一株低温下喹诺酮类抗生素降解真菌及其应用的制作方法

一株低温下喹诺酮类抗生素降解真菌及其应用
1.本发明涉及生物法处理抗生素污染的技术领域，涉及一种降解微生物，具体涉及一株低温可降解喹诺酮类抗生素的真菌及其应用。


背景技术：

2.喹诺酮类抗生素是一类人畜通用的药物。因其具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉耐药性和毒副作用小等特点，被广泛应用于畜牧、水产等养殖业中，包括在鸡、鸭、鹅、猪、牛、羊、鱼、虾、蟹等的养殖中用于疾病防治。恩诺沙星是喹诺酮类抗生素的一种，具有抗菌谱广、杀菌力强、作用迅速、体内分布广泛及与其他抗生素之间无交叉耐药性等特点，预防和治疗畜禽的细菌性感染及支原体病有良好的效果，被国家指定为动物专用药，其能与细菌dna回旋酶亚基a结合，从而抑制了酶的切割与连接功能，阻止了细菌dna的复制，而呈现抗菌作用。
3.据统计,国内抗生素每年总产量大约为21万吨,国内消费量约18万吨,其中用于畜牧及饲料行业的抗生素就高达9.7万吨,约占54％。而抗生素进入动物机体后,少部分以原形或者代谢产物方式蓄积于组织、器官以及蛋奶等产品中,而有相当部分以原形或者代谢产物随粪、尿等排泄物排出。这些外排的动物粪便中抗生素的含量普遍较高，现已经成为环境中抗生素污染的重要来源。我国每年有超过350t的喹诺酮类抗生素被用于畜禽养殖业，由于喹诺酮类物质在固相介质上吸附显著,在环境中的残留不易自然降解，具有持久性。
4.抗生素进入土壤环境中经过迁移转化,对植物、土壤动物和微生物的生长发育和繁殖造成了不同程度的影响,还会诱导抗性细菌和抗性基因的丰度增加，继而随着食物链对人类健康造成潜在威胁。喹诺酮类抗生素进入环境后,降解一般会降低其药效,但有些喹诺酮类抗生素的代谢物有着和抗生素母体相同甚至更强的毒性,并且可能转化成抗生素原药。
5.近年来，研究者探索了电化学氧化、高级氧化、光降解、材料吸附和生物降解法等多种方法以去除环境中的抗生素污染。生物降解法作为一种环境友好且有效的抗生素去除方法受到了广泛的关注，而微生物在环境污染物的生物降解中起着重要的作用。目前多数研究集中于常温下细菌降解抗生素，关于低温下真菌降解抗生素研究较少，本研究提供一种可以在低温下可降解喹诺酮类抗生素的真菌，为低温下抗生素降解提供研究基础。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于突破低温障碍，提供一株低温可降解喹诺酮类抗生素的真菌及其应用。
7.为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
8.一株降解微生物，降解微生物为地霉属geotrichum sp.，已于2021年7月22日保藏与中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号cgmcc no.23069。
9.所述降解微生物在降解喹诺酮类抗生素中的应用。
10.所述降解微生物在5℃-15℃降解喹诺酮类抗生素中的应用。
11.一种降解菌制剂，制剂含所述的降解微生物。
12.所述制剂为含降解微生物的菌悬液。
13.所述菌悬液为将所述地霉属geotrichum sp.用无菌水进行孢子洗脱，后收集孢子悬浮液即得。
14.一种降解菌制剂，所述制剂在降解喹诺酮类抗生素中的应用。
15.所述降解微生物在5℃-15℃降解喹诺酮类抗生素中的应用。
16.所述降解微生物在5℃-15℃降解恩诺沙星中的应用。
17.本发明与现有技术相比具有以下技术效果：
18.本发明筛选得到一株低温下可高效降解恩诺沙星的真菌，通过its序列分析，该菌株被鉴定为geotrichum sp.(地霉属)，并将其命名为ez-8。保藏编号为cgmcc no.23069。本发明中所使用的菌株对于降解恩诺沙星效率高，恩诺沙星初始含量为20mg/l，温度为15℃下，菌株20d降解率达到67.7％,比空白不加菌降解率高约32％；温度为10℃下，菌株20d降解率达到59.3％，比空白不加菌降解率高约30％；温度为5℃时，菌株20d降解率达到56.5％，比空白不加菌降解率高约27％。此发明为去除环境中的恩诺沙星提供了有效的生物途径。
附图说明
19.图1为本发明实施例提供的菌株ez-8的菌落形态图；
20.图2为本发明实施例提供的5℃下菌株ez-8降解恩诺沙星的hplc-ms/ms定量检测结果。
21.图3为本发明实施例提供的10℃下菌株ez-8降解恩诺沙星的hplc-ms/ms定量检测结果。
22.图4为本发明实施例提供的15℃下菌株ez-8降解恩诺沙星的hplc-ms/ms定量检测结果。
具体实施方式
23.以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
24.本发明所附图式所绘制的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解和阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，在任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
25.本发明的高效液相色谱-串联质谱测定方法包括：高效液相色谱-串联质谱法(hplc-ms/ms)定量分析恩诺沙星的浓度。atlantis t3色谱柱(3μm，2.1*150mm)，柱温为30℃，流动相由98％(v/v)乙酸铵 0.1％甲酸水溶液(a)和2％(v/v)乙腈(b)组成，进样速度为0.4ml/min，进样量10μl。
26.下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
27.如未特别说明，本发明采用的设备均为本领域常规设备。
28.本发明下述实施例所使用的培养基配制方法如下：
29.1.富集培养基：(nh4)2so
4 2.0g；k2hpo
4 0.5g；nah2po
4 0.5g；ph 7.0-7.4；蒸馏水1000ml，调节ph至7.0-7.4，121℃灭菌20min。
30.2.pda培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、蒸馏水1000ml，自然ph。
31.3.普通液体培养基：葡萄糖10g，酒石酸铵0.2g,kh2po
4 2g,mgso4·
7h2o 0.75g,cacl
2 0.1g，cuso
4 0.064mg,维生素b
1 2mg,吐温801g，蒸馏水1l，微量元素溶液20ml，20mm酒石酸缓冲液调节ph至4.5，115℃灭菌30min。
32.4.微量元素溶液：mgso
4 3g,mnso
4 0.5g,nacl 1.0g,feso4·
7h2o 0.1g,cocl
2 0.1g，znso4·
7h2o 0.1g,alk(so4)2·
2h2o 10mg,h3bo
3 10mg,na2moo4·
2h2o 10mg,蒸馏水1l。
33.实施例1：地霉属geotrichum sp.真菌的分离
34.从辽宁省沈阳市沈北新区某畜禽养殖场土壤的土壤中，经过富集、分离和纯化得到，具体的，包括以下步骤：
35.步骤一：菌株的富集
36.取污染土壤5g加入到含恩诺沙星浓度为20mg/l的富集培养基中，放入15℃条件下的摇床中暗培养，7d后取培养液按照10％的接种量再次接种到含有恩诺沙星浓度为50mg/l的普通培养基中，其他条件不变，培养7d，重复以上操作步骤每次恩诺沙星浓度增加30mg/l，直至富集培养基中的恩诺沙星的最终浓度为200mg/l；
37.步骤二：菌株的分离与纯化
38.富集结束后，取培养液200μl经无菌水按100、10-1
、10-2
、10-3
进行梯度稀释，不同浓度稀释后的菌液，分别采取平板涂布法进行分离，挑取菌落形态外观不同的单菌落在pda固体培养基上按照常规方式划线进一步分离纯化，分离纯化后挑取单菌落接种至斜面，编号保存；
39.步骤三：降解菌株筛选
40.将分离出的各个单菌株分别按10％的接种量接种到含有20mg/l恩诺沙星的普通液体培养基中15℃、160rpm条件下摇床避光振荡培养30d，使用高效液相色谱-串联质谱法定量检测恩诺沙星残留浓度，获得具有恩诺沙星降解能力的菌株，将降解能力最强的菌株命名为ez-8。
41.高效液相色谱-串联质谱测定方法
42.高效液相色谱-串联质谱法(hplc-ms/ms)定量分析恩诺沙星的浓度。atlantis t3色谱柱(3μm，2.1*150mm)，柱温为30℃，流动相由98％(v/v)乙酸铵 0.1％甲酸水溶液(a)和2％(v/v)乙腈(b)组成，进样速度为0.4ml/min，进样量10μl。
43.该菌株在低温下对恩诺沙星具有降解作用，具有如下特征：
44.将纯化的ez-8菌株接种在pda固体培养基上，28℃下培养7d，菌落呈白色粉状，质地粘稠，如图1所示。
45.实施例2：地霉属geotrichum sp.真菌的鉴定
46.(1)基因组提取
47.使用生工生物工程(上海)股份有限公司真菌基因组dna快速抽提试剂盒(货号：
b518229-0050)，按照说明书操作提取菌株ez-8的基因组dna。
48.(2)pcr扩增
49.its通用引物为its1:5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3’；its4:5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’，pcr长度为400bp左右。
50.pcr反应体系：
[0051][0052]
pcr反应参数：
[0053]
95℃预变性4min，94℃变形30s，57℃复性30s，72℃延伸40s，72℃延伸7min，共进行35个循环。
[0054]
(3)凝胶电泳
[0055]
最后将所得的pcr产物用1％琼脂糖凝胶，80v 30min电泳观察。将扩增成功的pcr产物送往华大基因科技有限公司测序，测序引物与扩增引物相同。得到菌株ez-8的its基因的核苷酸序列，菌株ez-8的its基因的核苷酸序列如下所示。
[0056]
菌株ez-8基因序列表
[0057]
gacctgcggaaggatcattatgaattataaatatttgtgaatttaccacagcaaacaaaa 60
[0058]
atcatacaatcaaaacaaaaataattaaaacttttaacaatggatctcttggttctcgta 120
[0059]
tcgatgaagaacgcagcgaaacgcgatatttcttgtgaattgcagaagtgaatcatcagt 180
[0060]
ttttgaacgcacattgcactttggggtatcccccaaagtatacttgtttgagcgttgttt 240
[0061]
ctctcttggaattgctttgctcttctaaaatttcgaatcaaattcgtttgaaaaacaaca 300
[0062]
ctattcaacctcagatcaagtaggattacccgctgaacttaagcatatcaata 353
[0063]
上述序列由353碱基(bp)组成。所测得的its基因序列在美国国立生物信息中心(ncbi)网站上进行blast搜索比对，得到相似度较高的菌株，分析结果表明，菌株ez-8被鉴定为地霉属。
[0064]
所述菌株ez-8真菌为地霉属geotrichum sp.，已于2021年7月22日保藏与中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmcc no.23069，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0065]
实施例3：ez-8对恩诺沙星的降解效果验证
[0066]
用无菌水将ez-8菌株孢子洗脱，经纱布过滤、无菌水稀释配置成1
×
106cfu
·
ml-1
的菌悬液。
[0067]
而后按照10％接种量接种到含有20mg
·
l-1
恩诺沙星的液体培养基中，每组设3个平行，分别于5℃、10℃和15℃、160rpm振荡避光培养，以不加菌作为空白对照。将所得培养液超声后用滤纸过滤菌丝，取上清液用0.22μm微膜过滤，将过滤的上清液通过高效液相色
谱串联质谱仪进行恩诺沙星的定量检测(参见图2-4)。
[0068]
计算公式如下：
[0069][0070]
结果表明，5℃20d，未加ez-8菌株的培养基中，恩诺沙星降解率为29.5％，加有ez-8菌株的培养基中，恩诺沙星的降解率为56.5％；10℃20d，未加ez-8菌株的培养基中，恩诺沙星降解率为30.8％，加有ez-8菌株的培养基中，恩诺沙星的降解率为59.3％；15℃20d，未加ez-8菌株的培养基中，恩诺沙星降解率为35.3％，加有ez-8菌株的培养基中，恩诺沙星的降解率为67.7％。
[0071]
上列实施例，对本发明的目的、技术方案等进行了进一步地详细说明，所应说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围内。
[0072]
以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
[0073]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0074]
此外，本发公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所发明的内容。