基于紫薯蛋白多酚复合物酶解的降血糖多肽、制备方法和应用与流程

1.本发明涉及食品工程领域，具体为一种基于紫薯蛋白多酚复合物酶解的降血糖多肽的制备方法。


背景技术：

2.紫薯又叫黑薯，薯肉呈紫色至深紫色。紫薯的营养丰富且具有多重特殊保健功能。
3.研究发现，紫薯富含花青素、淀粉、蛋白质、可食性纤维、维生素、微量元素、可溶性无氧化物质等多种营养成分，经常食用则具有减肥、健美和健身防癌等作用。其中，鲜紫薯中淀粉含量24％，占干物质的70％以上。紫薯中含有20％(干基)左右的蛋白质，包括了18种氨基酸，易被人体消化和吸收，其中包括维生素a、b、c等8种维生素和铁、磷、锰等10多种矿物元素。
4.虽然紫薯具有很多生物学功能，但主要用于提取花青素和淀粉。但对于紫薯蛋白的提取制备、加工、应用等目前尚无成熟技术。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于紫薯蛋白多酚复合物酶解的降血糖多肽、制备方法和应用，其通过多级盐析的方式沉淀蛋白质，以大幅提高紫薯蛋白的提取效率和质量，进一步再对紫薯蛋白多酚复合物进行下一步的酶解和分离，以获得具有降血糖功效的多肽，使其可作为天然降血糖物质应用于降低机体血糖，防治糖尿病。
6.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案如下：
7.提供了一种基于紫薯蛋白多酚复合物酶解的降血糖多肽的制备方法，其包括如下步骤：
8.s1、制备紫薯蛋白多酚复合物；
9.s2、称取所述紫薯多酚蛋白复合物，加入蒸馏水，配制得到底物浓度为0.01g/ml的酶解体系，添加木瓜蛋白酶，在ph7.0，温度50℃条件下酶解0.5-1.5h，所述木瓜蛋白酶添加量为4000-6000u/g；经木瓜蛋白酶酶解后，对酶解体系进行酶灭活以及冷却，再加入碱性蛋白酶，在ph 8.0，温度60℃条件下酶解4-6h，所述碱性蛋白酶添加量为5000-7000u/g；
10.s3、将完成步骤s2后所获得的酶解体系过经甲醇活化后的sep-pak柱进行脱盐，然后用蒸馏水进行洗脱，洗脱得到的溶液在35-40℃下减压浓缩，对收集到的浓缩液进行冻干，以获得冻干样品；
11.s4、将冻干样品用蒸馏水配制成质量分数5％的样品溶液，置于超滤离心管中，于4℃、3000-5000r/min条件下离心30-60min，分离得到分子量≤3kda的组分；
12.以及s5、将分子量≤3kda的组分进行凝胶色谱分离；收集洗脱液，得到2个不同的洗脱峰，并对洗脱峰所对应的组分进行鉴定，以确定出其中具有降血糖功效的组分，然后将具有降血糖功效的组分冻干成粉，即获得所述降血糖多肽。
13.优选的，所述步骤s1包括：
14.s11、挑选无损伤、无腐烂的新鲜紫薯洗净，去皮后切块，加入蒸馏水以及质量分数为1-2％的柠檬酸溶液进行打浆，以获得紫薯浆液，并对所述紫薯浆液进行酶解，以获得紫薯酶解浆液；
15.s12、对所述紫薯酶解浆液进行高压脉冲电场处理，然后再进行高压均质；
16.s13、经步骤s12处理后的紫薯酶解浆液在3000-5000r/min条件下离心20-30min，得第一上清液以及第一沉淀；第一上清液中添加硫酸铵至饱和度35％，在4℃下搅拌0.5-1h后，在3000-5000r/min条件下离心20-30min，得到第二沉淀以及第二上清液；取第二上清液，添加硫酸铵至饱和度60％，在4℃下搅拌1-1.5h后，在4000-5000r/min条件下离心15-25min，得到第三沉淀以及第三上清液；取第三上清液，添加硫酸铵至饱和度90％，在4℃下搅拌1-1.5h后，经4000-6000r/min离心10-20min，得到第四沉淀以及第四上清液；
17.s14、合并第二沉淀、第三沉淀以及第四沉淀，干燥后得到第一紫薯多酚蛋白提取物；
18.s15、合并第一上清液、第二上清液、第三上清液以及第四上清液，使用大孔树脂对合并后的上清液进行吸附-解析，上柱流速为3-5bv/h，透过液冷冻干燥后得到第二紫薯多酚蛋白提取物；
19.s16、合并第一紫薯多酚蛋白提取物以及第二紫薯多酚蛋白提取物，以得到所述紫薯蛋白多酚复合物。
20.优选的，步骤s11中，蒸馏水与质量分数为1-2％的柠檬酸溶液的重量是紫薯重量的2-3倍；且质量分数为1-2％的柠檬酸溶液与蒸馏水的体积比为1：3。
21.优选的，步骤s11中，所述酶解条件为：加入紫薯浆液质量1-2％的α-淀粉酶，调节ph至4.5-5.5，酶解温度45-55℃，酶解时间1-1.5h。
22.优选的，所述高压脉冲电场强度为20-40kv
·
cm-1
，且作用在紫薯酶解浆液上的时间为4.5μs；所述高压均质压力为50-100mpa，均质时间为30min；
23.优选的，步骤s14包括：合并第二沉淀第三沉淀以及第四沉淀，然后进行透析/纳滤膜脱盐，直至透过液的电阻率为8-10μs/cm；然后干燥后得到第一紫薯多酚蛋白提取物，所述纳滤膜截留分子量为150-500da。
24.优选的，所述步骤s5中，所述凝胶色谱分离条件为：加样量为1ml，加样浓度为50mg/ml，洗脱流速为2r/min。
25.还提供一种利用权利要求上述制备方法制备获得的降血糖多肽。
26.还提供一种上述降血糖多肽在制备降血糖食品/药品/保健品中的应用。
27.本发明结合酶解、高压脉冲电场以及高压均质对紫薯原料进行处理，进一步通过在不同阶段添加不同量的硫酸铵，以多级盐析的方式充分沉淀紫薯蛋白质，以大幅提高紫薯蛋白的提取效率和质量，进一步再对紫薯蛋白多酚复合物进行下一步的酶解和分离，以获得具有降血糖功效的多肽，使其可作为天然降血糖物质应用于降低机体血糖，防治糖尿病。
附图说明
28.图1为本发明紫薯蛋白多酚复合物酶解及降血糖多肽的制备方法流程图；
29.图2为紫薯蛋白多酚复合物经sds-page电泳后的结果图；
30.图3为组分1、组分3、组分3对hepg2细胞葡萄糖消耗的影响；
31.图4为本发明组分1不同洗脱峰的结果图；
32.图5为组分1中峰1组分和峰2组分hepg2细胞葡萄糖消耗的影响。
33.图6为峰1组分中不同氨基酸的占比结果；
34.图7为峰1组分中疏水性氨基酸与非疏水性氨基酸的占比结果；
具体实施方式
35.下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
36.实施例1：
37.本实施例提供了一种基于紫薯蛋白多酚复合物酶解的降血糖多肽的制备方法，如图1所示，其包括如下步骤：
38.s1、制备紫薯蛋白多酚复合物；
39.s2、称取所述紫薯多酚蛋白复合物，加入蒸馏水，配制得到底物浓度为0.01g/ml的酶解体系，添加木瓜蛋白酶，在ph7.0，温度50℃条件下酶解0.5-1.5h，所述木瓜蛋白酶添加量为4000-6000u/g；经木瓜蛋白酶酶解后，对酶解体系进行酶灭活以及冷却，再加入碱性蛋白酶，在ph 8.0，温度60℃条件下酶解4-6h，所述碱性蛋白酶添加量为5000-7000u/g；
40.s3、将完成步骤s2后所获得的酶解体系过经甲醇活化后的sep-pak柱进行脱盐，然后用蒸馏水进行洗脱，洗脱得到的溶液在35-40℃下减压浓缩，对收集到的浓缩液进行冻干，以获得冻干样品；
41.s4、将冻干样品用蒸馏水配制成质量分数5％的样品溶液，置于超滤离心管中，于4℃、3000-5000r/min条件下离心30-60min，分离得到分子量≤3kda的组分1、3kda＜分子量≤10kda的组分2以及分子量≥10kda的组分3；
42.以及s5、将分子量≤3kda的组分1进行g75凝胶色谱分离；收集洗脱液，洗脱液经过220nm紫外检测，得到2个不同的洗脱峰(如图2所示)，将2个不同洗脱峰对应的组分进行收集，并对洗脱峰所对应的组分进行鉴定，以确定出其中具有降血糖功效的组分，然后将具有降血糖功效的组分然后冻干成粉，即获得所述降血糖多肽。
43.优选的，所述步骤s1包括：
44.s11、挑选无损伤、无腐烂的新鲜紫薯洗净，去皮后切块，加入蒸馏水以及质量分数为1％的柠檬酸溶液打浆，以获得紫薯浆液，再加入紫薯浆液质量的1％的α-淀粉酶，调节ph至4.5，酶解温度45℃，酶解时间1h，以获得紫薯酶解浆液；具体的，质量分数为1％的柠檬酸溶液与蒸馏水的重量和是紫薯重量的2倍；且质量分数为1％的柠檬酸溶液与蒸馏水的体积比为1：3；
45.由此可先通过酸溶液破坏细胞壁、细胞膜等结构，增加细胞壁、细胞膜透性，使细胞内容物(如蛋白质、多肽等)充分释放，进一步采用α-淀粉酶以提高蛋白提取质量和产量；
46.s12、对所述紫薯酶解浆液进行高压脉冲电场处理，然后再进行高压均质处理；其
中，所述高压脉冲电场强度为20kv
·
cm-1
，且作用在紫薯浆液上的时间为4.5μs；所述压力为50mpa，均质时间为30min；
47.s13、经步骤s12处理后的紫薯酶解浆液在3000r/min条件下离心20min，得第一上清液以及第一沉淀；第一上清液中添加硫酸铵至饱和度35％，在4℃下搅拌0.5h后，在3000r/min条件下离心20min，得到第二沉淀以及第二上清液；取第二上清液，添加硫酸铵至饱和度60％，在4℃下搅拌1-1.5h后，在4000r/min条件下离心15min，得到第三沉淀以及第三上清液；取第三上清液，添加硫酸铵至饱和度90％，在4℃下搅拌1h后，经4000r/min离心10min，得到第四沉淀以及第四上清液；本步骤中，通过在不同阶段添加不同量的硫酸铵，使其达到不同的饱和度，由此可通过该多级盐析的方式充分沉淀紫薯蛋白质；
48.s14、合并第二沉淀、第三沉淀以及第四沉淀，然后进行透析/纳滤膜脱盐，直至透过液的电阻率为8-10μs/cm，干燥后得到第一紫薯多酚蛋白提取物；纳滤膜脱盐时采用的纳滤膜截留分子量为150-500da，由此可通过透析/纳滤膜充分脱盐，以保证提取蛋白的纯度和质量；
49.s15、合并第一上清液、第二上清液、第三上清液以及第四上清液，使用大孔树脂对合并后的上清液进行吸附-解析，上柱流速为3bv/h，透过液冷冻干燥后得到第二紫薯多酚蛋白提取物；
50.s16、合并第一紫薯多酚蛋白提取物以及第二紫薯多酚蛋白提取物，得到所述紫薯蛋白多酚复合物。
51.实施例2：
52.本实施例与实施例1的不同之处仅在于，本实施例的步骤s11中，加入蒸馏水以及质量分数为2％的柠檬酸溶液打浆，以获得紫薯浆液，再加入紫薯浆液质量的2％的α-淀粉酶，调节ph至5.5，酶解温度55℃，酶解时间1.5h，以获得紫薯酶解浆液；且质量分数为2％的柠檬酸溶液与蒸馏水的重量和是紫薯重量的3倍；且质量分数为2％的柠檬酸溶液与蒸馏水的积比为1：3；
53.步骤s12中，所述高压脉冲电场强度为40kv
·
cm-1
，所述高压均质压力为100mpa；
54.步骤s13中，经步骤s2处理后的提取液在5000r/min条件下离心30min，得第一上清液以及第一沉淀；第一上清液中添加硫酸铵至饱和度35％，在4℃下搅拌1h后，在5000r/min条件下离心30min，得到第二沉淀以及第二上清液；取第二上清液，添加硫酸铵至饱和度60％，在4℃下搅拌1.5h后，在5000r/min条件下离心25min，得到第三沉淀以及第三上清液；取第三上清液，添加硫酸铵至饱和度90％，在4℃下搅拌1.5h后，经6000r/min离心20min，得到第四沉淀以及第四上清液；
55.步骤s15中，上柱流速为5bv/h。
56.其他与实施例1相同，在此不再赘述。
57.实施例3：
58.本实施例与实施例1的不同之处仅在于，本实施例的步骤s11中，加入蒸馏水以及质量分数为1.5％的柠檬酸溶液打浆，以获得紫薯浆液，再加入紫薯浆液质量的1.5％的α-淀粉酶，调节ph至5.0，酶解温度50℃，酶解时间75min，以获得紫薯酶解浆液；且质量分数为1.5％的柠檬酸溶液与蒸馏水的重量和是紫薯重量的2.5倍；且质量分数为1.5％的柠檬酸溶液与蒸馏水的体积比为1：3；
59.步骤s12中，所述高压脉冲电场强度为25kv
·
cm-1
，所述高压均质压力为80mpa；
60.步骤s13中，经步骤s2处理后的提取液在4000r/min条件下离心25min，得第一上清液以及第一沉淀；第一上清液中添加硫酸铵至饱和度35％，在4℃下搅拌75min后，在4000r/min条件下离心25min，得到第二沉淀以及第二上清液；取第二上清液，添加硫酸铵至饱和度60％，在4℃下搅拌80min后，在4500r/min条件下离心20min，得到第三沉淀以及第三上清液；取第三上清液，添加硫酸铵至饱和度90％，在4℃下搅拌70min后，经5000r/min离心15min，得到第四沉淀以及第四上清液；
61.步骤s15中，上柱流速为4bv/h。
62.其他与实施例1相同，在此不再赘述。
63.实施例4：
64.本实施例提供了一种利用实施例1-3任一项所述制备方法制备获得的降血糖多肽。
65.实施例5：
66.本实施例提供了一种实施例4所述制备方法制备获得的降血糖多肽在制备降血糖食品/药品/保健品中的应用。
67.表1示出了不同提取方法对紫薯多酚紫薯蛋白得率的影响。
68.表1不同提取方法对紫薯多酚紫薯蛋白得率的影响
[0069][0070][0071]
注：表1中常规提取指的是打浆后直接离心处理。
[0072]
从表1中可以看出，本发明中通过先柠檬酸处理，然后酶解完毕后再对所述紫薯浆液进行高压脉冲电场处理 高压均质处理，由此可充分促使细胞内容蛋白的析出，因此本发明的紫薯多酚蛋白复合物得率为2.13％，显著高于单一处理方式，如单一超声处理、单一高压脉冲电场处理所获得的蛋白得率，具体的，高压脉冲电场处理 高压均质处理的蛋白得率较单一高压脉冲电场处理提高了15％，较单一超声波辅助处理提高了39％，较常规方法提高了81％。
[0073]
表2示出了不同硫酸铵浓度对沉淀所得紫薯多酚蛋白复合物的蛋白纯度、占比的影响。
[0074]
表2不同硫酸铵浓度对紫薯多酚蛋白复合物的蛋白纯度、占比的影响
[0075] 蛋白纯度占比第二沉淀(硫酸铵饱和度35％)49.53
±
0.04％15.77％
第三沉淀(硫酸铵饱和度60％)72.23
±
0.07％60.01％第四沉淀(硫酸铵饱和度90％)46.84
±
0.03％24.22％
[0076]
从表2中可以看出，通过在不同阶段添加不同量的硫酸铵，以多级盐析的方式充分沉淀紫薯蛋白质，使得不同阶段沉淀得到的紫薯蛋白均具有较高的纯度和占比，由此使得最终获得的紫薯蛋白提取效率和质量均得以大幅提高。
[0077]
进一步的，本发明合并第一紫薯多酚蛋白提取物以及第二紫薯多酚蛋白提取物后得到的混合物的蛋白含量为62.50
±
0.09％，
[0078]
将本发明得到的紫薯多酚蛋白复合物进行sds-page分析，结果如图2所示。图2中，“1”泳道为紫薯多酚蛋白复合物中的蛋白，其显示有58、22、18和12kda四个染色带，条带清晰且不含杂质。由此说明，本发明通过多级沉淀结合膜分离的方式可有效提取紫薯蛋白，提高紫薯多酚复合物的质量。
[0079]
进一步的，采用triple-tof-ms对最终获得的紫薯蛋白多酚复合物进行测定。利用peaks studio软件在uniport数据库中搜库分析，从紫薯蛋白中共鉴定17种蛋白质，其结果如表3所示。
[0080]
表3紫薯蛋白多酚复合物蛋白鉴定结果
[0081][0082]
由此可发现，本发明最终获得的紫薯蛋白多酚复合物主要包括具有生物活性的酶类和sporamin蛋白，包括sporamin a、sporamin b、β-淀粉酶、preprosporamin、多酚氧化酶、蛋白酶抑制剂、超氧化物歧化酶、紫色酸性磷酸酶、putative phd zinc finger蛋白、nbs-lrr蛋白和果胶乙酰酯酶。由此说明本发明的制备方法可最大限度的保留紫薯蛋白多酚复合物中的各种活性成分，减少制备过程中的损失，有利于其充分发挥其作用功效。
[0083]
以下为分子量不同的组分1、组分2以及组分3对hepg2细胞葡萄糖消耗影响的功效实验。其具体过程如下。
[0084]
hepg2细胞培养：
[0085]
hepg2细胞经过复苏后，用含有10％新生牛血清的1640培养液转入培养瓶中，置于co2培养箱中培养，温度为37℃，相对湿度为90％，co2浓度为5％。单层贴壁后，每3d进行传代。
[0086]
降血糖多肽(以下为“降糖多肽”)对hepg2细胞葡萄糖消耗量的影响：
[0087]
选对数期增长的细胞进行实验，细胞经过0.25％胰蛋白酶消化后，用含有10％新生牛血清的1640培养液轻轻吹打成细胞悬液，稀释计数后，按每孔100ml含有104个细胞接种于96孔板中进行培养。待细胞贴壁后，设置正常对照组，模型组和给药组(二甲双胍组、组分1组、组分2组和组分3组)，正常对照组每组加入100ml的无血清1640培养液，模型组及给药组加入100ml含有10-7
mmol/l浓度的胰岛素的无血清1640培养液，培养24h后，弃去培养基，正常对照组和模型组加入100ml无血清1640培养液，给药组分别加入100ml含药的无血清1640培养液(含药浓度为1mg/ml,0.5mg/ml,0.1mg/ml,0.05mg/ml,0.01mg/ml)，继续培养24h，培养结束后，更换培养基，继续培养18h后，测定每孔培养液中的葡萄糖含量，计算葡萄糖消耗量。其结果如图3所示。
[0088]
胰岛素在机体糖代谢功能中起着重要作用，能够调控糖代谢相关酶的基因表达，低浓度的胰岛素可以起到细胞促进因子的作用，增加细胞中葡萄糖的消耗；胰岛素达到一定浓度后，会导致细胞对其敏感性降低，从而使细胞对葡萄糖的摄取与利用的能力降低。如图3所示，胰岛素建模组与正常对照组相比，细胞的葡萄糖消耗量降低，说明胰岛素抵抗模型建立成功。进行对应的给药后，三个组分的不同浓度的对于细胞葡萄糖消耗量的影响差距较大。三个组分均在浓度为0.1mg/ml时，hepg2细胞对葡萄糖的消耗量最大，且组分1组的葡萄糖消耗量明显要高于其他两组，可达12.18％，这说明组分1对细胞葡萄糖消耗量的影响效果要优于其他两个组分，具有良好的降血糖功效。同时，三个组分都没有明显的剂量依赖性，浓度高于或低于0.1mg/ml，hepg2细胞对葡萄糖的消耗量均呈下降趋势。
[0089]
由上述实验可知，组分1降血糖功效较好，对其进行凝胶色谱分离，结果如图4所示。由图4可知，组分1经过凝胶色谱分离后，于220nm紫外检测得到两个洗脱峰，分别为峰1和峰2。
[0090]
以下为组分1中峰1和峰2对应组分对hepg2细胞葡萄糖消耗影响的功效实验。其具体过程如下：
[0091]
选对数期增长的细胞进行实验，细胞经过0.25％胰蛋白酶消化后，用含有10％新生牛血清的1640培养液轻轻吹打成细胞悬液，稀释计数后，按每孔100l含有104个细胞接种于96孔板中进行培养。待细胞贴壁后，设置正常对照组，模型组和给药组(二甲双胍组、峰1组和峰2组)，正常对照组每组加入100l的无血清1640培养液，模型组及给药组加入100l含有胰岛素的无血清1640培养液，培养24h后，弃去培养基，正常对照组和模型组加入100l无血清1640培养液，给药组分别加入100l含药的无血清1640培养液(含药浓度为1mg/ml,0.5mg/ml,0.1mg/ml,0.05mg/ml,0.01mg/ml，继续培养24h，培养结束后，更换培养基，继续培养18h后，测定每孔培养液中的葡萄糖含量，计算葡萄糖消耗量。其结果如图5、表4所示。
[0092]
表4组分1中峰1和峰2对应组分对hepg2细胞葡萄糖消耗的影响
[0093][0094]
注：不同字母表示差异显著性(p《0.05)
[0095]
如表4及图5所示，胰岛素建模组与正常对照组相比，细胞的葡萄糖消耗量降低，说明胰岛素抵抗模型建立成功，进行对应的给药后，不同组分的不同浓度的对于细胞葡萄糖消耗量的影响差距较大。峰1组分在浓度为0.1mg/ml时，细胞对葡萄糖的消耗量最大，有16.20％，且没有明显的剂量依赖性，当浓度达到1mg/ml时，细胞对葡萄糖的消耗量低于了胰岛素模型组，这可能是由于浓度过大，对细胞的活性产生的抑制作用，从而使葡萄糖消耗量显著降低，说明峰1对应组分具有良好的降血糖功效。峰2组分在浓度为0.1mg/ml时，细胞对葡萄糖的消耗量最大，有8.77％，但显著低于细胞在峰1组分下的葡萄糖消耗量，这说明峰1组分对于细胞葡萄糖消耗量的影响效果明显优于峰2组分。
[0096]
由上述功效实验可知，步骤s5中得到的2个不同洗脱峰(如图4所示，即峰1和峰2)中，峰1对应组分对细胞葡萄糖消耗量及生长活性的影响效果均比峰2好，因此对峰1对应组分进行分子量及氨基酸组成成分分析，结果如图6-7，表5所示。
[0097]
具体的，峰1对应组分的分子量和氨基酸组成分析过程如下。
[0098]
采用凝胶渗透色谱-示差检测-18角激光光散射(gpc-ri-malls)分析联用技术测定。gpc-ri-malls联用分析条件：流动相为1.0％nacl水溶液；流速为0.7ml/min；varian210泵；wyatt十八角激光光散射检测器；wyatt示差折光检测器；色谱柱为pl aquage 408.0
×
300mm；柱温30℃；检测器温度30℃。
[0099]
氨基酸组成成分采用氨基酸分析仪测定。氨基酸分析仪的色谱条件为：na型阳离子交换柱4.6
×
60nm；流动相：柠檬酸三钠缓冲液；四元梯度洗脱：ph3.2-4.9；检测波长：
510nm；流速：0.4ml；柱温：50℃。
[0100]
表5峰1对应组分分子量分析
[0101][0102]
由图6-7可知，峰1中疏水性氨基酸如苯丙氨酸、缬氨酸等所占比例较多，高达39.6％，而具有高降血糖活性的组分中疏水性氨基酸含量显著高于其他组分中的含量。由此可以推断峰1对应组分具有降血糖功能。
[0103]
综上所示，本发明结合酶解、高压脉冲电场以及高压均质对紫薯原料进行处理，进一步通过在不同阶段添加不同量的硫酸铵，以多级盐析的方式充分沉淀紫薯蛋白质，以大幅提高紫薯蛋白的提取效率和质量，进一步再对紫薯蛋白多酚复合物进行下一步的酶解和分离，以获得具有降血糖功效的多肽，使其可作为天然降血糖物质应用于降低机体血糖，防治糖尿病。
[0104]
需要说明的是，上述实施例1至5中的技术特征可进行任意组合，且组合而成的技术方案均属于本发明的保护范围。术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0105]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。