一株高产苯乙醇的异常威克汉姆酵母及其应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高产苯乙醇的异常威克汉姆酵母及其应用。


背景技术：

2.中国白酒的品质与香型主要由包括酸类、醇类、酯类等各种风味化合物所决定。其中，醇类是白酒中的主要甜味物质，通常能够赋予中国白酒果味、花香、青草和酒精的气味。苯乙醇作为白酒中重要的醇类物质，是主要的增香剂，也是形成其他风味化合物的前体物质，白酒中较高含量的苯乙醇能够使酒体醇甜，酒香丰满。
3.在中国传统白酒酿造过程中，酵母菌是一种重要的菌株，同时也是重要的产风味物质的主要微生物，尤其是产香酵母，是中国白酒酿造过程中产风味物质的主要菌株。当前，从中国白酒酿造体系中筛选获得高产目的风味物质的产香酵母，并将其强化应用到这些白酒固态酿造体系中，对于弥补中国白酒缺乏香气的缺点和促进中国白酒中特征风味成分的积累和提高白酒质量具有重要意义。
4.因此，从特香型白酒酿造体系中筛选高产苯乙醇的产香酵母菌株，并在特香型白酒固态酿造过程中进行生物强化，是潜在的提高特香型白酒中苯乙醇的含量，提升白酒品质和特征香气的途径。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供一株高产苯乙醇的异常威克汉姆酵母及其应用。
6.本发明通过以下技术方案予以实现：
7.本发明的第一个目的在于提供一株高产苯乙醇的异常威克汉姆酵母ncuf 307.1，该菌株具有较强的苯乙醇产生能力。异常威克汉姆酵母(wickerhamomyces anomalus)ncuf 307.1已于2021年9月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc m 20211219，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。
8.上述高产苯乙醇的异常威克汉姆酵母ncuf 307.1通过以下步骤得到：
9.(1)将特香型大曲通过粉碎机粉碎后过40目筛形成大曲粉(特香型大曲采用市场或酒厂上可获得的特香型大曲)；
10.(2)将大曲粉加入生理盐水，震荡混匀，吸取菌悬液置入无菌生理盐水中，震荡均匀，进行梯度稀释并涂布于wln固体培养基、孟加拉红固体培养基中，30℃培养48h，直至长出菌落；
11.(3)选择具有典型菌落特征的单菌落，划线分离2～3次获得单菌落后，接入斜面培养基，30℃培养48h后于4℃低温保藏；
12.(4)通过菌落形态特征、26sr rna序列鉴定及产苯乙醇含量比较实验，最终筛选到一株高产苯乙醇的异常威克汉姆酵母，该菌株已于2021年9月26日送往中国典型培养物保
藏中心，分类命名：异常威克汉姆酵母ncuf 307.1，保藏编号：cctcc m 20211219，其可产生高含量苯乙醇，苯乙醇产量比其它酵母菌株至少高5.47倍。。
13.本发明的第二个目的是提供上述异常威克汉姆酵母ncuf 307.1的应用，其应用于特香型白酒固态酿造并生产高含量苯乙醇。
14.高产苯乙醇的异常威克汉姆酵母ncuf 307.1在特香型白酒固态酿造中应用方法为：在常规酿造工艺中，将高产苯乙醇的异常威克汉姆酵母ncuf 307.1种子液按大曲比例20％-30％添加至固态酿造体系中，以仅添加传统特香型大曲的酒醅为对照组，并检测酒醅酿造结束后苯乙醇的含量。
15.与现有技术相比，本发明有益效果包括：
16.(1)本发明从特香型白酒大曲筛选得到的异常威克汉姆酵母ncuf 307.1产苯乙醇的能力高，纯菌种固态发酵20d产生苯乙醇的含量为3.02μg/g，较其它特香型白酒大曲筛选得到的优势酵母产苯乙醇的含量至少增加了5.47倍。
17.(2)在传统特香型白酒固态酿造过程中加入含有本发明的异常威克汉姆酵母ncuf 307.1的种子液，可显著提高酒醅中的苯乙醇含量15.1％-40.1％，从而增加特香型白酒的风味特征。
附图说明
18.图1为本发明异常威克汉姆酵母ncuf 307.1平板菌落形态。
具体实施方式
19.下面结合附图，对本发明作进一步地说明。
20.实施例1：高产苯乙醇异常威克汉姆酵母ncuf 307.1的筛选及鉴定
21.(1)原料预处理
22.大曲为江西省樟树贡酒业有限公司生产的特香型大曲，通过粉碎机粉碎后过40目筛，于4℃保藏。
23.ypd培养基：葡萄糖20g、蛋白胨20g、酵母膏10g、蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min。
24.孟加拉红固体培养基：葡萄糖10g、蛋白胨5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、孟加拉红0.033g、氯霉素0.1g、蒸馏水1000ml，ph 7.0-7.4，121℃灭菌20min。
25.wln培养基：葡萄糖50g、胰蛋白胨5g、酵母浸粉4g、磷酸二氢钾0.55g、氯化钾0.425g、氯化钙0.125g、硫酸镁0.125g、硫酸锰0.0025g、三氯化铁0.0025g、溴甲酚绿0.022g、蒸馏水1000ml，ph 5.5-5.8，121℃灭菌20min。
26.固态发酵培养基：麸皮100g、乳酸0.5ml、葡萄糖0.5g、蒸馏水100ml，121℃灭菌40min(2次)。
27.(2)菌株筛选
28.将大曲粉加入生理盐水，震荡混匀，吸取菌悬液置入无菌生理盐水中，震荡均匀，进行梯度稀释并涂布于wln固体培养基、孟加拉红固体培养基中，30℃培养48h，直至长出菌落，选择具有典型异常威克汉姆酵母菌落特征的单菌落，划线分离2～3次，挑选单菌落接入斜面培养基，30℃培养48h后于4℃低温保藏，异常威克汉姆酵母ncuf 307.1平板菌落形态如图1所示。
29.挑取符合异常威克汉姆酵母表型特征的单菌落接入100ml ypd液体培养基中，于28℃培养48h。将菌液稀释至108cfu/ml，以5％接种量接入固态发酵培养基，28℃培养20d。采用固相微萃取技术结合气质联用技术对苯乙醇含量进行分析，筛选出3株具有较高苯乙醇产量的菌株，其中苯乙醇产量分别为3.02μg/g、0.55μg/g与0.05μg/g。
30.(3)菌株鉴定
31.对发酵获得的3株高产苯乙醇的潜在异常威克汉姆酵母进行分子生物学26s rrna鉴定。以真菌通用引物its-1和its-4作为引物，以酵母菌基因组dna为扩增模板，进行pcr扩增。扩增条件：94℃预变性4min，接下来34个循环包括94℃变性1 min，58℃退火1min，72℃延伸1 min，最后一个循环在72℃延伸10min。通过1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。通过凝胶成像系统观察电泳结果，选取条带较亮的样品送至上海生物工程公司进行测序。将测序回来的序列通过blast工具在ncbi的genbank上搜索同源性序列，采用多重序列比对，构建系统进化树。鉴定结果表明具有最高苯乙醇产量(3.02μg/g)的菌株为异常威克汉姆酵母，并命名为异常威克汉姆酵母ncuf 307.1，随之保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc m 20211219。
32.实施例2：异常威克汉姆酵母ncuf 307.1与其它酵母产苯乙醇能力比较
33.本实施例所包括的菌株：光滑假丝酵母(candida glabrata)、阿萨丝孢酵母(trichosporon asahii)、酿酒酵母(saccharomyces cersvisiae)、异常毕赤酵母(pichia anomala)，以及本发明的菌株异常威克汉姆酵母ncuf 307.1。这5种菌株都来自江西省樟树贡酒业有限公司生产的大曲。
34.挑取这些酵母的单菌落接入100ml ypd液体培养基中，于28℃培养48h。将菌液稀释至108cfu/ml，以5％接种量接入固态发酵培养基，28℃培养20d。采用固相微萃取技术结合气质联用技术对苯乙醇含量进行分析。结果如表1所示，异常威克汉姆酵母ncuf 307.1菌株的苯乙醇产量为3.02μg/g，其它菌株苯乙醇含量均显著低于异常威克汉姆酵母ncuf 307.1或未达到最低检出限。说明本发明的菌株异常威克汉姆酵母ncuf 307.1的苯乙醇生产能力明显高于其它酵母菌株。
35.表1：不同酵母菌株的苯乙醇产量(μg/g)
[0036][0037][0038]
注：n.d表示样本中待检物含量低于检出限
[0039]
实施例3：高产苯乙醇异常威克汉姆酵母ncuf 307.1在特香型白酒固态酿造中的应用
[0040]
挑取一环高产苯乙醇的异常威克汉姆酵母ncuf 307.1至ypd液体培养基中，28℃培养48h。将培养得到的菌悬液计数，按107cfu/ml的接种量接种至ypd液体培养基中，28℃培养48h。按樟树贡酒厂酿造工艺，将产高产苯乙醇的异常威克汉姆酵母ncuf 307.1种子液分别按大曲比例20％、25％及30％添加至固态酿造体系中以仅添加传统特香型大曲的酒醅为对照。固态发酵30d后测定酒醅中苯乙醇含量。
[0041]
结果如表2所示，随着异常威克汉姆酵母ncuf 307.1种子液添加量的增加，发酵结束后酒醅中苯乙醇含量也随之升高，且相比于仅添加传统特香型白酒大曲，最高可提高41.1％含量的苯乙醇。从而可赋予特香型白酒良好的风味特征。
[0042]
表2：不同异常威克汉姆酵母ncuf 307.1添加量下酒醅中苯乙醇产量(μg/g)
[0043][0044]
以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。