一种利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法及应用与流程

1.本发明涉及植物基因工程技术领域，特别涉及一种利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法及应用。


背景技术：

2.赋予水果和蔬菜红、蓝、紫等颜色的花青素属于广泛存在的统称为类黄酮的酚类化合物。类黄酮(flavonoid)是植物中一类重要的次生代谢物质，广泛存在于水果、蔬菜、谷物、豆类、茶叶、烟草、药用植物和观赏植物等多种植物中。类黄酮参与植物的生长发育、植物花果实和种子的显色反应以及植物的抗逆反应。类黄酮的生物合成途径非常庞大，目前己经发现有至少九条分支代谢途径，即查尔酮途径、橙酮途径、黄酮途径、黄酮醇途径、黄烷醇途径、异黄酮途径、类黄酮醇途径、原花青素途径、花青苷途径。研究发现，参与花青苷合成的酶主要有查尔酮合成酶(chalcone synthase,chs)、查尔酮异构酶(chalcone isomerase,chi)、黄烷酮-3-羟化酶(flavonol 3-hydroxylase,f3h)、二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,dfr)、花青素合成酶(ans)和类黄酮-3-葡糖基转移酶(3gt)等。二氢黄酮醇-4-还原酶(dfr)以nadph为辅酶立体专一性地将黄烷酮醇还原为无色花色素(flavan-3,4-diol,黄烷-3,4-二醇)。dfr是花青素生物合成途径中最重要的酶之一，它启动花青素生物合成的第一步，在花色的修饰中起重要作用。dfr催化三种无色黄烷酮醇，二氢山萘酚(dihydrokaempferol,dhk)、二氢槲皮素(dihydroquercetin,dhq)和二氢杨梅素(dihydromyricetin,dhm)还原成无色花色素。这些无色花色素之后被转换成天竺素，花青素和飞燕草素。从烟草花中分离到两种二氢黄酮醇-4-还原酶(dfr)cdna，ntdfr1和ntdfr2，序列比对分析发现，这两个基因与多个分离自其它种属植物的dfr基因具有高度的序列相似性，分别起源于拟茸毛烟草和毛叶烟。
3.类黄酮根据结构上的差异可以分成黄酮醇(flavonols)、黄酮类(flavones)、黄烷醇(flavanols)、花青素(anthocyanins)和原花青素(proanthocyanidins,pas)等。其中，芸香苷是一种广泛存在于植物体内的黄酮醇配糖体，其生物合成来源于类黄酮代谢路径。植物黄酮醇的合成是以4-香豆酸coa和丙二酰辅酶a为底物进行的，依次经过查尔酮合酶(chs)、查尔酮异构酶(chi)的催化形成柚皮素(naringenin)。接着，黄烷酮-3-羟化酶(f3h)和类黄酮-3
’‑
羟化酶(flavonol 3
’‑
hydroxylase,f3’h)可以依次催化柚皮素杂环和b环3号位的羟基化，分别生成二氢山奈素(dhk)和二氢槲皮素(dhq)。随后黄酮醇合成酶(flavonol synthase,fls)可以催化二氢山奈素和二氢槲皮素下分别生成山奈酚(kaempferol)和槲皮素(quercetin)，再经过糖基转移酶(glycosyltransferase,gt)等的催化反应生成芸香苷等黄酮醇类物质。
4.烟草中多酚类物质主要分为单宁类(绿原酸)、香豆素类(莨菪灵、莨菪亭、七叶亭)和黄酮类(芸香苷、黄酮、鼠李糖)等，其中绿原酸、芸香苷和莨菪亭是烟叶中最主要的多酚类物质，约占多酚含量的80％以上。烟叶香气前体物形成于烟叶生长发育过程中，其本身没
有香味，但在烟叶成熟、调制、醇化和燃烧过程中通过酶促反应和高温条件下的氧化、重排和裂解反应，转化形成具有香气的化合物，它能赋予烟草制品优雅的香气，增加烟草制品的香气量，对改善烟草制品品质有重要作用。类黄酮是烤烟重要的香气前体物之一，其中芸香苷在烟叶生长、成熟、调制、醇化和燃烧过程中的积累、转化和降解，生成二元酚类和糖醛衍生物，这些产物对卷烟烟气的香气特征有重要影响，尤其是对香气质和香气量有显著的影响。有研究表明烟叶中的芸香苷和绿原酸含量亦与烟叶等级高低之间存在密切联系。
5.目前，烟草中dfr基因对烟叶中芸香苷含量的影响未见报道，因此，研究在烟草中类黄酮合成代谢途径中两者的关系，可以为培育高香气质、高香气量和高品质烟草品种提供一定的理论依据和技术支撑。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是提供利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol-4-reductase,dfr)基因提升芸香苷含量的方法及应用，其为烟草的香味、吃味以及颜色等品质调控的品种培育研究提供遗传材料和理论依据。
7.本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
8.一种利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法，包括以下步骤：
9.(1)设计基于ntdfr1和ntdfr2基因的sgrna序列：
10.dfr1-sgrna：gtcatgagactccttgaacgtgg；
11.dfr2-sgrna：gaagccattcaaggctgtcaagg；
12.(2)设计并合成sgrna pcr引物：
13.dfr1-sgrna上游引物：agggtcatgccatacaaagagac，下游引物：agctgttcatgccccttctc；
14.dfr2-sgrna上游引物：acattcccctgactgttggttt；下游引物：gcggacttgtcagtggaagg。
15.(3)sgrna表达载体的构建：
16.将靶序列上下游引物双链退火并与预先用bsai酶切过的pore-cas9骨架载体连接，得crispr/cas9-sgrna表达载体；
17.(4)将crispr/cas9-sgrna表达载体转化农杆菌中：
18.取连接产物转化trans5α感受态细胞，37℃培养12～16h；
19.(5)侵染愈伤组织及阳性筛选：
20.利用悬浮农杆菌菌液浸泡侵染烟草叶盘10min后，再将叶盘置于含2.0mg/l naa 0.5mg/l 6-ba的ms固体培养基上培养；
21.用u26-jcf：5'-ttaggtttacccgccaata-3'和靶序列下游引物对菌斑进行阳性克隆的pcr扩增、克隆和测序筛选。从测序正确的菌中提取纯化质粒，-20℃冰箱保存备用。
22.(6)以液相色谱进行ntdfr1和ntdfr2基因纯合敲除素材的现蕾期叶片的烟碱含量的检测试验。
23.优选地，所述步骤(3)的连接体系为：酶切载体100ng，退火产物2μl，t4连接酶1μl，t4 buffer 1μl，ddh2o补齐至10μl，16℃连接30min。
24.优选地，所述步骤(3)中，crispr/cas9-sgrna表达载体为pore-cas9。
25.优选地，所述步骤(4)具体为：
26.将携带crispr/cas9-sgrna表达载体的农杆菌lba4404菌液浸泡侵染烟草叶盘，并获得t0代编辑植株种子和t1代种子。
27.优选地，所述步骤(4)中的液相色谱条件为：
28.色谱柱：capcell pak cr柱；
29.流速：0.8ml/min；
30.柱温：30℃；
31.进样量：10.0μl；
32.流动相a：乙酸：甲醇：水＝2％：10％：88％；流动相b：乙酸：甲醇：水＝2％：88％：10％；
33.检测时间：42.5min；
34.检测波长：340nm。
35.优选地，所述烟草的品种为红花大金元。
36.一种烟草突变体，所述烟草突变体是通过上述的利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法获得的植株。
37.一种利用基因编辑技术敲除烟草二氢黄酮醇-4-还原酶基因提升芸香苷含量的方法在选育烟草新品种中的应用。
38.本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
39.本发明通过crispr/cas9介导的基因编辑技术，构建了用于敲除ntdfr1和ntdfr2基因的crispr/cas9编辑载体，经编辑素材创制和分子检测鉴定后获得了ntdfr1和ntdfr2基因敲除的红花大金元编辑植株。本发明获得的ntdfr1和ntdfr2基因敲除的编辑植株，通过液相色谱检测发现，ntdfr1和ntdfr2基因敲除编辑植株开花期和成熟期的叶片芸香苷含量显著高于对照植株。
40.综上所述，利用crispr/cas9介导的基因编辑技术敲除ntdfr1/ntdfr2基因获得了芸香苷含量提高的编辑素材，这为烟草dfr基因功能研究及芸香苷含量调控的品种培育提供了遗传材料和理论依据。
附图说明
41.被结合在说明书中并构成说明书的一部分的附图示出了本发明的实施例，并且连同其说明一起用于解释本发明的原理。
42.图1为液相色谱法检测基因编辑样品和对照的烟叶芸香苷含量结果。
具体实施方式
43.现在将参照附图来详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到：除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
44.以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
45.实施例1表达载体的构建
46.利用ncbi中查询所获得dfr基因ntdfr1和ntdfr2，本发明进一步构建了crispr/cas9载体，以及利用叶盘法转化获得基因编辑植株。
47.(1)ntdfr1和ntdfr2基因的特异性的核苷酸序列sgrna序列的设计和合成：
48.利用在线软件crispr-p 2.0(http://cbi.hzau.edu.cn/crispr/)设计sgrna引导序列，选择分值较高且位于ntdfr1和ntdfr2基因序列合适位置的引导序列。本技术选择的sgrna序列为：
49.dfr1-sgrna：gtcatgagactccttgaacgtgg(seq id no.1)；
50.dfr2-sgrna：gaagccattcaaggctgtcaagg(seq id no.2)。
51.(2)引物退火、酶切以及连接：将合成的靶序列上下游引物双链退火并与预先用bsai酶切过的pore-cas9骨架载体连接。
52.连接体系：酶切载体100ng，退火产物2μl，t4连接酶1μl，t4 buffer1μl，ddh2o补齐至10μl，16℃连接30min。
53.dfr1-sgrna的引物：
54.上游引物：agggtcatgccatacaaagagac(seq id no.3)；
55.下游引物：agctgttcatgccccttctc(seq id no.4)；
56.dfr2-sgrna的引物：
57.上游引物：acattcccctgactgttggttt(seq id no.5)；
58.下游引物：gcggacttgtcagtggaagg(seq id no.6)。
59.(3)转化大肠杆菌：
60.取连接产物转化trans5α感受态细胞，37℃培养12～16h。
61.(4)阳性克隆筛选：
62.用上游引物u26-jcf：5'-ttaggtttacccgccaata-3'(seq id no.7)和靶序列下游引物对菌斑进行阳性克隆的pcr扩增、克隆和测序筛选。从测序正确的菌中提取纯化质粒，-20℃冰箱保存备用。
63.实施例3转化农杆菌
64.利用上一步所构建的crispr/cas9-ntdfr1和crispr/cas9-ntdfr2编辑载体质粒，以红花大金元为例，进行遗传转化和组培，以获得烟草dfr基因发生敲除编辑的植株，相关实验过程简要介绍如下。
65.将烟草种子表面消毒后点种至ms培养基上，待长到4片子叶(15-20d)，移入含ms固体培养基的培养瓶中，于25
±
1℃、光照强度30-50μmol/(m2·
s)，光照时间为16h/d条件继续培养35-40d，备用。
66.将正确序列的质粒转化农杆菌，具体步骤如下：
67.(1)取出-80℃保存的lba4404电转化感受态农杆菌细胞，置于冰上冻融。
68.(2)待感受态刚刚解冻时，crispr/cas9-ntdfr1和crispr/cas9-ntdfr2编辑载体质粒各2μl，混匀，置于冰上。
69.(3)将混匀的感受态转移至预冷的电转杯中，将电转杯置于电转仪中进行转化，转化完成后加入1ml的yeb液体培养基与转化液进行混合，后置于摇床28℃，200rpm培养1.5-2h。
70.(4)培养基在8,000rpm离心，弃上清，再用200μl的yeb液体培养基悬浮菌体，涂于含50mg/l利福平、50mg/l链霉素和50mg/l卡那霉素的yeb固体培养基上28℃倒置黑暗培养2-3d。
71.实施例4侵染愈伤组织
72.(1)在超净工作台中制作烟草叶盘成边长为1cm的方形叶盘，用ms液体制备含有crispr/cas9-ntdfr1和crispr/cas9-ntdfr2编辑载体的农杆菌菌落成悬浮菌液(od
600
＝0.6-0.8)。
73.(2)利用悬浮农杆菌菌液浸泡侵染烟草叶盘10min。
74.(3)将叶盘置于含2.0mg/l naa 0.5mg/l 6-ba的ms固体培养基上，28℃，黑暗，共培养3d。
75.(4)进行继代培养，放置于含2.0mg/l naa 0.5mg/l 6-ba 250mg/l cb 50mg/l kan的ms固体培养基上。
76.培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2
·
s)，25℃黑暗培养8h/d，培养45-60d，直至分化芽形成，每7-10d更换一次分化培养的培养基，更换3-4次；培养至分化芽形成；将已有分化芽形成的愈伤组织切下，置于含有500mg/l羧苄青霉素与50mg/l卡那霉素的ms培养基上进行培养，待愈伤组织上分化芽培养长至2-4cm高，培养条件与分化培养条件一致，培养8-14d；再生植株生根培养，将分化芽切下，插入含有500mg/l羧苄青霉素与50mg/l卡那霉素的ms培养基上进行生根培养，培养条件与分化培养条件一致，培养20-30d，再生移栽至花盆后进行培养，后进行转化植株叶片取样，送华大基因进行分子检测，确定获得ntdfr1和ntdfr2基因编辑植株，之后进行收种获得t0代编辑植株种子。
77.t0代种子按23倍进行自交纯合扩繁，待植株长到5-6片叶时，单株的叶片取样，送华大基因进行分子检测，确定获得ntdfr1和ntdfr2基因发生纯合编辑的植株，之后进行收种获得ntdfr1和ntdfr2基因纯合编辑的t1代种子。
78.实施例5液相色谱检测
79.利用实施例1中分子检测确定为ntdfr1和ntdfr2基因纯合敲除的植株，进行收种获得基因纯合编辑素材。随后以液相色谱进行ntdfr1和ntdfr2基因纯合敲除素材的开花期和成熟期叶片的芸香苷检测试验。
80.在烟株开花期和成熟期，分别采集5株对照(未编辑)烟草植株样本，采集中部同一叶位的叶片；选择开花期/成熟期的烟株，采集5株ntdfr1/ntdfr2基因纯合编辑的烟草植株样本；叶片去主筋，锡箔纸包裹液氮保存运输，实验室超低温(-70℃)保存，冻干磨粉过筛。
81.称取50mg冷冻干燥后的样品至15ml离心管中，加入80％甲醇溶液5ml，超声提取40分钟，提取液用0.45μm的有机相微孔滤膜过滤至液相色谱样品瓶中，等待上机测试。
82.液相色谱条件：色谱柱：capcell pak cr柱(4.6mm
×
250mm，5μm)；流速：0.8ml/min；柱温：30℃，进样量：10.0μl；流动相a：乙酸：甲醇：水＝2％：10％：88％；流动相b：乙酸：甲醇：水＝2％：88％：10％，梯度洗脱程序见表1；检测时间：42.5min；检测波长：340nm。
83.表1液相色谱梯度洗脱程序
[0084][0085]
对照(未编辑)及ntdfr1和ntdfr2基因纯合编辑烟草植株现蕾期叶片芸香苷含量比较(结果如图1和表2所示)。
[0086]
表2芸香苷含量检测结果
[0087][0088]
结果表明：通过液相色谱检测发现，ntdfr1和ntdfr2基因敲除编辑植株成熟期的叶片芸香苷含量显著高于对照植株，这为烟草的香味、吃味以及颜色等品质调控的品种培育研究提供遗传材料和理论依据。
[0089]
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。