纳米纤维素/木质纤维复合式纸基唾液葡萄糖检测芯片的制作方法

1.本发明属于纸基微流控检测芯片技术领域，具体涉及一种纳米纤维素/木质纤维复合式纸基唾液葡萄糖检测芯片。


背景技术：

2.糖尿病是一种因体内胰岛素不足所导致的全身性代谢疾病，由于目前还没有根治的方法，其控制主要依赖于患者频繁地检测血糖浓度来及时调整降糖药物的用量，以达到预防和控制并发症的目的。然而，现有血糖即时检测工具均需进行针刺采血，这不仅给患者带来痛苦，还增加了伤口感染的风险。临床研究表明，唾液葡萄糖含量与血液葡萄糖含量具有高度相关性，且唾液采集属于无创采集方式。因此，开展唾液葡萄糖即时检测技术的研究，对于实现人体葡萄糖水平无创式监测将具有重大意义。
3.纸基微流控芯片是2007年由哈佛大学whitesides教授提出的一种新型检测分析器件。它充分利用纸基材料亲水、多孔、生物兼容性高等特性，在纸基基层上构建微流体网络通道，将检测示剂固定在纸基上，以实现分析检测的目的。这种检测分析器件既具有纸材料低价、易得、加工便利、无生物污染的特点，又具有微型化、便携化的优势。同时，其设计还需遵循世界卫生组织对于即时检测技术所提出的assured原则。近几年，已有为数不多的几名国内外学者尝试将纸基微流控芯片应用于唾液葡萄糖的检测，例如，巴西学者coltro等人以葡萄糖氧化酶比色法为检测原理，制作出具有多通道可以同时检测唾液葡萄糖及亚硝酸盐的纸基微流控芯片，并将其与牙托相连接，使其成为可穿戴的检测器件；新加坡学者tan等人以滤纸制作的圆形纸片为载体，在其上负载葡萄糖氧化酶，再将其覆盖到普鲁士蓝修饰的碳电极上对葡萄糖进行电化学法的检测；我国学者ni等人通过在纸基表面负载氧化石墨烯的方法使葡萄糖检测反应可以更加均匀地在纸基表面发生，从而提高使用葡萄糖酶比色法检测的精准度，并设计手机颜色识别应用通过对颜色密度的识别实现其即时检测的功能；巴西学者gabriel等人通过使用壳聚糖对纸基表面进行改性的方式提高葡萄糖氧化酶比色法检测唾液葡萄糖浓度的灵敏度。这些研究验证了纸基微流控芯片在唾液葡萄糖即时检测中应用的可能性及相比其他方法所具有的独特优势。然而，至今还没有一项产品可以突破使唾液葡萄糖检测精准度真正满足临床使用要求的难题。
4.值得注意的是，在采用纸基微流控芯片对唾液葡萄糖的进行检测的过程中，检测结果往往受到多种检测酶在纸基上进行负载与保存、纸基纤维网络对葡萄糖的有效捕捉、唾液微流体在纸基中流动控制等关键因素的制约和影响。这些多样化因素常常导致每个微反应过程的对纸基材料的最优特性需求不同，甚至差异较大。这就成为制约纸基微流控芯片应用于唾液葡萄糖检测的一个关键问题。在过去的绝大多数研究中，大部分学者仅是简单地使用单层纸基作为反应载体，完成检测的所有流程；且很少有针对检测试剂和待测样品的性质及反应特点，从纸基的结构构造、纤维种类及物理、化学性质上进行设计和构建，从而达到最优检测效果的。这就导致单一的纸基材料特性难以满足多个微反应过程对最优检测条件要求不同的需求。
5.有鉴于此，本发明人根据葡萄糖氧化酶比色法检测葡萄糖的原理和特点，将双层复合材料构建的理念引入纸基设计，通过研究检测过程中酶试剂等参与物与纸基材料的相互作用机制，以及纸基材料对样品微流体的调控作用，进而利用制浆造纸原理分别反向设计出能够满足多样化检测需求的双层纸基结构，并将其应用于唾液葡萄糖检测芯片的搭建，从纸基设计与构建的角度，提高纸基检测芯片的性能，大大提升检测的灵敏度。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种纳米纤维素/木质纤维复合式纸基唾液葡萄糖检测芯片，从纸基结构出发，提高检测过程中纸基对酶及蛋白质的固定及稳定作用，纳米纤维素和木质纤维素协同作用，极大提升检测效果。
7.为实现上述发明目的，本发明技术方案如下：
8.一方面，本发明提供一种纳米纤维素/木质纤维复合式纸基唾液葡萄糖检测芯片，包括由纸基和酶组成的检测区，所述纸基包括纳米纤维素层和木质纤维层，其中，纳米纤维素层为顶层基材，木质纤维层为底层基材。
9.优选地，所述酶包括葡萄糖氧化酶(god)和辣根过氧化物酶(hrp)。
10.进一步优选的，所述葡萄糖氧化酶(god)和辣根过氧化物酶(hrp)在纸基表面负载量的比为1-10:1，最优选为2:1。
11.优选地，所述纳米纤维素为纤维素纳米纤丝和/或纤维素纳米晶体。本发明中的纳米纤维素可以是一种纤维素纳米纤丝、一种纤维素纳米晶体、多种纤维素纳米纤丝混合、多种纤维素纳米晶体混合、一种或多种纤维素纳米纤丝与一种或多种纤维素纳米晶体混合组成。
12.优选地，所述木质纤维为针叶木纤维和/或阔叶木纤维，针叶木纤维例如马尾松木、落叶松木、红松木、云杉木等，阔叶木纤维例如桦木、杨木、椴木、桉木、相思木等。本发明中的木质纤维可以是一种针叶木纤维、一种阔叶木纤维、多种针叶木纤维混合、多种阔叶木纤维混合、一种或多种针叶木纤维与一种或多种阔叶木纤维混合组成。
13.优选地，所述木质纤维为漂白针叶木纤维和/或漂白阔叶木纤维，进一步优选地，所述木质纤维的白度在70度以上。
14.优选地，所述纳米纤维素层的定量为5-30g/m2，所述木质纤维层的定量为10-150g/m2；进一步优选地，所述纳米纤维素层的定量为10-20g/m2，所述木质纤维层的定量为40-80g/m2；最优选的，所述纳米纤维素层的定量为15g/m2，所述木质纤维层的定量为60g/m2。
15.纳米纤维素对酶具有良好的固定和稳定作用，而木质纤维易于调节吸液能力，通过调整二者的位置和配比，可以最大限度的提高检测的灵敏度。
16.优选地，所述检测区还包括显色剂，所述显色剂选自3,3’,5,5,-四甲基联苯胺(tmb)、4-氨基安替比林(4aap)、碘化钾(ki)、碘化钠(nai)、n,n-二乙基-对苯二胺(depda)中的任一种。
17.优选地，所述纳米纤维素/木质纤维复合式纸基唾液葡萄糖检测芯片还包括加样区和非反应区，所述加样区和非反应区表面为超疏水表面。超疏水表面可以防止待检测唾液中的葡萄糖在非检测区渗入纸基流失而导致检测结果偏差。
18.所述超疏水表面可以选用光胶、石蜡、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、纳米二氧化硅、烷基烯酮二聚体(akd)、十八烷基三氯硅烷(ots)、链烯基琥珀酸酐(asa)和松香等疏水性材料通过涂布等方式在木质纤维层表面形成。
19.作为本发明的一个具体实施例，所述加样区包括底层的木质纤维层和表层的超疏水层，所述非反应区包括底层的木质纤维层和表层的超疏水层。
20.再一方面，本发明提供上述纳米纤维素/木质纤维复合式纸基唾液葡萄糖检测芯片的制备方法，包括以下步骤：
21.(1)分别制备纳米纤维素层和木质纤维层；
22.(2)在两个基层尚未完全干燥时，通过热压法将纳米纤维素层和木质纤维层复合。
23.术语“热压法”为：在加热同时加压的情况下，使两个基层相接触表面的纤维通过氢键结合，从而使两个基层复合在一起，可使用辊式热压机、板式热压机、平板硫化机等设备。
24.再一方面，本发明提供上述纳米纤维素/木质纤维复合式纸基唾液葡萄糖检测芯片在检测唾液葡萄糖含量中的应用。
25.再一方面，本发明提供一种高灵敏度的唾液中葡萄糖的检测方法，使用上述纳米纤维素/木质纤维复合式纸基唾液葡萄糖检测芯片，包括以下步骤：
26.(1)在加样区使待测唾液和伴刀豆球蛋白混合，形成唾液微液滴，静置1分钟，待其反应充分完成；
27.(2)唾液微液滴通过非反应区到达检测区，浸润检测区纸基，与酶反应完成检测。
28.优选地，待测唾液和伴刀豆球蛋白的体积比为1:2-1:0.5，最优选为1:1。
29.当检测完成时，检测区会呈现反应产物所具有的颜色信号。使用扫描仪将其扫描，再使用图片处理软件对其进行颜色密度分析，即可将颜色信号数据化。通过测试一系列含有已知浓度葡萄糖的唾液的反应区颜色密度，可得到颜色密度与唾液葡萄糖浓度的关系，随即可以测算出检测限。另外，也可进一步借助手持颜色密度仪或带有颜色密度分析应用的手机等移动设备实现该纸基检测芯片的便携式即时检测功能。
30.最后，本发明提供一种高灵敏度的唾液中葡萄糖的便携式即时检测设备，包括上述纳米纤维素/木质纤维复合式纸基唾液葡萄糖检测芯片、手持颜色密度仪或带有颜色密度分析应用的移动设备。
31.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
32.(1)将双层复合式结构应用于纸基检测芯片设计，根据多样化的检测需求特点分别设计和构建两个纸基基层，最大化发挥结合优势，提升检测效果，提高检测灵敏度。
33.(2)纳米纤维素在检测领域的应用极少，纳米纤维素具有生物兼容性高、可再生、轻质便携、可再生、无生物污染等作为纸基检测芯片基础材料必备的优良特性。因此，该项目提出将纳米纤维素对酶及蛋白质的固定及稳定作用应用于纸基检测芯片构建，并对其在唾液葡萄糖即时检测方面的作用机制开展全面而深入的研究，开发了纳米纤维素的潜在应用价值及拓展了纸基微流控检测芯片在生物医学检测方面的构建。
附图说明
34.图1为本发明实施例的检测过程示意图；
35.图2超疏水表面和水的接触角示意图，该图中接触角为156
°
。
具体实施方式
36.以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本技术要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本技术的发明作出多种改变和修饰，而其也应当属于本技术要求保护的范围之中。
37.下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。
38.下述实施例中，
39.纤维素纳米纤丝购自南京先丰纳米材料科技有限公司，货号为102201；
40.纤维素纳米晶体购自南京先丰纳米材料科技有限公司，货号为101907；
41.漂白桉木纤维购自芬欧汇川(upm)，货号为upm euca；
42.漂白松木纤维购自芬欧汇川(upm)，货号为upm conifer；
43.漂白相思木纤维购自亚太资源国际控股有限公司，货号为bakp；
44.漂白桦木纤维购自芬欧汇川(upm)，货号为upm betula；
45.葡萄糖氧化酶购自sigma-aldrich，货号为g7141-50ku；
46.辣根过氧化物酶购自sigma-aldrich，货号为p6782；
47.伴刀豆球蛋白购自sigma-aldrich，货号为l7647-250mg。
48.下述实施例中，
49.术语“负载”是指以下方式：将待负载物以溶液的形式均匀地涂抹于纸基表面，并自然风干。
50.术语“混合有伴刀豆球蛋白的唾液”是指唾液与伴刀豆球蛋白的混合物，其中唾液10μl，伴刀豆球蛋白10μl。
51.检出限的测量方法：
52.通过测试12份含有已知浓度葡萄糖的唾液的反应区颜色密度，根据以下公式计算出检测芯片的检出限。计算公式如下：
53.c
l
＝kisic/x
54.式中：c
l
为检出限；
55.ki为置信因子，取3；
56.si为样品颜色密度测量值的标准偏差；
57.c为样品唾液中的葡萄糖浓度值；
58.x为样品颜色密度测量值的平均值。
59.实施例1
60.纸基芯片制备：以纤维素纳米纤丝为原料，构筑10g/m2的顶层基层；以漂白桉木纤维为原料，构筑60g/m2的底层基层。通过热压将两个基层进行复合，在顶层基层表面负载10μl浓度为100u/ml的葡萄糖氧化酶，并以葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶的比例为2:1的比例，在顶层基层表面负载10μl浓度为50u/ml的辣根过氧化物酶。最后负载5μl浓度为15mm的3,3’,5,5,-四甲基联苯胺(tmb)，即可完成纸基芯片的制作。
61.检测时，取10μl待测唾液和10μl伴刀豆球蛋白放置于加样区使其充分混合，形成唾液微液滴，静置1分钟，待其反应充分完成；而后，使唾液微液滴通过非反应区到达检测区，浸润检测区纸基，与酶反应完成检测，在3分钟后，使用扫描仪将检测芯片反应区进行扫描，再使用图片处理软件对其进行颜色密度测试。通过测试12份含有已知浓度葡萄糖的唾液的反应区颜色密度，得到该检测芯片的检出限为22μmol/l。
62.实施例2
63.纸基芯片制备：以纤维素纳米纤丝为原料，构筑15g/m2的顶层基层；以漂白桉木纤维为原料，构筑45g/m2的底层基层。通过热压将两个基层进行复合，在顶层基层表面负载10μl浓度为100u/ml的葡萄糖氧化酶，并以葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶的比例为2:1的比例，在顶层基层表面负载10μl浓度为50u/ml的辣根过氧化物酶。最后负载5μl浓度为15mm的3,3’,5,5,-四甲基联苯胺(tmb)，即可完成纸基芯片的制作。
64.检测时，取10μl待测唾液和10μl伴刀豆球蛋白放置于加样区使其充分混合，形成唾液微液滴，静置1分钟，待其反应充分完成；而后，使唾液微液滴通过非反应区到达检测区，浸润检测区纸基，与酶反应完成检测，在3分钟后，使用扫描仪将检测芯片反应区进行扫描，再使用图片处理软件对其进行颜色密度测试。通过测试12份含有已知浓度葡萄糖的唾液的反应区颜色密度，得到该检测芯片的检出限为29μmol/l。
65.实施例3
66.纸基芯片制备：以纤维素纳米纤丝为原料，构筑10g/m2的顶层基层；以漂白桉木纤维为原料，构筑60g/m2的底层基层。通过热压将两个基层进行复合，在顶层基层表面负载10μl浓度为100u/ml的葡萄糖氧化酶，并以葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶的比例为5:1的比例，在顶层基层表面负载10μl浓度为20u/ml的辣根过氧化物酶。最后负载5μl浓度为15mm的3,3’,5,5,-四甲基联苯胺(tmb)，即可完成纸基芯片的制作。
67.检测时，取10μl待测唾液和10μl伴刀豆球蛋白放置于加样区使其充分混合，形成唾液微液滴，静置1分钟，待其反应充分完成；而后，使唾液微液滴通过非反应区到达检测区，浸润检测区纸基，与酶反应完成检测，在3分钟后，使用扫描仪将检测芯片反应区进行扫描，再使用图片处理软件对其进行颜色密度测试。通过测试12份含有已知浓度葡萄糖的唾液的反应区颜色密度，得到该检测芯片的检出限为39μmol/l。
68.实施例4
69.以纤维素纳米纤丝为原料，构筑12g/m2的顶层基层；以漂白松木纤维为原料，构筑40g/m2的底层基层。通过热压将两个基层进行复合，在顶层基层表面负载10μl浓度为100u/ml的葡萄糖氧化酶，并以葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶的比例为4:1的比例，在顶层基层表面负载10μl浓度为25u/ml的辣根过氧化物酶。最后负载5μl浓度为15mm的3,3’,5,5,-四甲基联苯胺(tmb)，即可完成纸基芯片的制作。
70.检测时，取10μl待测唾液和10μl伴刀豆球蛋白放置于加样区使其充分混合，形成唾液微液滴，静置1分钟，待其反应充分完成；而后，使唾液微液滴通过非反应区到达检测区，浸润检测区纸基，与酶反应完成检测，在3分钟后，使用扫描仪将检测芯片反应区进行扫描，再使用图片处理软件对其进行颜色密度测试。通过测试12份含有已知浓度葡萄糖的唾液的反应区颜色密度，得到该检测芯片的检出限为43μmol/l。
71.实施例5
72.以纤维素纳米晶体为原料，构筑15g/m2的顶层基层；以漂白相思木纤维为原料，构筑80g/m2的底层基层。通过热压将两个基层进行复合，在顶层基层表面负载10μl浓度为100u/ml的葡萄糖氧化酶，并以葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶的比例为4:1的比例，在顶层基层表面负载10μl浓度为25u/ml的辣根过氧化物酶。最后负载5μl浓度为15mm的3,3’,5,5,-四甲基联苯胺(tmb)，即可完成纸基芯片的制作。
73.检测时，取10μl待测唾液和10μl伴刀豆球蛋白放置于加样区使其充分混合，形成唾液微液滴，静置1分钟，待其反应充分完成；而后，使唾液微液滴通过非反应区到达检测区，浸润检测区纸基，与酶反应完成检测，在3分钟后，使用扫描仪将检测芯片反应区进行扫描，再使用图片处理软件对其进行颜色密度测试。通过测试12份含有已知浓度葡萄糖的唾液的反应区颜色密度，得到该检测芯片的检出限为58μmol/l。
74.实施例6
75.以纤维素纳米晶体为原料，构筑20g/m2的顶层基层；以漂白桦木纤维为原料，构筑50g/m2的底层基层。通过热压将两个基层进行复合，在顶层基层表面负载10μl浓度为100u/ml的葡萄糖氧化酶，并以葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶的比例为10:1的比例，在顶层基层表面负载10μl浓度为10u/ml的辣根过氧化物酶。最后负载5μl浓度为15mm的3,3’,5,5,-四甲基联苯胺(tmb)，即可完成纸基芯片的制作。
76.检测时，取10μl待测唾液和10μl伴刀豆球蛋白放置于加样区使其充分混合，形成唾液微液滴，静置1分钟，待其反应充分完成；而后，使唾液微液滴通过非反应区到达检测区，浸润检测区纸基，与酶反应完成检测，在3分钟后，使用扫描仪将检测芯片反应区进行扫描，再使用图片处理软件对其进行颜色密度测试。通过测试12份含有已知浓度葡萄糖的唾液的反应区颜色密度，得到该检测芯片的检出限为69μmol/l。
77.对比例1
78.纸基芯片制备：使用杭州特种纸业有限公司所生产的定量为83.35g/m2的滤纸(型号201)。
79.在纸基表面负载10μl浓度为100u/ml的葡萄糖氧化酶，并以葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶的比例为2:1的比例，在顶层基层表面负载10μl浓度为50u/ml的辣根过氧化物酶。最后负载5μl浓度为15mm的3,3’,5,5,-四甲基联苯胺(tmb)，即可完成纸基芯片的制作。
80.检测时，取10μl待测唾液和10μl伴刀豆球蛋白放置于加样区使其充分混合，形成唾液微液滴，静置1分钟，待其反应充分完成；而后，使唾液微液滴通过非反应区到达检测区，浸润检测区纸基，与酶反应完成检测，在3分钟后，使用扫描仪将检测芯片反应区进行扫描，再使用图片处理软件对其进行颜色密度测试。通过测试一系列含有已知浓度葡萄糖的唾液的反应区颜色密度，得到该检测芯片的检出限为562μmol/l。
81.对比例2
82.纸基芯片制备：以纤维素纳米纤丝为原料，构筑40g/m2的顶层基层；以漂白桉木纤维为原料，构筑20g/m2的底层基层。通过热压将两个基层进行复合，在顶层基层表面负载10μl浓度为100u/ml的葡萄糖氧化酶，并以葡萄糖氧化酶与辣根过氧化物酶的比例为2:1的比例，在顶层基层表面负载10μl浓度为50u/ml的辣根过氧化物酶。最后负载5μl浓度为15mm的3,3’,5,5,-四甲基联苯胺(tmb)，即可完成纸基芯片的制作。
83.检测时，取10μl待测唾液和10μl伴刀豆球蛋白放置于加样区使其充分混合，形成
唾液微液滴，静置1分钟，待其反应充分完成；而后，使唾液微液滴通过非反应区到达检测区，浸润检测区纸基，与酶反应完成检测，在3分钟后，使用扫描仪将检测芯片反应区进行扫描，再使用图片处理软件对其进行颜色密度测试。通过测试12份含有已知浓度葡萄糖的唾液的反应区颜色密度，得到该检测芯片的检出限为147μmol/l。
84.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。