一种基于OVR基因鉴定禽类产蛋性状的分子标记及其鉴定方法和应用与流程

一种基于ovr基因鉴定禽类产蛋性状的分子标记及其鉴定方法和应用
技术领域
1.本发明涉及分子标记技术领域，具体涉及一种基于ovr基因鉴定禽类产蛋性状的分子标记及其鉴定方法和应用。


背景技术：

2.产蛋量作为繁殖性状之一受卵泡发育成熟和排卵影响，卵泡发育成熟卵黄前体物合成与转运调节至关重要。卵黄前体物主要包括极低密度脂蛋白(vldly)和卵黄生成素(vtg)。卵黄前体物可通过母禽分泌雌激素刺激肝脏合成释放进入血液循环，转运至卵泡。卵泡快速发育阶段，vldly和vtg等营养物质通过卵泡膜表面血管进入卵泡膜颗粒细胞层，与颗粒细胞表面卵黄生成受体(oocyte vitellogenesis receptor,ovr)结合后，细胞膜内陷封闭形成有被小泡，将其运输到生长中的卵母细胞。随后配体-受体复合物分离，受体重新回到卵母细胞表面继续下一轮转运。分离后的vldly在溶菌酶的作用下降解，供卵母细胞吸收形成卵黄内物质。可见，卵黄发育主要取决于vldly进入卵母细胞的数量，即颗粒细胞层表面受体ovr/vldlr表达量决定了卵黄内物质含量和卵泡发育速度。
3.产蛋初期卵黄物质合成受激素调控，但卵泡膜颗粒细胞表面卵黄受体ovr的表达主要受其转录调控区c/ebpα结合调控，而不受激素调控。因此，ovr基因表达调控区基因序列的多态性直接影响其表达量，进而影响卵泡发育。
4.产蛋量作为繁殖性状之一，在父本家系的遗传力较低，且作为经济性状受微效多基因控制，一直以来，以个体产蛋量作为主要选择依据，导致选育进展缓慢。ovr基因点突变可导致来航禽类限制性产蛋。可见，ovr基因通过促进卵泡发育直接影响产蛋量。因此，选择ovr基因作为候选基因，以其表达调控转录因子结合位点为研究区段，筛选可用于产蛋量性状选育的分子标记，为禽类育种直接技术手段。基于上述内容，提出一种基于ovr基因鉴定禽类产蛋性状的分子标记及其鉴定方法和应用。


技术实现要素：

5.本发明的目是针对禽类低遗传力繁殖性状，提供了一种基于ovr基因鉴定禽类产蛋性状的分子标记，以利用分子标记技术实现早期检测，克服表型记录耗时久的技术问题。
6.本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
7.本发明提供了一种基于ovr基因鉴定禽类产蛋性状的分子标记，所述分子标记为g或t，所述分子标记位于ovr基因的转录启始位点上游-399bp处。该分子标记是基于卵母细胞卵黄生成受体基因ovr开发的能够影响其表达量的多态位点，ovr基因的表达受c/ebpα结合转录调控区效率的影响，该分子标记位于c/ebpα转录调控结合区，具体为位于ovr基因转录启始位点上游-399bp处的g/t突变。
8.如seq id no.1所示序列为部分ovr基因序列及其上游序列，所述ovr基因的转录启始位点(atg)位于seq id no.1所述序列的816-818位，分子标记位于该ovr基因的转录启
始位点上游-399bp处，即位于seq id no.1所示核苷酸序列的第417位。
9.本发明还提供了一种上述基于ovr基因鉴定禽类产蛋性状的分子标记在鉴定禽类产蛋性状中的应用。
10.本发明还提供了一种利用上述分子标记鉴定禽类产蛋性状的鉴定方法，包括以下步骤：
11.(1)提取禽类血液或任一组织的总dna；
12.(2)以所述分子标记所在位点的上下游的ovr核苷酸序列为模板，设计特异性扩增引物，再以所述总dna为模板，利用特异性扩增引物进行pcr扩增，获得扩增产物；
13.(3)对扩增产物进行基因分型检测和测序，获得待测禽类的分子标记类型；
14.(4)根据分子标记类型判断禽类产蛋性状。
15.进一步改进在于，所述扩增产物具有如seq id no.2所示的核苷酸序列。
16.进一步改进在于，所述分子标记所在位点的上游扩增产物的长度与下游扩增产物的长度均大于100bp，且所述分子标记所在位点的上游扩增产物的长度与下游扩增产物的长度的长度差大于20bp。
17.进一步改进在于，所述特异性扩增引物序列为：
18.forward primer：gggacagggccatacagttt；
19.reverse primer：tcagtactcccctgctcataca。
20.进一步改进在于，所述分子标记类型检测的方法为采用ndeⅰ酶切pcr扩增产物，获得酶切产物，电泳检测酶切产物，若酶切产物：
21.(1)包含一条条带，则为gg型；
22.(2)包含两条条带，则为tt型；
23.(3)包含三条条带，则为tg型。
24.进一步改进在于，所述根据分子标记类型判断禽类产蛋性状的具体步骤为：
25.(1)若待测禽类分子标记类型为gg型，该禽类产蛋性状最优；
26.(2)若待测禽类分子标记类型为tt型，该禽类产蛋性状较差；
27.(3)若待测禽类分子标记类型为tg型，该禽类产蛋性状一般。
28.本发明还提供了一种利用上述分子标记筛选具有优良产蛋性状禽类的方法，提取禽类组织细胞总dna，利用所述分子标记对禽类的基因型进行分型检测，选择基因型为gg的禽类个体，即为具有优良产蛋性状禽类品种。
29.本发明的有益效果在于：本发明提供了一种基于ovr基因鉴定禽类产蛋性状的分子标记及其鉴定方法和应用，本发明可以弥补常规检测方法的不足，实验步骤少，周期短，且所用试剂常见，成本较低；通过鉴定该分子标记在禽类基因组中存在类型，可以在早期通过分子筛选来判断禽类个体产蛋性能，为禽类产蛋性能选育提供了直接的技术手段，通过早期选育，降低饲养成本的同时，从遗传上提高个体产蛋水平，加快遗传选育进展。
附图说明
30.图1为部分样品pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
31.图2为部分样品pcr扩增产物的酶切琼脂糖凝胶电泳图；
32.图3为混池样品dna序列测定多态位点。
具体实施方式
33.下面结合附图对本技术作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本技术进行进一步的说明，不能理解为对本技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本技术作出一些非本质的改进和调整。
34.1、材料
35.本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
36.2、方法
37.2.1获得禽类ovr基因多态位点
38.2.1.1基因组dna提取与检测
39.选取皖西白鹅群体共250只母鹅为试验材料，进行禽类翅静脉采血，利用生工生物公司生产的血液dna提取试剂盒提取禽类翅静脉血样中总dna，具体参照试剂盒使用说明书进行。
40.用nanodrop2000测量dna浓度及od值。用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测dna，结果如图1所示，提取的基因组dna质量较好，主带单一、清晰。
41.2.1.2引物设计
42.登陆美国国立生物技术中心(ncbi,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，下载鹅卵母细胞基因组全序列，其登录号为mk446725.1，从基因组数据库中找到ovr基因及其上游序列，如seq id no.1所示，以seq id no.1所示ovr基因的部分dna序列为模板，在引物设计的过程中注意尽量将snp位点设于中间位置，避免发夹结构、引物二聚体和错配等情况的发生，使引物序列最优化，引物序列如下所示：
43.f1：gggacagggccatacagttt(seq id no.3)
44.r1：tcagtactcccctgctcataca(seq id no.4)
45.该引物扩增的pcr产物长度为445bp，其中包含ovr基因的转录启始位点上游-399bp位g/t突变的分子标记位点。
46.2.1.3pcr扩增
47.利用已合成的测序特异性引物对ovr基因的目的片段进行pcr扩增反应，pcr扩增体系为：
[0048][0049]
pcr扩增的条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58-62℃复性30s，72℃延伸45s，30-35个循环，最后72℃延伸5min。
[0050]
2.1.4pcr扩增产物检测
[0051]
配置浓度为1％的琼脂糖凝胶，采用100v、40min的条件进行电泳检测，pcr扩增产物结果如图2所示，获得一条长度约为445bp的条带，与预测的长度一致。利用大连宝生物有限公司的dna回收试剂盒，回收pcr扩增产物，将获得的pcr产物送至上海生工进行测序，序列如seq id no.2所示，与预测结果相符。
[0052]
2.1.5基因型检测
[0053]
采用ndeⅰ酶切pcr扩增产物，获得酶切产物，电泳检测酶切产物，结果如图2所示。根据拍照图像结果，筛选出不同基因型：
[0054]
(1)包含一条条带，则为gg型；
[0055]
(2)包含两条条带，则为tt型；
[0056]
(3)包含三条条带，则为tg型。
[0057]
2.1.6dna验证测序
[0058]
对这三种分型分别挑选一个个体进行测序比对，测序比对图如图3所示；测序结果中g突变成t，箭头标出了突变位置，与预测结果相符。
[0059]
2.2分子标记及其与产蛋性状的关联分析
[0060]
2.2.1基因和基因型频率
[0061]
为确定本发明的分子标记与禽类重要表型性状关联性，分别以2.1.1中的250只皖西白鹅和挑选的250扬州鹅为试验材料。
[0062]
2.2.2统计分析
[0063]
利用sas(9.2)软件分析基因位点与产蛋性状的相关性。先对数据进行描述性统计分析，统计具有个体产蛋记录的皖西白鹅群体共250只母鹅以及扬州鹅250只母鹅连续两个产蛋期的产蛋量。结果分别见表1-2。
[0064]
表1皖西白鹅ovr各基因型产蛋记录
[0065]
基因型gggttt频率(％)91.747.390.87第一年产蛋(枚)281911第二年产蛋(枚)362313
[0066]
表2扬州鹅ovr各基因型产蛋记录
[0067]
基因型gggttt频率(％)94.065.310.63正季节(10月-次年4月)522816反季节(4月-10月)432214
[0068]
表1-2中可以看出，结果显示，gg基因型产蛋量明显比gt和tt型增长的多，tt型产蛋性状最差，说明了本发明所述的分子标记与禽类产蛋性状具有相关性，利用该分子标记对禽类产蛋性状进行检测是可行性的。
[0069]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。