异源合成人参皂苷F2的重组酿酒酵母及其构建方法与流程

异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母及其构建方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母及其构建方法及应用。


背景技术：

2.人参皂苷f2(简称为f2)属于人参二醇型皂苷，是rb1、rb2、rc和rd等失去若干糖基代谢降解形成的次级皂苷之一，皂苷元的c-3位和c-20位均为glc糖基。f2是一种白色粉末，在人参中含量极其微少，仅存在于人参茎叶皂苷中，但其在抑制肿瘤、抗氧化等方面具有突出的效果，且由于尺寸较小，亲水性好，细胞膜渗透性强，生物利用度高，在人体中的吸收利用率高达70％，在抑制肿瘤、细胞保护、抑制肥胖、抗炎症等医药领域前景优良。
3.虽然f2具有很高的药用价值，但由于天然产量很少，制备技术方面存在空白，因此利用合成生物学相关技术构建细胞工厂，通过生物法获取高纯度高产量的f2对医药研发和传统药食资源开发利用都具有重要意义。近年来，采用合成生物学技术异源合成了一些天然产物，但在微生物中高产量异源合成人参皂苷f2还未见报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是克服现有技术的不足，提供第一种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母。
5.本发明的第二个目的是提供第二种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母。
6.本发明的第三个目的是提供第三种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母。
7.本发明的第四个目的是提供第一种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母的构建方法。
8.本发明的第五个目的是提供第二种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母的构建方法。
9.本发明的第六个目的是提供第三种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母的构建方法。
10.本发明的第七个目的是提供第一种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷f2的应用。
11.本发明的第八个目的是提供第二种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷f2的应用。
12.本发明的第九个目的是提供第三种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷f2的应用。
13.本发明的技术方案概述如下：
14.第一种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：
15.将优化后的糖基转移酶gtk1基因和优化后的糖基转移酶ugt1基因转入生产原人参二醇ppd的酿酒酵母，得到第一种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母；
16.所述优化后的糖基转移酶gtk1基因的核苷酸序列以seq id no.1所示；
17.所述优化后糖基转移酶ugt1基因的核苷酸序列以seq id no.2所示。
18.第二种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：
19.敲除上述第一种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母的二酰基甘油酰基转移酶dga1基因并过表达二酰甘油激酶dgk1基因，得到第二种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母；
20.所述二酰基甘油酰基转移酶dga1基因的核苷酸序列以seq id no.3所示；
21.所述二酰甘油激酶dgk1基因的核苷酸序列以seq id no.4所示。
22.第三种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母的构建方法，包括如下步骤：
23.敲除上述第二种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母的β-葡萄糖水解酶egh1基因，过表达磷酸葡萄糖变位酶pgm1基因和udp葡萄糖焦磷酸化酶ugp1基因，得到第三种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母；
24.所述β-葡萄糖水解酶egh1基因的核苷酸序列以seq id no.5所示；
25.所述磷酸葡萄糖变位酶pgm1基因的核苷酸序列以seq id no.6所示；
26.所述udp葡萄糖焦磷酸化酶ugp1基因的核苷酸序列以seq id no.7所示。
27.第一种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母的构建方法构建的第一种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母。
28.第二种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母的构建方法构建的第二种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母。
29.第三种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母的构建方法构建的第三种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母。
30.第一种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷f2的应用。
31.第二种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷f2的应用。
32.第三种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母发酵生产人参皂苷f2的应用。
33.本发明的优点：
34.本发明成功构建了三种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母。实验证明，本发明的异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母发酵得到人参皂苷f2，重组菌1、2、3的人参皂苷f2产量依次为15.5mg/l，20.15mg/l与44.83mg/l。
附图说明
35.图1.酿酒酵母胞内代谢产物分析。其中a为f2标准品和重组菌1代谢产物液相图；b为f2标准品和重组菌1代谢产物中f2的质谱图。
具体实施方式
36.下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。
37.生产原人参二醇ppd的酿酒酵母，选用中国专利号201410735927.x，发明名称为：一种能提高达玛烯二醇转化效率的融合蛋白质及构建方法及应用中实施例3获得的“合成原人参二醇的酵母菌株w3a”，在本案中简称“酿酒酵母w3a”。
38.其它包括达玛烯二醇合酶ds、原人参二醇合酶ppds及细胞色素p450酶还原酶
ypd液体培养基，30℃，220rpm摇床进行复苏培养2h；将复苏好的离心管在4000rpm转速下离心3min，弃去上层培养基，再用1ml无菌水洗涤两次；最后向含有菌体的离心管中加入200μl的无菌水并混匀，涂布于缺尿嘧啶的sc培养基平板上，放置于30℃恒温培养箱中培养2天，待单菌落长出，筛选获得重组菌1。
50.实施例2第二种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母菌株(简称重组菌2)的构建方法
51.敲除重组菌1的二酰基甘油酰基转移酶dga1基因并过表达二酰甘油激酶dgk1基因获得重组菌2，所述二酰基甘油酰基转移酶dga1基因核苷酸序列如seq id no.3所示；所述二酰甘油激酶dgk1的核苷酸序列以seq id no.4所示。
52.(1)二酰甘油激酶dgk1基因表达模块构建
53.以酿酒酵母atcc208352基因组为模板，
54.利用dga1-f(seq id no.22)
55.与tef1-dga1-r(seq id no.23)pcr扩增dga1l片段，利用dga1-tef1-f(seq id no.24)与dgk1-tef1-r(seq id no.25)pcr扩增p
tef1
片段，利用tef1-dgk1-f(seq id no.26)与cyc1-dgk1-r(seq id no.27)pcr扩增dgk1片段，利用dgk1-cyc1-f(seq id no.28)与bleo-cyc1-r(seq id no.29)pcr扩增t
cyc1
片段；以psh65质粒(购买自武汉淼灵生物科技有限公司)为模板，利用cyc1-bleo-f(seq id no.30)与dga1-bleo-r(seq id no.31)pcr扩增bleo片段；以酿酒酵母atcc208352基因组为模板，利用bleo-dga1-f(seq id no.32)与dga1-r(seq id no.33)pcr扩增dga1r片段。将扩增得到的dga1l，p
tef1
，dgk1，t
cyc1
，bleo与dga1r片段融合，获得dga1l-p
tef1-dgk1-t
cyc1-bleo-dga1r表达模块。
56.(2)酿酒酵母转化，按照实施例1步骤(2)的转化方法，将步骤(1)中获得的dga1l-p
tef1-dgk1-t
cyc1-bleo-dga1r表达模块转化入重组菌1中，重组菌涂布于博来霉素的ypd平板上进行筛选，获得重组菌2。
57.实施例3第三种异源合成人参皂苷f2的重组酿酒酵母(简称重组菌3)的构建方法
58.在重组菌2中敲除β-葡萄糖水解酶egh1基因，过表达磷酸葡萄糖变位酶pgm1和udp葡萄糖焦磷酸化酶ugp1基因，得到重组菌3。
59.所述β-葡萄糖水解酶egh1的核苷酸序列以seq id no.5所示；
60.所述磷酸葡萄糖变位酶pgm1的核苷酸序列以seq id no.6所示；
61.所述udp葡萄糖焦磷酸化酶ugp1的核苷酸序列以seq id no.7所示；
62.(1)磷酸葡萄糖变位酶pgm1和udp葡萄糖焦磷酸化酶ugp1表达模块构建
63.以酿酒酵母atcc208352基因组为模板，利用egh1l-f(seq id no.34)与pgk1-egh1l-r(seq id no.35)pcr扩增egh1l片段，利用egh1-pgk1-f(seq id no.36)与pgm1-pgk1-r(seq id no.37)pcr扩增p
pgk1
片段，利用pgk1-pgm1-f(seq id no.38)与pgm2t-pgm1-r(seq id no.39)pcr扩增pgm1片段，利用pgm1-pgm2t-f(seq id no.40)与tdh3-pgm2t-r(seq id no.41)pcr扩增t
pgm2
片段，利用pgm2t-tdh3-f(seq id no.42)与ugp1-tdh3-r(seq id no.43)pcr扩增p
tdh3
片段，利用tdh3-ugp1-f(seq id no.44)与ade2-ugp1-r(seq id no.45)pcr扩增ugp1-t
ugp1
片段；以酿酒酵母atcc 4040002基因组为模板，利用ugp1-ade2-f(seq id no.46)与egh1-ade2-r(seq id no.47)pcr扩增ade2片段，利用ade2-egh1r-f(seq id no.48)与egh1r-r(seq id no.49)pcr扩增egh1r片段。将扩增得到的
egh1l，p
pgk1
，pgm1，t
pgm2
，p
tdh3
片段融合，获得egh1l-p
pgk1-pgm1-t
pgm2-p
tdh3
模块，将ugp1-t
ugp1
，ade2，egh1r片段融合，获得ugp1-t
ugp1-ade2-egh1r表达模块。
64.(2)酿酒酵母转化
65.按照实施例1步骤(2)的转化方法，将本实施例步骤(1)中获得的egh1l-p
pgk1-pgm1-t
pgm2-p
tdh3
与ugp1-t
ugp1-ade2-egh1r表达模块转化入重组菌2中，利用缺失腺嘌呤的sc平板进行筛选，获得重组菌3。
66.实施例4重组菌的发酵过程和代谢物的提取与测定
67.(1)重组菌的发酵过程与代谢物提取
68.以所构建的各个重组菌进行微生物发酵，检测胞内代谢产物中人参皂苷f2的生成。
69.将构建的各重组菌株单菌落接种于2ml ypd液体培养基中30℃，200rpm过夜培养。取适量种子液接种于盛有50ml ypd液体培养基的摇瓶中，使发酵液初始od为0.1，进行为期4天的发酵。发酵结束后向1ml发酵液中加入400μl正丁醇和与菌体体积相当的石英砂，涡旋震荡30分钟，12000rpm离心10分钟，收集上层有机相，0.22μm滤膜过滤后用于hplc分析。若有机相提取液中浓度过低，则增加发酵液的体积，用乙酸乙酯萃取多次后合并有机相，蒸干后用400μl正丁醇溶解，进行hplc-ms分析，检测结果，见图1(图1b中的f2为人参皂苷f2的简称)。
70.(2)代谢产物的hplc-ms测定
71.色谱条件：使用hypersil c18色谱柱(4.6mm
×
250mm，5μm；elite analytical instruments co.，ltd.，中国大连)进行hplc分析，检测波长为203nm，柱温50℃，流动相条件为：0-40min，40-100％乙腈；40-45min，100％乙腈。制作人参皂苷f2浓度的标准曲线用于定量分析菌株代谢物中人参皂苷f2的产量。
72.质谱条件：信号源类型，esi；离子极性，正；所有光谱都是在50/1200的m/z范围内获得的；干气流，6.0l/min；干燥温度180℃；雾化器压力为0.8bar；探头电压 4.5kv
73.(3)测定结果
74.重组菌1、2、3中人参皂苷f2产量依次为15.5mg/l，20.15mg/l与44.83mg/l。
75.(4)实施例所用培养基
76.ypd液体培养基：葡萄糖终浓度为20g/l，酵母浸粉终浓度为10g/l，蛋白胨终浓度为20g/l，以蒸馏水配制。ypd固体培养基则在ypd液体培养基中加20g/l的琼脂粉。
77.sc培养基：葡萄糖终浓度为2g/l，无氨基酵母氮源(ynb)终浓度为6.7g/l，氨基酸混合物终浓度为0.2g/l，20g/l的琼脂粉,以蒸馏水配制，缺失氨基酸混合物指去掉氨基酸混合物中的对应成份。
78.氨基酸混合物：甘氨酸，2.0g；丙氨酸，2.0g；甲硫氨酸，2.0g；赖氨酸，2.0g；精氨酸，2.0g；丝氨酸，2.0g；天冬酰胺，2.0g；天冬氨酸，2.0g；苯丙氨酸，2.0g；半胱氨酸，2.0g；脯氨酸，2.0g；酪氨酸，2.0g；谷氨酸，2.0g；缬氨酸，2.0g；苏氨酸，2.0g；丝氨酸，2.0g；异亮氨酸，2.0g；肌醇，2.0g；谷酰胺，2.0g；对氨基苯甲酸0.2g；腺嘌呤，0.5g；亮氨酸10g；甲硫氨酸，2g；色氨酸，2g；组氨酸，2g；尿嘧啶，2g。