3g
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hpgk
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rtta
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sv40
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puro进行酶切，然后连接得到重组慢病毒表达载体。
46.慢病毒包装步骤简述如下：将上述制备得到的含有tet on调控的s蛋白慢病毒表达载体和慢病毒包装质粒(pspax2)、包膜质粒(pmd2g)混合物共转染hek293t细胞，培养72小时后，从上清培养基收集慢病毒颗粒，并作病毒滴度测定。具体细节请参见http://www.weizhenbio.cn/usefavoritedetail.php？id＝2&pid＝20&cid＝22。
47.(4)在慢病毒转导的前一日将vero e6细胞铺种在10cm的细胞培养皿内，按moi＝1加入1.5ml含慢病毒的基础培养基(基础培养基刚好漫过细胞表层)；以50ml为例，基础培养基配方如下：10％fbs，1％p/s和dmem/hg；(gfp tet on为对照)。
[0048][0049]
(5)8h后移去细胞表层含慢病毒的基础培养基，并加入8ml基础培养基，37℃，5％co2培养细胞；
[0050]
(6)2天后移去基础培养基，加入筛选培养基(含16μg/ml嘌呤霉素的基础培养基)，筛选一周左右，获得阳性s tet on稳转细胞，期间每隔2
‑
3天更换一次培养基；
[0051]
试剂manufacturecat.no.贮存standard嘌呤霉素solarbiop8230
‑
20℃25mg
[0052]
(7)在10cm细胞平皿内种1000个s tet on细胞，37℃，5％co2培养1个月左右，挑取单克隆细胞放大培养；
[0053]
(8)在筛选培养基中加入诱导剂，即0.1
‑
1μg/ml的四环素类似物
‑
盐酸多西环素(dox)，诱导培养s tet on细胞在37℃，5％co2的条件下进行培养；
[0054][0055]
[0056]
(9)细胞诱导培养8h后开始在显微镜下观察s tet on细胞的生长状态；
[0057]
(10)收集被诱导不同时间段的s tet on细胞总蛋白，western blot验证s蛋白的表达；
[0058]
(11)收集诱导培养24h时的s tet on单克隆细胞总蛋白，western blot验证s蛋白的表达。
[0059]
实施例2：gfp tet on细胞系经0.1
‑
1μg/ml盐酸多西环素(dox)诱导培养24h,表达了gfp绿色荧光蛋白
[0060]
研究对象：gfp tet on细胞系
[0061]
具体实验步骤如下：
[0062]
(1)数据库内获得gfp及表达载体的dna序列信息；
[0063]
(2)将gfp序列整合到tet on系统中，并将改造好的tet on系统包装成慢病毒；
[0064]
(3)gfp tet on稳转细胞筛选方法与上述s tet on稳转细胞株方法相同；
[0065]
(4)在生物安全柜内将六孔板内gfp tet on细胞原有的培养基移去，每孔加入2.5ml提前预热的含0.1μg/ml或1μg/ml dox，记录此时为诱导时间的0h；
[0066]
(5)dox诱导24h时显微镜下观察细胞是否有gfp tet on的绿色荧光信号(gfp由蓝光激发呈现绿色)(图1)；
[0067]
(6)分析数据及结果。
[0068]
结果如图1所示，表明：
[0069]
(1)四环素类似物
‑
盐酸多西环素(dox)(0.1
‑
1μg/ml)可激活tet on系统，gfp蛋白表达，细胞在蓝光下激发出绿色荧光。
[0070]
(2)加入筛选培养基的诱导剂1μg/ml dox，24h时，大量的gfp蛋白产生，所以dox的工作浓度定为1μg/ml。
[0071]
实施例3：s tet on细胞系在1μg盐酸多西环素(dox)的诱导下发生细胞融合，即形成合胞体。
[0072]
研究对象：s tet on细胞系
[0073]
实验步骤：
[0074]
(1)六孔板内铺种s tet on细胞4.0x 10^5cells/孔，2.5ml筛选培养基37℃，5％co2过夜培养；另一实验，同法铺种s tet on和gfp tet on两种细胞，以1：1比例混合。
[0075]
(2)在生物安全柜内移去六孔板内s tet on细胞原有的筛选培养基，每孔加入2.5ml提前预热的含1μg/ml dox，记录此时为诱导的0h；
[0076]
(3)分别在加入dox诱导的8h、16h、24h和32h镜下观察细胞的生长状态，并拍照记录；分析数据及结果。
[0077]
结果如图2所示，表明：
[0078]
(1)s tet on细胞在加入诱导培养基8h时开始观察到细胞发生融合反应，说明1μg/ml dox激活了tet on系统，启动表达s蛋白，而后s蛋白与细胞表面的ace2结合诱使细胞发生融合反应。
[0079]
(2)随着dox诱导时间的延长，细胞间的融合现象加剧，细胞膜破裂，培养皿底部出现大片的空斑；这为以后利用该细胞模型做药物筛选提供了一个非常直观的检测指标：通过镜下观察细胞融合的程度变化，判断药物在s蛋白攻击细胞的过程中是否对细胞起到保
2h；转膜，200mm 150min；封闭，4℃过夜；
[0101]
(17)室温孵育一抗1h；其中抗体稀释比例为：anti
‑
s(～180kda)抗体，1：1000；anti
‑
gapdh(37kda)抗体，1：500；
[0102]
(18)洗脱一抗，加洗脱液1x tbst(0.05％tween 20)振荡洗涤10min，重复3次；
[0103]
(19)室温孵育二抗1h，其中针对anti
‑
s：用anti
‑
mouse(1：5000)，针对anti
‑
gapdh：用anti
‑
rabbit(1：5000)；
[0104]
(20)洗脱二抗，1x tbst(0.05％tween 20)振荡洗涤10min，重复3次；
[0105]
(21)显影检测，将pvdf膜置于显影液中振荡浸泡2min后，在显影仪曝光显影，其中显影液配制为：溶液i：溶液ii：水＝1：1：2；
[0106]
(22)分析数据及结果。
[0107]
一抗：sars
‑
cov
‑
2(2019
‑
ncov)nucleocapsid antibody,rabbit pab,antigen affinity purified(manufacture：sino biological；cat:40588
‑
t62)(1:1000)
[0108]
gapdh抗体(manufacture：santa；cat:sc32233)(1:500)
[0109]
二抗：goat anti
‑
rabbit igg(h l),hrp conjugate(manufacture：trans；cat:hs101
‑
01)(1:5000)
[0110]
goat anti
‑
mouse igg(h l),hrp conjugate(manufacture：trans；cat:hs201
‑
01)(1:5000)
[0111]
结果如图3所示，表明：
[0112]
(1)1μg/ml dox诱导s tet on细胞表达s蛋白，该实验结果与实施例3的实验结果一致；
[0113]
(2)s tet on细胞经1μg/ml dox诱导8小时开始表达s蛋白，并且s蛋白表达量随诱导的时间增加而升高，24h后s蛋白表达量最高；但在dox诱导的32h时，全长的s蛋白表达量减少，s1蛋白表达量上调，说明在32小时诱导后，大量的s蛋白发生自我剪切，产生110kda的s1亚蛋白片段。
[0114]
实施例5：western blot证实dox诱导s tet on单克隆细胞表达s蛋白。
[0115]
研究对象：s tet on单克隆细胞系
[0116]
具体实验步骤如下：
[0117]
(1)在生物安全柜内将1000个s tet on细胞种到10cm细胞培养皿内，加入8
‑
10ml筛选培养基(含5μm筛选药物y27632)；
[0118]
(2)37℃5％co2培养；
[0119]
(3)待能肉眼看到平皿内的单克隆细胞(约1个月左右)，将单克隆挑入96孔板内，加200μl筛选培养基，37℃5％co2培养；
[0120]
(4)待单克隆细胞铺满孔底面积的80％以上，将细胞消化后转至48孔板培养，而后依次放大培养至24孔板，12孔板，6孔板，6cm平皿及10cm平皿；
[0121]
(5)6孔板细胞内铺种4.0x 10^5cells/孔，2.5ml筛选培养基37℃，5％co2过夜培养；
[0122]
(6)在生物安全柜内将6孔板内s tet on细胞原有的筛选培养基移去，每孔加入2.5ml提前预热的含1μg/ml dox，记录此时为诱导的0h；
affinity purified(manufacture：sino biological；cat:40588
‑
t62)(1:1000)
[0147]
anti
‑
gapdh抗体(manufacture：santa；cat:sc32233)(1:500)anti
‑
β
‑
tubulin mouse monoclonal antibody(manufacture：trans；cat:hc101
‑
02)(1:1000)
[0148]
二抗：goat anti
‑
rabbit igg(h l),hrp conjugate(manufacture：trans；cat:hs101
‑
01)(1:5000)
[0149]
goat anti
‑
mouse igg(h l),hrp conjugate(manufacture：trans；cat:hs201
‑
01)(1:5000)
[0150]
结果如图4所示，表明：
[0151]
(1)含1μg/ml dox的诱导培养基培养s tet on单克隆细胞24h，s蛋白大量表达；
[0152]
(2)当细胞内s蛋白大量表达时，细胞骨架蛋白tubulin的表达急剧下降至消失，表明细胞间出现合胞体现象。
[0153]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
[0154]
参考文献
[0155]
biorxiv preprint doi:https://doi.org/10.1101/2020.03.16.994152；this version posted march 17,2020。