一种多粘类芽孢杆菌菌剂、制备方法及其应用与流程

1.本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种多粘类芽孢杆菌菌剂、制备方法及其应用。


背景技术：

2.藏红花(crocus sativus l.)又称西红花，仅以雌蕊上部三根红色柱头入药，产量较低，素有“红色金子”之称，具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神功效，是传统名贵中药材，也是世界上最名贵香料和染料。藏红花是异源三倍体，只开花不结种，生产上只能靠球茎无性繁殖，因此，球茎产量和质量直接影响藏红花的产量和质量。藏红花原产于地中海地区，现伊朗是主产区，其产量占世界总产量90％以上。我国于1986年在上海崇明岛引种成功，目前浙江为主产区，种植面积约0.6万亩，约占全国的50％以上， 2018年藏红花被评为新“浙八味”。但不同于主产地地中海气候，我国江浙地区夏季温热潮湿，地下球茎很容易受病原菌侵染生病腐烂，因此在5月初新球茎成熟时挖出放置室内培育半年直至开花，12月室内采花结束后种田里繁育球茎的“二段式”栽培方法。但即使在室内期间，藏红花腐烂病仍常发生。藏红花球茎年均繁殖率仅为1.2，引种三十多年来，浙江种植面积仅 4000亩左右，藏红花球茎腐烂病防治是我国藏红花种植业发展的瓶颈。
3.因此，球茎腐烂病已是阻碍藏红花产业发展最关键的破坏性因素。球茎腐烂病主要是由一种土传病原真菌尖孢镰刀菌(f.oxysporum)，以土壤为传播媒介，从根部侵染球茎，消耗宿主营养物质，导致植株萎蔫死亡，各栽培时期均可发生，尤其在夏季高温的6月下旬至8月下旬发病率最高。我国主产区浙江建德高发年份发病率可高达50％，严重阻碍国内藏红花种植业发展，因此国内80％藏红花仍需进口。目前农户主要使用化学农药进行防治，但效果不佳，并且这些化学物质对环境和人类的有害影响已得到充分证实，导致农药残留严重，土壤的理化性质发生改变，使得病原菌的抗药性不断增强，也会影响与植物相关的有益微生物群。
4.因此，迫切需要寻找新型防治藏红花球茎腐烂病的有效方法，对促进我国生态坏境和藏红花产业健康发展具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种多粘类芽孢杆菌，该种多粘类芽孢杆菌能够有效抑制尖孢镰刀菌的生长，从而从根本上降低藏红花球茎腐烂病的发病率。
6.本发明的第二目的在于提供一种多粘类芽孢杆菌在制备用于防治藏红花球茎腐烂病的药物中的应用。该多粘类芽孢杆菌能够有效抑制尖孢镰刀菌的生长，从而降低藏红花球茎腐烂病的发病率，对藏红花球茎腐烂病防治效果明显，并且不会产生农药残留，环境污染等问题。
7.本发明的第三目的在于提供一种包括该多粘类芽孢杆菌的菌剂，该菌剂能够有效抑制尖孢镰刀菌的生长，从而有效降低尖孢镰刀菌所引起的藏红花球茎腐烂病的发病几
率，进而提高了藏红花的存活率。
8.本发明的第四目的在于提供一种菌剂的使用方法，该使用方法明确了每次菌剂的使用量和使用次数，从而确保该菌剂能成功抑制尖孢镰刀菌的生长发育，以起到降低藏红花球茎腐烂病发病率的作用。
9.本发明的第五目的在于提供一种包括该多粘类芽孢杆菌的菌剂的制备方法，该方法简单易操作，且不会对环境造成危害。
10.本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
11.本发明实施例提供了一种多粘类芽孢杆菌，名为多粘类芽孢杆菌cs12paenibacilluspolymyxa，所述多粘类芽孢杆菌cs12的保藏号为cgmcc no.22612，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021 年5月26日。土壤微生物群落对于植物健康具有重要意义，植物的健康生长与根际土壤微生物群落的平衡密切相关，根际土壤微生态系统的不平衡是土传病害发生的主要原因。在种植了10年葡萄的土壤里间作藏红花，发达的葡萄根系与藏红花根系紧密交缠在一起，葡萄地下根系通过给藏红花根系引入新的微生物，塑造具有间作优势独特的藏红花根际微生态，对防治藏红花球茎腐烂病具有显著效果。本发明利用藏红花球茎腐烂病的主要致病菌尖孢镰刀菌(fusarium oxysporum)对间作在葡萄地里的藏红花根际土壤微生物进行高效的拮抗分离，得到了一株具有显著拮抗尖孢镰刀菌效果的细菌，即为多粘类芽孢杆菌cs12。该多粘类芽孢杆菌由高效96孔板对峙试验从葡萄-藏红花间作的土壤中分离并进一步通过活体抗病试验等分离纯化得到，其能够通过有效抑制引起藏红花球茎腐烂病的病原菌——尖孢镰刀菌的生长，从而从根本上降低藏红花球茎腐烂病的发病几率；并且该多粘类芽孢杆菌cs12不会对土壤和环境造成损伤和危害，以能够放心使用，不用担心污染问题。多粘类芽孢杆菌以芽孢形式存在，耐温性好，质量稳定，“以菌治菌”，药效持久；“药肥兼能”，不仅是防治青枯病、枯萎病、根腐病、软腐病等土传病害最理想的药剂，而且具有明显的促进生长、提高产量、改善品质的作用；无任何药害和残留，是无公害、绿色生产的首选微生物制剂。
12.本发明实施例还提供了一种多粘类芽孢杆菌在制备用于防治藏红花球茎腐烂病的药物中的应用。该多粘类芽孢杆菌能够有效抑制尖孢镰刀菌的生长，从而降低藏红花球茎腐烂病的发病率，对藏红花球茎腐烂病防治效果明显，并且不会产生农药残留，环境污染等问题。
13.本发明实施例还提供了一种由上述多粘类芽孢杆菌cs12制得的菌剂，通过使用该多粘类芽孢杆菌cs12所制得的菌剂可以通过灌根或注射等方式对感染尖孢镰刀菌的藏红花根部进行施用，从而起到抑制藏红花根部的尖孢镰刀菌的生长作用，进而降低藏红花的球茎腐烂病的发病率，从而提高藏红花的存活率；并且该菌剂无公害、无污染，不会对土壤和环境造成负担，便于长期使用。
14.本发明实施例还提供了一种上述菌剂的使用方法，包括如下步骤，菌剂每3天施用一次，每次5ml，持续21-30天。该使用方法通过限定每次菌剂的使用量和使用次数以保证菌剂能够有效发挥抑制尖孢镰刀菌的效果。
15.本发明实施例还提供了一种上述菌剂的制备方法，包括如下步骤，在无菌条件下，挑取多粘类芽孢杆菌cs12的单菌落并接种于na或pda培养基内，于28-37℃、75％rh暗培养24-48h，得到纯化菌落；于无菌条件下，挑取纯化菌落并接种于nb或pdb培养基中，于28℃、
180rpm振荡培养24h得到种子菌；将种子菌接种于nb或pdb培养基中，于28℃、180 rpm发酵48h，形成发酵液，即得到菌剂。该方法操作简单方便，通过将该菌株分离纯化得到单菌落以及种子菌，并将该菌落的种子菌发酵后即得到该菌液。
16.相对于现有技术，本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果：
17.一、本发明的实施例提供了一种多粘类芽孢杆菌，该多粘类芽孢杆菌名为多粘类芽孢杆菌cs12，从葡萄-藏红花间作的土壤中分离得到，能够有效抑制土壤中尖孢镰刀菌的生长和发育，从而降低了藏红花球茎腐烂病的发病几率。
18.二、本发明的实施例还提供了一种多粘类芽孢杆菌在制备用于防治藏红花球茎腐烂病的药物中的应用，该多粘类芽孢杆菌能够有效抑制尖孢镰刀菌的生长，从而降低藏红花球茎腐烂病的发病率，对藏红花球茎腐烂病防治效果明显，并且不会产生农药残留，环境污染等问题。
19.三、本发明的实施例还提供了一种菌剂，该菌剂由多粘类芽孢杆菌 cs12制得，该菌剂能够被藏红花根部吸收，从而在藏红花根部发挥抑制尖孢镰刀菌的生长的作用，由于尖孢镰刀菌为藏红花球茎腐烂病的主要致病菌，因此通过抑制尖孢镰刀菌的生长，能够降低藏红花球茎腐烂病的发病几率，从而对我国藏红花的发展有重要意义。
20.四、本发明的实施例还提供了一种菌剂的使用方法，该方法通过以合理的用量和方式来确保该菌剂能够有效且合理的抑制尖孢镰刀菌的生长和发育，从而确保该菌剂的抑制效果显著。
21.五、本发明的实施例还提供了一种菌剂的制备方法，该制备方法通过将该多粘类芽孢杆菌cs12分离纯化后以得到单菌落，后续再通过将单菌落分离纯化以得到种子菌，最后通过将种子菌进行发酵即可制得该菌剂，该制备方法简单方便易操作，且所制得的菌剂对尖孢镰刀菌具有良好的抑制效果，从而降低藏红花球茎腐烂病的发病几率。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
23.图1为本发明实施例1中多粘类芽孢杆菌(p.polymyxa)cs12对藏红花球茎腐烂病病原菌尖孢镰刀菌的抑制作用图(a为尖孢镰刀菌f. oxysporum，b为cs12对f.oxysporum的对峙)；
24.图2为本发明实施例1中基于16srdna引物扩增的多粘类芽孢杆菌 cs12的凝胶电泳图；
25.图3为本发明实施例2中采用邻接法得到的基于16srdna的多粘类芽孢杆菌cs12的系统进化树；
26.图4为本发明实施例2中多粘类芽孢杆菌(p.polymyxa)在na固体培养基上的菌落形态图；
27.图5为本发明实施例2中给尖孢镰刀菌后28天球茎的生长情况图，(其中a为空白对照组，b为模型组，c为益生菌组)。
具体实施方式
28.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
29.需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本发明。
30.本发明实施例提供了一种多粘类芽孢杆菌，名为多粘类芽孢杆菌cs12，多粘类芽孢杆菌cs12的保藏号为cgmcc no.22612，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年5 月30日。多粘类芽孢杆菌在根、茎、叶等植物体内具有很强的定殖能力，可通过位点竞争阻止病原菌侵染植物；同时多粘类芽孢杆菌不断分泌出的广谱抗菌物质可抑制或杀灭病原菌；此外，多粘类芽孢杆菌还能诱导植物产生抗病性。土壤微生物群落对于植物健康具有重要意义，植物的健康生长与根际土壤微生物群落的平衡密切相关，根际土壤微生态系统的不平衡是土传病害发生的主要原因。在种植了10年葡萄的土壤里间作藏红花，发达的葡萄根系与藏红花根系紧密交缠在一起，葡萄地下根系通过给藏红花根系引入新的微生物，塑造具有间作优势独特的藏红花根际微生态，对防治藏红花球茎腐烂病具有显著效果。本发明利用藏红花球茎腐烂病的主要致病菌尖孢镰刀菌对间作在葡萄地里的藏红花根际土壤微生物进行高效的拮抗分离，得到了一株具有显著抗尖孢镰刀菌效果的细菌，即为多粘类芽孢杆菌cs12。该多粘类芽孢杆菌cs12主要在藏红花的根部定殖，从而通过位点竞争以阻止尖孢镰刀菌对藏红花球茎进行侵染，从而切断尖孢镰刀菌的营养来源，进而抑制了尖孢镰刀菌的生长，降低了藏红花球茎腐烂病的患病几率；且该多粘类芽孢杆菌cs12不会对土壤和环境造成污染，进而便于长期使用。
31.在本发明的一些实施例中，上述多粘类芽孢杆菌的16srdna序列如 seq id no.1所示。
32.另一方面，本发明的实施例还提供了一种多粘类芽孢杆菌在制备用于防治藏红花球茎腐烂病的药物中的应用。由于该多粘类芽孢杆菌cs12能够有效抑制尖孢镰刀菌的生长，而尖孢镰刀菌为藏红花球茎腐烂病的主要致病菌，因此使用该菌株制得的药物能够通过抑制尖孢镰刀菌的生长而有效降低藏红花球茎腐烂病的发病几率。
33.另一方面，本发明的实施例还提供了一种菌剂，该菌剂由上述多粘类芽孢杆菌cs12制得。通过使用该多粘类芽孢杆菌cs12所制得的菌剂可以对感染尖孢镰刀菌的藏红花根部进行施用，从而起到抑制藏红花根部的尖孢镰刀菌的生长作用，进而降低藏红花的球茎腐烂病的发病率，最终提高藏红花的存活率；并且该菌剂无公害、无污染，不会对土壤和环境造成负担，便于长期使用。
34.在本发明的一些实施例中，上述菌剂中多粘类芽孢杆菌cs12的浓度为 10
7-108cfu/ml。该浓度区间的多粘类芽孢杆菌cs12能够保证菌剂能够有效发挥防治效果的同时且避免多粘类芽孢杆菌cs12对藏红花本身的生长发育而造成影响。
35.在本发明的一些实施例中，上述菌剂每3天施用一次，每次5ml，持续21-30天。此为该菌剂的使用方法，通过该施用量和施用次数以确保该多粘类芽孢杆菌cs12能够稳定抑制尖孢镰刀菌的生长，并避免该多粘类芽孢杆菌cs12在藏红花根部积存过多而影响藏红花本
身的生长及发育。
36.在本发明的一些实施例中，上述施用的方法为灌根或注射。通过使用菌剂对感染了藏红花球菌腐烂病的藏红花进行灌根或对根部进行直接注射以抑制染病植株中尖孢镰刀菌的生长，从而降低藏红花球菌腐烂病的发病几率。
37.另一方面，本发明的实施例还提供了一种上述菌剂的制备方法，该方法包括如下步骤，在无菌条件下，挑取多粘类芽孢杆菌cs12的单菌落并接入灭菌的na或pda培养基内，于28-37℃、75％rh暗培养24-48h，得到纯化菌落；于无菌条件下，挑取纯化菌落并接种于灭菌的nb或pdb培养基中，于28℃、180rpm振荡培养24h得到种子菌；将种子菌接种于nb 或pdb培养基中，于28℃、180rpm发酵48h，形成发酵液，即得到菌剂。其中先将多粘类芽孢杆菌cs12于na培养基中培养一段时间，以得到纯化的多粘类芽孢杆菌cs12的单菌落，通过挑取该单菌落将其接种于nb或 pdb培养基中，得到种子菌培养基，以便于后续进行发酵，最后通过将种子菌单菌落接种于nb或pdb培养基内发酵，使该多粘类芽孢杆菌cs12 在nb培养基中大量繁殖，进而得到菌剂。
38.在本发明的一些实施例中，上述na培养基包括蛋白胨10g、牛肉膏3 g、氯化钠5g和琼脂20g，na培养基的ph为7.0-7.4；nb培养基包括蛋白胨10g、牛肉膏3g和氯化钠5g，nb培养基的ph为7.0-7.4。pda培养基包括土豆200g的水煎煮液、葡萄糖20g和琼脂15g；pdb培养基包括土豆200g的水煎煮液和葡萄糖20g，pdb培养基的ph为7.0-7.4。
39.上述原料为所使用的na或pda培养基以及nb或pdb培养基的配方，以为多粘类芽孢杆菌cs12的生长和代谢提供基本的营养物质和原料，其能够有利于多粘类芽孢杆菌cs12的生长和代谢，使该多粘类芽孢杆菌cs12 的代谢速率处于较高水平，从而有利于多粘类芽孢杆菌cs12的大量生长和繁殖以及种子菌的形成等。
40.在本发明的一些实施例中，上述菌剂按种子菌液:nb或pdb培养基的体积比为1:(10-100)的接种量接种。该接种量区间的种子菌能够在发酵液中大量增殖和发育，从而以提高最终所制得的菌剂的抗病效果。
41.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
42.实施例1
43.多粘类芽孢杆菌cs12的筛选、分离、纯化和鉴定：
44.(1)2020年8月15日从浙江湖州南太湖现代农业示范园区葡萄与藏红花间作地里采集健康藏红花根际土壤。称取0.5g土壤加入2ml无菌水， 180rpm/min振荡20min，得到悬液，利用rotor hda菌落高通量筛选工作站(英国singer)进行自动点样到96孔板上，尖孢镰刀菌在中间，四周正方形等距离点4个土壤悬液，点样结束后，用封口膜把板密封，于37℃暗培养2-3天，选择有明显抑菌带的菌落进行分离纯化。
45.(2)挑取抑菌带明显的菌落，采用划线法接种到na培养基上，对其进行纯化。挑取纯化的单菌落接种至30ml(50ml锥形瓶)nb液体培养基中，在恒温振荡摇床中以28℃，180rpm培养条件培养12-48h。在超净台中用一次性巴氏滴管吸取少量菌剂于血细胞计数板，在蔡司正置荧光显微镜下进行孢子计数，用无菌水将孢子悬浮液浓度稀释为10
7-108cfu/ml。
46.(3)将藏红花球茎腐烂病病原菌尖孢镰刀菌(从同一地块，生病植株根际土壤中分离)，接种到pda培养基上，于26
±
2℃暗环境下培养5-7d，用直径6mm的灭菌打孔器制成菌
块，接到新pda培养基中心处，在距圆心2cm处等距离放3个直径为6mm无菌滤纸片，用移液枪吸取孢子悬浮液3μl置在滤纸片上。等体积的nb培养液作为阴性对照，每个处理重复 3次。放入培养箱，在26
±
2℃暗环境下培养5-7d，检测对峙培养结果，所得结果如图1所示，根据图1结果计算相对抑菌率。相对抑菌率(％)＝(对照菌落半径－处理菌落半径)/(对照菌落半径－菌饼半径)
×
100％，选择其中相对抑菌率大于85％的菌株，进行分子鉴定。
47.将上述对尖孢镰刀菌抑制率大于85％的菌株分别接种到nb液体培养基中，在摇床中以180rpm/min的转速30℃恒温振荡24-48h。吸取2ml 至离心管中，按照天根dp302细菌基因组dna提取试剂盒(北京天根生物科技有限公司)步骤提取菌株dna。采用细菌通用引物对分离细菌 16srdna进行扩增。所用正向引物27f的序列如seq id no.2，所用反向引物1492r的序列如seq id no.3所示。扩增条件如下：94℃预变性3min； 94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后在72℃下延伸5min，终止反应，所得多粘类芽孢杆菌cs12的扩增序列如表1所示。经琼脂糖凝胶电泳检测后的pcr产物送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定，其凝胶电泳图如图2所示。以pcr产物测得序列作为靶序列，在ncbi中的genbank数据库搜索同源序列，下载与形态型序列最相似的参考序列，用邻接法(neighbor-joining，nj)用于系统发育分析，来确定待鉴定菌株的系统发育地位，所得结果如图3所示。经形态学，生理生化分析(见表2，其中 为能利用或阳性，-为无法利用或阴性)和 16srrna分子生物学鉴定，确定了本发明的根际细菌菌株为多粘类芽孢杆菌cs12，保藏编号为cgmcc no.22612。
48.表1多粘类芽孢杆菌cs12的16srdna序列和所用引物的序列表
49.[0050][0051]
[0052]
表2多粘类芽孢杆菌cs12的生理生化特征表
[0053]
指标表达情况指标表达情况葡萄糖 3％nacl硫化氢-木糖 丙二酸钠-阿拉伯糖 尿素酶 麦芽糖 过氧化氢酶-山梨醇-明胶水解-甘露醇 mp-硝酸盐肉汤 v-p
[0054]
实施例2
[0055]
多粘类芽孢杆菌cs12的菌剂的抗病实验：
[0056]
(1)取斜面保存的尖孢镰刀菌菌株，在无菌条件下，用接种针挑取少许菌丝接种到pda培养基上活化，26
±
2℃暗环境下培养5-7d；用直径6mm 的灭菌打孔器制成菌块，接种到pdb液体培养基中培养，每10ml pdb接种1个菌块。在30℃，180rpm/min培育4-5d。将培养好的尖孢镰刀菌发酵液在超净台内，用两层无菌纱布过滤。吸取100μl孢子悬浮液，用血球计数板统计孢子数目，调整至f.oxysporum 10
5-106个孢子/ml悬浮液。
[0057]
(2)冷冻保存在25％甘油中的cs12菌株，在无菌条件下，吸取100μl 涂布在na培养基上，于28-37℃，75％湿度条件下暗培养24-48h，观察其培养特征，所得结果如图4所示；将活化后的菌株，用接种针挑取单菌落接种于25ml nb培养基中，28℃，180rpm/min条件下振荡培养24h制备种子菌；种子菌以1-10％接种量接种于新的nb培养基中，在28℃，180rpm 条件下发酵48h，形成菌剂。培养的菌剂用无菌水进行稀释，将菌剂的 od600调整为0.4-0.6。
[0058]
(3)藏红花球茎进入休眠期，从建德市三都西红花专业合作社购买了外观无病斑，单重25
±
1g的藏红花球茎。待7月底，球茎快结束休眠时，把球茎外皮去除，用三步消毒法(75％乙醇60s，2.5％次氯酸钠5min，75％乙醇30s)进行表面灭菌，然后球茎用无菌水多次冲洗，晾干。用于实验。
[0059]
(4)球茎随机分为3组(空白对照组：control；模型组：尖孢镰刀菌 无菌水；益生菌组：cs12 尖孢镰刀菌)，每组42个，每组3个生物学重复。放在43cm
×
33cm
×
28cm育苗盒中进行培育。病原菌和益生菌均采用针刺法接种。cs12组提前3天在球茎顶部3个位置注射cs12各10μl，空白组和模型组接种等体积的无菌水。每隔3天注射一次，在第二次接种时，模型组和cs12组同时接种尖孢镰刀菌，持续28天，其中28天后的球茎生长情况如图5所示，使用autocad2019软件统计病斑面积，计算发病指数。病情分级标准：0级，无病斑；1级，球茎病斑面积小于10％；2级，球茎病斑面积为10％-30％；3级，球茎病斑面积为30％-50％；4级，球茎病斑面积为50％-70％；5级，球茎病斑面积大于70％。病情指数(di)＝[σ(病级株数
×
代表数值)/株数总和]
×
100。各组的病情指数如表3所示。
[0060]
表3空白对照组、模型组和益生菌组的病情指数表
[0061]
组别空白对照组模型组益生菌组病情指数67
±
10.2439
±
48.3102
±
19.2
[0062]
其中根据表3结果并按照公式防治效果(％)＝(模型组病情指数－益生菌组病情指数)/模型组病情指数
×
100％，计算得知，cs12的防治效果为 76.7％，因此可以得出该多
粘类芽孢杆菌cs12对尖孢镰刀菌具有明显的抑菌效果从而能够有效降低藏红花球茎腐烂病的发病率。
[0063]
实施例3
[0064]
多粘类芽孢杆菌cs12的菌剂用于防治藏红花球茎腐烂病的田间实验：
[0065]
选取了连续种植了5年的藏红花地块，划分成同等大小的三块地，设置了2个平行地块(20m
×
4m)，分别为对照组和cs12组。cs12组采用灌根法给予实施例2中的菌剂，每个球茎5ml，以常规栽培管理方法为对照组。在球茎休眠期，挖取球茎，统计球茎发病率，计算防治效果。结果发现施用了多粘类芽孢杆菌cs12的地块，球茎腐烂病发生率在5％以下，显著低于未施用的对照组，说明该多粘类芽孢杆菌cs12所制得的菌剂能够有效降低藏红花球茎腐烂病的发病几率。
[0066]
综上所述，本发明实施例提供了一种多粘类芽孢杆菌及其应用以及包括该多粘类芽孢杆菌的菌剂及其制备方法：
[0067]
一、本发明的实施例提供了一种多粘类芽孢杆菌，该多粘类芽孢杆菌名为多粘类芽孢杆菌cs12，从葡萄-藏红花间作的土壤中分离得到，能够有效抑制土壤中尖孢镰刀菌的生长和发育，从而降低了藏红花球茎腐烂病的发病几率。
[0068]
二、本发明的实施例还提供了一种多粘类芽孢杆菌在制备用于防治藏红花球茎腐烂病的药物中的应用，该多粘类芽孢杆菌能够有效抑制尖孢镰刀菌的生长，从而降低藏红花球茎腐烂病的发病率，对藏红花球茎腐烂病防治效果明显，并且不会产生农药残留，环境污染等问题。
[0069]
三、本发明的实施例还提供了一种菌剂，该菌剂有多粘类芽孢杆菌 cs12制得，该菌剂能够被藏红花根部吸收，从而在藏红花根部发挥抑制尖孢镰刀菌的生长的作用，由于尖孢镰刀菌为藏红花球茎腐烂病的主要致病菌，因此通过抑制尖孢镰刀菌的生长，能够降低藏红花球茎腐烂病的发病几率，从而对我国藏红花的发展有重要意义。
[0070]
四、本发明的实施例还提供了一种菌剂的使用方法，该方法通过以合理的用量和方式来确保该菌剂能够有效且合理的抑制尖孢镰刀菌的生长和发育，从而确保该菌剂的抑制效果优秀。
[0071]
五、本发明的实施例还提供了一种菌剂的制备方法，该制备方法通过将该多粘类芽孢杆菌cs12分离纯化后以得到单菌落，后续再通过将单菌落分离纯化以得到种子菌，最后通过将种子菌进行发酵即可制得该菌剂，该制备方法简单方便易操作，且所制得的菌剂对尖孢镰刀菌具有良好的抑制效果，从而降低藏红花球茎腐烂病的发病几率。
[0072]
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。