一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基及其制备方法与流程

1.本发明涉及干细胞领域，尤其涉及一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基及其制备方法。


背景技术：

2.间充质干细胞（mesenchymal stem cells，msc）是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，是动物有机体和各种组织器官的起源细胞。新近的研究表明，在骨髓、肌肉、胃肠道、皮肤、视网膜、外周及中枢神经系统等组织中均存在间充质干细胞。间充质干细胞已经成为细胞替代治疗的研究热点。而人羊膜间充质干细胞除与应用广的骨髓间充质干细胞样具有多向分化潜能、免疫调节、造血支持等特性外，羊膜间充质干细胞免疫原性低，移植排斥作用小，副作用较小，羊膜间充质干细胞移植治疗一些炎症相关疾病，取得了较好的效果，是细胞移植和组织工程的理想种子细胞。并且人羊膜间充质干细胞增殖能力比骨髓间充质干细胞更强，细胞状态更原始。羊膜间充质干细胞还具有来源广泛，取材方便，无伦理限制等优势。
3.为了在短期内获得大量的羊膜间充质干细胞，需要对其进行体外培养，体外增殖速度直接关系到体外获得羊膜间充质干细胞的效率。现在常用的羊膜间充质干细胞培养基通常是用成分确定的基础培养基中添加一些营养成分，胎牛血清是动物培养基中常见的补充成分，能为细胞提供较为完整的营养物质，但是胎牛血清来源于动物，作为外源性血清，在使用时有诸多不确定因素，安全性较差。也有部分羊膜间充质干细胞培养基中不添加动物血清，但是制备的培养基对细胞的增殖作用有限。因此，需要研发一种安全性更高，并且能显著促进羊膜间充质干细胞增殖的培养基。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基，成分简单安全，能显著提高羊膜间充质干细胞的体外扩增效率。
5.本发明的目的之二在于提供一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基的制备方法。
6.本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂由以下有效成分组成：尿石素、生姜提取物、γ-氨基丁酸、腺苷-5'-二磷酸二钠、神经酰胺、表皮生长因子、棕榈酸视黄酯、右旋糖酐-40；所述尿石素由尿石素a和尿石素b组成。
7.进一步地，所述添加剂的成分以终浓度计为：尿石素1-5ng/ml、生姜提取物1.5-3ng/ml、γ-氨基丁酸6-10ng/ml、腺苷-5'-二磷酸二钠1-2μg/ml、神经酰胺3-5μg/ml、表皮生长因子1.5-2.5ng/ml、棕榈酸视黄酯10-15ng/ml、右旋糖酐-40 12-14μg/ml；所述尿石素中尿石素a和尿石素b的质量比为1:1。
8.进一步地，所述添加剂的成分以终浓度计为：尿石素3.5ng/ml、生姜提取物2.5ng/
ml、γ-氨基丁酸8ng/ml、腺苷-5'-二磷酸二钠1.5μg/ml、神经酰胺4μg/ml、表皮生长因子2ng/ml、棕榈酸视黄酯12ng/ml、右旋糖酐-40 13μg/ml；所述尿石素中尿石素a和尿石素b的质量比为1:1。
9.进一步地，所述基础培养基为dmem/f12。
10.本发明的目的之二采用如下技术方案实现：上述羊膜间充质干细胞扩增用培养基的制备方法，包括以下步骤：向基础培养基中加入尿石素、生姜提取物、γ-氨基丁酸、腺苷-5'-二磷酸二钠、神经酰胺、表皮生长因子、棕榈酸视黄酯、右旋糖酐-40，搅拌均匀，调节ph至7.2-7.4，过滤除菌后即得。
11.进一步地，采用0.22μm的滤膜过滤除菌。
12.相比现有技术，本发明的有益效果在于：1、本发明提供一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基，由基础培养基和添加剂组成，添加剂中的尿石素由尿石素a和尿石素b两种成分组成，添加在培养基中一方面促进细胞分裂，提高细胞的增殖速度；另一方面和生姜提取物、γ-氨基丁酸协同作用，提高细胞活性，增加细胞活跃度，提高细胞周期中s期和g
2 /m期细胞的占比。
13.2、本发明提供的培养基还添加有腺苷-5'-二磷酸二钠和神经酰胺，促进羊膜间充质干细胞代谢，减少细胞老化，延长细胞寿命。
14.3、本发明的培养基成分明确安全，不添加血清，原料易获取，有效降低羊膜间充质干细胞培养基的制备成成本。
15.4、本发明还提供了一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基的制备方法，制备过程简便易操作，便于产业化生产。
具体实施方式
16.下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
17.实施例1一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基，由dmem/f12培养基和添加剂组成，添加剂的成分以终浓度计为：尿石素3.5ng/ml、生姜提取物2.5 ng/ml、γ-氨基丁酸8ng/ml、腺苷-5'-二磷酸二钠1.5μg/ml、神经酰胺4μg/ml、表皮生长因子2ng/ml、棕榈酸视黄酯12ng/ml、右旋糖酐-40 13μg/ml；尿石素中尿石素a和尿石素b的质量比为1:1。
18.上述羊膜间充质干细胞扩增用培养基的制备方法，包括以下步骤：向基础培养基中加入尿石素、生姜提取物、γ-氨基丁酸、腺苷-5'-二磷酸二钠、神经酰胺、表皮生长因子、棕榈酸视黄酯、右旋糖酐-40，搅拌均匀，调节ph至7.2-7.4，采用0.22μm的滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
19.实施例2一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基，由dmem/f12培养基和添加剂组成，添加剂的成分以终浓度计为：尿石素1ng/ml、生姜提取物1.5 ng/ml、γ-氨基丁酸6ng/ml、腺苷-5'-二磷酸二钠1 μg/ml、神经酰胺3μg/ml、表皮生长因子1.5ng/ml、棕榈酸视黄酯10ng/ml、右旋糖酐-40 12μg/ml；尿石素中尿石素a和尿石素b的质量比为1:1。
20.上述羊膜间充质干细胞扩增用培养基的制备方法同实施例1。
21.实施例3一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基，由dmem/f12培养基和添加剂组成，添加剂的成分以终浓度计为：尿石素5ng/ml、苍术苷5ng/ml、生姜提取物3 ng/ml、腺苷-5'-二磷酸二钠2 μg/ml、γ-氨基丁酸10μg/ml、神经酰胺5μg/ml、表皮生长因子2.5ng/ml、棕榈酸视黄酯15ng/ml、右旋糖酐-40 14μg/ml；尿石素中尿石素a和尿石素b的质量比为1:1。
22.上述羊膜间充质干细胞扩增用培养基的制备方法同实施例1。
23.对比例1对比例1提供一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基，和实施例1的区别为：省去尿石素a和尿石素b，其余均和实施例1相同。
24.对比例2对比例2提供一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基，和实施例1的区别为：省去尿石素b，将尿石素a的用量调整为3.5ng/ml，其余均和实施例1相同。
25.对比例3对比例3提供一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基，和实施例1的区别为：省去尿石素a，将尿石素b的用量调整为3.5ng/ml，其余均和实施例1相同。
26.对比例4对比例4提供一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基，和实施例1的区别为：省去生姜提取物，其余均和实施例1相同。
27.对比例5对比例4提供一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基，和实施例1的区别为：省去生姜提取物，将γ-氨基丁酸的用量调整为10.5 ng/ml，其余均和实施例1相同。
28.对比例6对比例6提供一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基，和实施例1的区别为：省去γ-氨基丁酸，其余均和实施例1相同。
29.对比例7对比例6提供一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基，和实施例1的区别为：省去γ-氨基丁酸，将生姜提取物的用量调整为10.5 ng/ml，其余均和实施例1相同。
30.对比例8对比例8提供一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基，和实施例1的区别为：省去腺苷-5'-二磷酸二钠，将神经酰胺的用量调整为5.5μg/ml，其余均和实施例1相同。
31.对比例9对比例9提供一种羊膜间充质干细胞扩增用培养基，和实施例1的区别为：省去神经酰胺，将腺苷-5'-二磷酸二钠的用量调整为5.5μg/ml，其余均和实施例1相同。
32.取冻存的羊膜间充质干细胞在37℃水浴中快速复苏，离心后去除上清，将细胞转移至含有dmem/f12培养基的t75培养瓶中，细胞的接种密度为1
×
104个/ml，置于37℃，5%co2的培养箱中培养24h。
33.取3块12孔板，分别加入实施例1至3，对比例1至9的培养基，每组培养基设置3个孔，将上述培养24h的细胞分别接种在12孔板中，细胞的接种密度为1
×
104个/ml，置于37
℃，5%co2的培养箱中在继续培养72h。收集上述培养的细胞，采用体积分数75%的冷乙醇固定24h，离心去除乙醇，将细胞重悬于pbs中，加入10μl 10mg/mlrnase，37℃水浴30min后，立即放入冰浴中，再加入50mg/l的溴化乙锭染色，在4℃避光30min，用流式细胞仪检测，计算细胞的增殖指数，结果如表1所示，增殖指数的计算公式如下：pi= ( s g
2 /m ) / ( g
0 /g
1 s g
2 /m )
ꢀ×
100% （其中g0、g1、 s、g2、m为细胞的生长的五个周期）表1样品增殖指数（%）实施例144.79
±
2.32实施例243.24
±
2.16实施例342.84
±
2.21对比例123.51
±
1.08对比例231.79
±
1.37对比例333.45
±
1.29对比例428.42
±
1.21对比例525.97
±
1.18对比例630.63
±
1.40对比例731.55
±
1.39对比例834.79
±
1.52对比例935.91
±
1.46由表1可以看出，实施例1至3中细胞的增殖指数高于对比例1至9，对比例1至9和实施例1的区别为调整了培养基的组成。其中对比例1至3中分别省去了尿石素a和尿石素b，或者省去其中的一种类型的尿石素，从表1可以看出，省去尿石素a和尿石素b后细胞的增殖能力下降显著，而仅添加一种类型多的尿石素后，细胞的增殖指数和对比例1相比有一定的提高，但是和实施例1相比，还是有不同程度的下降，说明本发明通过添加两种类型的尿石素后对细胞的增殖能力提高有促进作用。
34.对比例4至对比例7中，分别省去生姜提取物和γ-氨基丁酸中的一种，无论是否调整剩余一种成分的用量，羊膜间充质干细胞的增殖指数降低，增殖能力均不及实施例1，说明上述成分的添加在培养基中协同作用，提高细胞活性，进而提高细胞增殖效率。
35.对比例8至9中分别省去腺苷-5'-二磷酸二钠和神经酰胺中一种，细胞的增殖指数也有一定程度的下降，这是因为本发明添加的腺苷-5'-二磷酸二钠和神经酰胺，促进羊膜间充质干细胞代谢，减少细胞老化，延长细胞寿命，进而提高细胞的增殖指数。
36.综上，本发明提供的羊膜间充质干细胞扩增用培养基中通过添加尿石素、生姜提取物、γ-氨基丁酸、腺苷-5'-二磷酸二钠和神经酰胺等成分，协同作用，提高细胞周期中s期和g
2 /m期细胞的占比，提高细胞的增殖效率。
37.分别将实施例1至3，对比例1至9的培养基加入t75培养瓶中，接种复苏后的羊膜间充质干细胞，细胞浓度为2
×
104个/ml，置于37℃，5%co2的培养箱中培养，每2天传代一次，传代比例为1:3，培养7d后采用台盼蓝染色法统计羊膜间充质干细胞的存活率，结果如表2所示。
38.表2样品细胞存活率实施例196.49%实施例295.75%实施例395.83%对比例175.94%对比例280.59%对比例383.46%对比例477.90%对比例576.26%对比例678.08%对比例781.63%对比例886.91%对比例988.84%由表2可以看出：实施例1至3中羊膜间充质干细胞的存活率高于对比例1至9，说明本发明的培养基中通过添加尿石素、生姜提取物、γ-氨基丁酸、腺苷-5'-二磷酸二钠和神经酰胺等成分，有助于细胞保持活性，减少细胞凋亡，进而提高细胞的存活率。
39.上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。