用于递送阴离子材料的肽的制作方法

用于递送阴离子材料的肽
发明领域
1.本发明涉及用于递送诸如阴离子治疗剂的阴离子材料穿过生物屏障的肽及其使用方法。


背景技术：

2.用于递送阴离子货物的α螺旋两亲性肽的复杂设计和预测所述α螺旋两亲性肽的功能的困难引起对更简单的肽设计的探索。
3.富含精氨酸的肽(诸如寡精氨酸)(例如r
8-seq id no:7)的成功指示两亲性质对于细胞穿透不是必需的。例如，在penetratin的情形下，负责细胞穿透的是阳离子性质而不是螺旋结构[1]。因此，越来越多的注意力集中在开发富含阳离子氨基酸、特别是精氨酸的简单线性肽，所述简单线性肽能用作细胞穿透肽(cpp)或细胞递送剂。
[0004]
精氨酸优于其他碱性残基(例如赖氨酸和组氨酸)的优势已导出以下结论：精氨酸的胍部分对细胞进入至关重要[2]。当带正电荷的胍盐基团通过静电力连接到细胞膜表面上的带负电荷的基团(例如脂质头部基团或蛋白聚糖，诸如硫酸乙酰肝素)时，起始细胞进入，导致随后形成双齿氢键合[3]。在初始静电相互作用之后，认为cpp-货物分子作为cpp-货物-磷脂复合物进入脂质双层，带正电荷的胍鎓基团与细胞膜外小叶的磷脂酰胆碱(pc)和/或鞘磷脂(sm)的磷酸基团结合。然后在阳离子精氨酸残基和阴离子磷脂酰丝氨酸之间形成
‘
电容器’，产生足够强的电场以形成可逆孔，从而允许cpp-货物通过膜。提出，当肽-货物复合物穿过膜时，电场梯度发生变化，从而在几毫秒内关闭这个可逆孔[4]。
[0005]
富含精氨酸的肽对于dna结合和细胞穿透是优异的。然而，如果通过内体途径进入细胞，则内体逃逸的能力将是转染的主要限制步骤，并且必须加以考虑，这是因为恶劣的内体环境可导致肽和货物的降解。富含精氨酸的肽(诸如tat(seq id no:8)和r9(sed id no:9))已显示缺乏独立逃逸内体的能力，使得转染效率低下[5]。
[0006]
富含组氨酸的肽本质上通常是内体溶解的，并且根据组氨酸残基的数量或肽中残基的排列，能通过质子海绵或
‘
触发器’效应促进内体逃逸[6]。在wang等人进行的一项研究中，将10个组氨酸残基添加到tat(seq id no:11)在人神经胶质瘤细胞系u251中使转基因表达增加高达7000倍[7]。巴弗洛霉素a1(bafilomycin a1)(一种已知的内体逃逸的质子海绵效应抑制剂)的添加然后显著降低转染效率，支持组氨酸作为内体逃逸基序的活性可提高tat(seq id no:8)的转染效率的观点。在mann等人的一项研究中，组氨酸修饰的精氨酸肽所展示的转染效率是组氨酸-赖氨酸变体的2倍到3倍[8]。该研究强调了组氨酸对内体逃逸的重要性，并加强了精氨酸在转染方面优于其他阳离子氨基酸(诸如赖氨酸)的优势。
[0007]
结合dna和阳离子肽的强静电力可阻碍货物到达所需作用部位时的释放。为了避免这种情况，包括半胱氨酸残基，以通过细胞内环境中二硫键的还原更受控地释放细胞内货物[9]。据报道，细胞内谷胱甘肽(gsh)的浓度会影响半胱氨酸残基形成的二硫键的还原[10]。sharma等人观察到，当细胞用bso(丁硫氨酸硫酸亚胺)(一种谷氨酰-s-转移酶抑制剂)处理时，递送pdna(质粒dna)的含有半胱氨酸的肽mgpe-9和mgpe-10的转染效率会降低，
指示多聚体由二硫键稳定，并且细胞内gsh触发遗传货物的释放以成功转染[11]。同样地，bso抑制str-ch2r4h2c/pluc复合物中二硫化物交联的裂解，导致转染显著减少[12]。半胱氨酸残基的添加被认为提高了转染效率。lo等人生产了肽ch5tath5c(seq id no:10)，其显示与不含半胱氨酸残基的tat-10h(sed id no:11)肽相比高达1000倍的转基因表达水平。与pei 25kda(转染试剂)相比，ch5tath5c(seq id no:10)也显示转染效率无显著差异，同时也展示显著较小的毒性[7]。mann等人显示类似效应，这是因为当将半胱氨酸残基添加到含有精氨酸和组氨酸的肽中时，转染效率提高了几个数量级[8]。
[0008]
半胱氨酸残基也可对复合物的稳定性具有效应。肽/pdna的增强稳定性可通过并入末端半胱氨酸残基来实现，从而通过引入双二硫键使得能够进行共价但可逆的肽聚合[13]。这种效应在肽基序c-x-c中观察到，其中x是任何氨基酸，但对于含有精氨酸残基的肽，即c-r-c，这种效应最为显著[14]。bode等人引入的另一概念使用半胱氨酸残基缀合截短的肽，这可导致对cpp的摄取时刻的控制[15]。使用半胱氨酸残基通过二硫桥缀合的截短的精氨酸肽显示不同摄取机制，这取决于二硫桥的位置、肽中存在的精氨酸的量和疏水性。
[0009]
富含精氨酸的肽的疏水特性的增加已显示可提高摄取效率。例如，反离子芘丁酸盐通过增加亲水性富含精氨酸的肽的疏水性来增强寡精氨酸穿过脂质双层以及进入细胞的能力[16]。
[0010]
在本发明中，已设计肽以尝试产生细胞穿透肽，所述细胞穿透肽能将核酸结合并包装成纳米粒子以递送到细胞中，从而导致令人印象深刻的转染，同时限制生产成本。
[0011]
发明陈述
[0012]
根据本发明的第一一般方面，提供一种肽，所述肽包含以下或由以下组成：
[0013]
x-(xaa1)
a-(xaa2)
b-y-(xaa3)
c-(xaa4)
d-z，
[0014]
其中x和z各自独立地选自asn、cys、gln、gly、ser、thr和tyr；
[0015]
其中xaa1和xaa2中的一者是his，并且xaa1和xaa2中的另一者是arg；
[0016]
其中xaa3和xaa4中的一者是his，并且xaa3和xaa4中的另一者是arg；
[0017]
其中x的氨基官能团任选地被酰化；
[0018]
其中z的羧酸酯官能团任选地被酰胺化；
[0019]
其中y选自ala和trp；
[0020]
其中a和d各自独立地是2至4；并且b和c各自独立地是2至4，或它的盐或酰胺。
[0021]
任选地，xaa2和xaa3各自为arg。
[0022]
任选地，xaa1和xaa4各自为his。
[0023]
(his)a意指例如无任何插入非his氨基酸残基的一系列2至4个his氨基酸残基。
[0024]
任选地，a和d各自一致且为2至4。任选地，a和d各自为3。
[0025]
任选地，b和c各自一致且为2至4。任选地，b和c各自为3。
[0026]
任选地，a、b、c和d各自为3。
[0027]
任选地，x和z各自一致并且选自asn、cys、gln、gly、ser、thr和tyr。
[0028]
任选地，x和z各自为cys。
[0029]
任选地，y是trp。
[0030]
任选地，b加c的总和为至少六，使得肽包含最少六个精氨酸(arg)残基。
[0031]
任选地，a加d的总和为至少六，使得肽包含最少六个组氨酸(his)残基。
[0032]
任选地，肽包含6至8个净正电荷。进一步任选地，肽包含6个净正电荷。
[0033]
进一步任选地，肽是cys-(his)
3-(arg)
3-trp-(arg)
3-(his)
3-cys(chhhrrrwrrrhhhc)。
[0034]
任选地，肽包含8至20个氨基酸。这限制了肽序列长度，同时维持细胞穿透功能和阳离子性质。
[0035]
任选地，肽包含
[0036]
·
4至8个精氨酸残基(任选地6个精氨酸残基)；
[0037]
·
1个在核心处的色氨酸或丙氨酸残基(任选地色氨酸残基)以改善与细胞膜的疏水相互作用；
[0038]
·
在每一端1个选自asn、cys、gln、gly、ser、thr和tyr的氨基酸，以提高稳定性和进入细胞后的货物释放；
[0039]
·
0至8个在核心处的组氨酸残基(任选地4至8个组氨酸残基；进一步任选地6个组氨酸残基)，用于内体逃逸的ph值依赖性
‘
触发器’效应；和
[0040]
·
任选地，在每一端邻近选自asn、cys、gln、gly、ser、thr和tyr的氨基酸的一个选自asp和glu的氨基酸。
[0041]
适当地，本发明提供一种肽，所述肽包含以下或由以下组成：
[0042]
x-(xaa1)
a-(xaa2)
b-y-(xaa3)
c-(xaa4)
d-z，
[0043]
其中x和z是cys，
[0044]
xaa1和xaa4是his；a和d各自独立地是2至4；
[0045]
xaa2和xaa3是arg；b和c各自独立地是2至4；并且
[0046]
y是trp，或它的盐或酰胺。
[0047]
例如，肽可包含以下或由以下组成：
[0048]
x-(xaa1)
a-(xaa2)
b-y-(xaa3)
c-(xaa4)
d-z，
[0049]
其中x和z是cys，
[0050]
xaa1和xaa4是his；a和d各自独立地是2至4；
[0051]
xaa2和xaa3是arg；b和c各自独立地是3或4；并且
[0052]
y是trp，或它的盐或酰胺。
[0053]
适当地，肽包含以下或由以下组成：
[0054]
x-(xaa1)
a-(xaa2)
b-y-(xaa3)
c-(xaa4)
d-z，
[0055]
其中x和z是cys，
[0056]
xaa1和xaa4是his；a和d各自独立地是3或4；
[0057]
xaa2和xaa3是arg；b和c各自独立地是3或4；并且
[0058]
y是trp，或它的盐或酰胺。
[0059]
在一些方面，本发明的肽可包含衍生自脂肪酸的酰胺，例如，硬脂酰基可连接至本发明的肽。
[0060]
适当地，当y是trp时，吲哚环可为n-烷基化的。例如，色氨酸吲哚环可包含与吲哚环的氮连接的c1-c6烷基。
[0061]
根据本发明的第二方面，提供了本发明的第一方面的肽，其用作细胞递送剂，即用于将剂(诸如治疗剂)递送至细胞中。适当地，治疗剂可为核酸，例如dna、rnai、mrna、mirna、
sarna。
[0062]
根据本发明的第三方面，提供了本发明的第一方面的肽用于将阴离子货物递送至有需要的细胞或受试者的用途。
[0063]
根据本发明的第四方面，提供了用于在有需要的受试者中诱导免疫应答的本发明的第一方面的肽或用于在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本发明的第一方面的肽。
[0064]
根据本发明的第五方面，提供了用于有需要的受试者的基因疗法的本发明的第一方面的肽。
[0065]
根据本发明的第六方面，提供了用于治疗和/或预防有需要的受试者中的感染、癌症、创伤的本发明第一方面的肽或用于治疗和/或预防感染、癌症、创伤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用本发明的第一方面的肽。适当地，癌症选自：乳腺癌、前列腺癌、脑癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌或皮肤癌。例如，癌症可为乳腺癌或前列腺癌。
具体实施方式
[0066]
进行肽设计以试图产生能将阴离子货物(例如核酸)结合并包装成适合基因递送的纳米粒子的细胞穿透肽。肽是成对设计的，以允许基于特定氨基酸序列差异直接比较和分析功能。新型线性肽的序列示于表1中。
[0067]
表1：新型线性肽的序列
[0068]
肽名称序列肽7crrrwhhhhhwrrrc(seq id no:1)肽8cwrrrhhhhhrrrwc(seq id no:2)肽9chrhrhrwhrhrhrc(seq id no:3)肽10chhhrrrwrrrhhhc(seq id no:4)肽11crrrrwrrrrc(seq id no:5)肽12cehhrrrwrrrhhec(seq id no:6)
[0069]
这六种线性肽被设计为具有相似的序列，但略有不同，并成对分组以进行直接比较。关于肽相似性和差异的总结，参见表2。肽7至肽9、肽11和肽12不在本发明的范围内。
[0070]
表2：用以允许比较序列和设计原理的新型肽配对的总结。
[0071][0072]
protparam工具用于计算每个肽的可能的物理性质和化学性质，并且肽7和肽8的结果显示在表3中，肽9和肽10显示在表4中，并且肽11和肽12显示在表5中。当计算每一肽的n:p比时，则使用诸如分子量和带正电荷的残基的数量的参数。
[0073]
表3：肽7和肽8的计算性质
[0074][0075]
表4：肽9和肽10的计算性质
[0076]
[0077][0078]
表5：肽11和肽12的计算性质
[0079][0080]
肽7至肽9、肽11和肽12不在本发明的范围内。
[0081]
阴离子货物
[0082]
在一般情况下，阴离子货物可选自核酸或小分子剂，诸如膦酸盐药物或磷酸盐药物，诸如双膦酸盐、二磷酸盐、三磷酸盐药物。
[0083]
例如，阴离子货物可为有机磷酸盐，任选地具有0.15kda与2.5kda之间的分子量。
[0084]
根据一个实施方案，阴离子货物可为碱金属或碱土金属、二磷酸盐、二磷酸盐或三磷酸盐，优选碱土金属二磷酸盐、二磷酸盐或三磷酸盐。
[0085]
在一方面，双膦酸盐可为依替膦酸盐(etidronate)、氯膦酸盐(clodronate)、替鲁膦酸盐(tiludronate)、帕米膦酸盐(pamidronate)、奈立膦酸盐(neridronate)、奥帕膦酸盐(olpadronate)、阿仑膦酸盐(alendronate)、伊班膦酸盐(ibandronate)、利塞膦酸盐(risedronate)、唑来膦酸盐(zoledronate)或这些化合物的任何衍生物。
[0086]
在另一方面，二磷酸盐可基于核苷酸或核苷，诸如去羟肌苷(didanosine)、阿糖腺苷(vidarabine)、恩曲他滨(emtricitabine)、拉米夫定(lamivudine)、扎昔他滨
(zalcitabine)、阿巴卡韦(abacavir)、阿昔洛韦(acyclovir)、恩替卡韦(entecavir)、司他夫定(stavudine)、替比夫定(telbivudine)、齐多夫定(zidovudine)、碘苷(idoxuridine)、曲氟尿苷(trifluridine)、更昔洛韦(ganciclovir)、缬更昔洛韦(valganciclovir)、西洛韦(ciclovir)、阿西洛韦(aciclovir)、阿扎胞苷(azacitidine)、地西他滨(decitabine)、泽布拉林(zebularine)、阿糖胞苷(cytarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、曲沙他滨(troxacitibine)、cndac(2
′‑
c-氰基-2
′‑
去氧-1-β-d-阿拉伯糖基-戊呋喃糖基胞嘧啶)、氟达拉滨(fludarabine)、克拉屈滨(cladribine)、氯法拉滨(clofarabine)、喷司他汀(pentostatin)、氟罗德辛(forodesine)、叠氮基胸苷(azidothymidine)、依度尿苷(edoxudine)和/或这些化合物的任何衍生物。
[0087]
例如，二磷酸盐可选自以下中的一者或多者：异戊烯基焦磷酸盐(ipp)、(e)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸盐(hmbpp)、(e)-5-羟基-4-甲基戊-3-烯基焦磷酸盐(hdmapp)、二甲基烯丙基焦磷酸盐(dmapp)、乙基焦磷酸盐(epp)和相关代谢物，诸如ipp的三磷酸1-腺苷-5'-基酯3-(3-甲基丁-3-烯基)酯(apppi)。
[0088]
在另一方面，三磷酸盐可基于核苷酸或核苷，诸如去羟肌苷、阿糖腺苷、恩曲他滨、拉米夫定、扎昔他滨、阿巴卡韦、阿昔洛韦、恩替卡韦、司他夫定、替比夫定、齐多夫定、碘苷、曲氟尿苷、更昔洛韦、缬更昔洛韦、西洛韦、阿西洛韦、阿扎胞苷、地西他滨、泽布拉林、阿糖胞苷、吉西他滨、曲沙他滨、cndac(2
′‑
c-氰基-2
′‑
去氧-1-β-d-阿拉伯糖基-戊呋喃糖基胞嘧啶)、氟达拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨、喷司他汀、氟罗德辛、叠氮基胸苷、依度尿苷或这些化合物的任何衍生物。
[0089]
例如，三磷酸盐可基于二磷酸盐或焦磷酸盐，诸如异戊烯基焦磷酸盐(ipp)、(e)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸盐(hmbpp)、(e)-5-羟基-4-甲基戊-3-烯基焦磷酸盐(hdmapp)、二甲基烯丙基焦磷酸盐(dmapp)、乙基焦磷酸盐(epp)和相关代谢物，诸如ipp的三磷酸1-腺苷-5'-基酯3-(3-甲基丁-3-烯基)酯(apppi)。
[0090]
在另一方面，阴离子货物是选自dna、pdna、rna、mrna、sirna、shrna、sarna、mirna、质粒载体或核酸适体的核酸。
[0091]
用途
[0092]
应当理解，本发明的第一方面的肽可用作细胞递送剂。
[0093]
另外，本发明的第一方面的肽可用于在有需要的受试者中诱导免疫应答。
[0094]
另外，本发明的第一方面的肽可用于有需要的受试者的基因疗法。
[0095]
更进一步另外，本发明的第一方面的肽可用于治疗和/或预防有需要的受试者中的感染、癌症、创伤。
[0096]
最后，本发明的第一方面的肽可用于递送用于治疗和/或预防感染、癌症、因聚合医疗器件造成的创伤的疗法。
[0097]
图形图例
[0098]
图1：使用image j软件分析的a)肽7、b)肽8、c)肽9、d)肽10、e)肽11和f)肽12的使用1％琼脂糖凝胶(用溴乙锭染色用于荧光)的凝胶电泳测定的密度测定法。密度测定法用于确定在琼脂糖凝胶中检测到的相对于特征性pdna构象带(即超螺旋(无阴影)、开放圆形/缺口(浅阴影)或线性构象(深阴影))的相对荧光。image j软件用于分析荧光并计算为裸pdna对照(n:p 0)的百分比。结果展示为平均值
±
sem，n＝3。
lite软件(leica,uk)进行分析。使用正交切片法使cy3-pdna的核内存在可视化。该图像代表三个独立的重复。纳米粒子以白色绘示。
[0107]
图10：在a)du145和b)pc-3前列腺癌细胞、c)nctc-929成纤维细胞、d)hmec-1内皮细胞和e)hacat角质形成细胞中评估的包含pegfp-n1和肽10的纳米粒子的转染效率，以确定在额外细胞系中的转染。将细胞用一系列n:p比下的肽10/pegfp-n1纳米粒子转染4h。转染后，用补充有10％血清的培养基替换培养基，并孵育48h，之后使用i)光和ii)荧光显微镜成像。比例尺＝400μm。iii)随后在4％门控下通过流式细胞术分析转染效率的量化。结果展示为平均值
±
sem，n＝3。
[0108]
图11：用肽10转染后a)mcf-7和mda-mb-231乳腺癌细胞、b)du145和pc-3前列腺癌细胞和c)nctc-929成纤维细胞、hmec-1内皮细胞和hacat角质形成细胞的细胞活力。用一系列n:p比下的肽10转染细胞4h，之后用完全培养基替换。24h后，将细胞在黑暗条件下用mts试剂处理2h。然后使用bio-tek powerwave xs板读取器，利用gen5软件读取490nm处的吸光度，并从读数中减去任何背景吸光度。将未处理的细胞认为是100％有活力的，并且所有条件下的活力都是相对于此进行计算的。结果展示为平均值
±
sem，n＝3。
[0109]
图12：在arpe人类视网膜细胞中评估的包含pegfp-n1和肽10的纳米粒子的转染效率和细胞活力。(a)将细胞用一系列n:p比下的肽10/pegfp-n1纳米粒子转染4h。转染后，用补充有10％血清的培养基替换培养基，并孵育48h，之后使用i)光和ii)荧光显微镜成像。比例尺＝400μm。iii)随后在4％门控下通过流式细胞术分析转染效率的量化。(b)24h后，将细胞用mts试剂在黑暗条件下处理2h。然后使用bio-tek powerwave xs板读取器，利用gen5软件读取490nm处的吸光度，并从读数中减去任何背景吸光度。将未处理的细胞认为是100％有活力的，并且所有条件下的活力都是相对于此进行计算的。结果展示为平均值
±
sem，n＝3。
[0110]
图13：向携带mda-mb-231异种移植物的balb/c scid小鼠全身施用肽10/pluc复合物48h后的离体荧光素酶组织分布。以n:p8(根据表6，n:p 1为1.11；因此，n:p 8为8.88μg)利用50μg pluc(seq id no:12)制备肽10/pluc复合物。随后通过尾静脉注射向balb/cscid小鼠施用总体积为200μl的复合物。注射后48h处死小鼠，并收获器官。使用qrt-pcr分析脑、肺、肝、肾、脾和肿瘤中荧光素酶基因表达的量化。从器官中提取总mrna，进行逆转录，并使用qrt-pcr分析相对于管家蛋白(β-肌动蛋白)的荧光素酶表达。基因表达以相对于未处理对照的倍数差异表示，并且点表示平均值
±
sem，n＝3。
[0111]
图14：(a)nctc-929成纤维细胞、(b)hmec-1内皮细胞和(c)hacat角质形成细胞中mir-31倍表达变化的比较，以评估肽10/pmir-31的效应。将nctc-929成纤维细胞、hmec-1内皮细胞和hacat角质形成细胞在6孔板的opti-mem中用n:p比分别10、6和8的5μg pmir-31(登录号：mi0000089)转染，并在37℃下在5％co2中孵育。使用mirvana(invitrogen,uk)从细胞系中提取rna。对mir-31和管家蛋白u6进行逆转录，并使用qrt-pcr对mir-31相对于u6的表达进行量化。结果以倍数变化表示，并以平均值
±
sem报告，n＝3(*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001)。
[0112]
图15：进行(a)nctc-929成纤维细胞、(b)hmec-1内皮细胞和(c)hacat角质形成细胞中的创伤擦伤测定，以评估肽10/pmir-31对细胞迁移的效应。将nctc-929成纤维细胞、hmec-1内皮细胞和hacat角质形成细胞在6孔板中的opti-mem中用n:p比分别为10、6和8的
含有5μg pdna的肽10/pmir-31或肽10/pegfp-n1转染，并在37℃下在5％co2中孵育。将转染后24h、48h和72h的细胞转移至创伤擦伤测定插入物(ibidi,uk)，并在第二天进行损伤，以进行迁移监测。使用imagej软件分析图像，并通过比较指定时间点的每个创伤面积确定相对于未处理对照的迁移率。数据以平均
±
sem报告，n＝3(*，p值《0.05；**，p值《0.01)。
[0113]
图16：在24h、48h和72h时肽10/pmir-31对hmec-1内皮细胞中血管生成的效应。将细胞用n:p比为6的含有5μg pdna的肽10/pmir-31或肽10/pegfp-n1转染。在每个时间点，将细胞在无血清条件下以20,000/孔的密度在96孔板中重复接种到matrigel上，一式三份。使用wimtube软件包测量总小管长度和分支密度。数据以平均值
±
sem报告，n＝3。(*p《0.05)。
[0114]
图17：(a)电纺过程的示意图。在溶解于ddh2o之前，对pva聚合物进行称重，并且然后加载到注射器中。然后将注射器装入电纺设备(spraybase,ireland)中，并产生纳米纤维。电纺后，pva纤维与戊二醛交联，以赋予稳定性，并允许通过浸泡加载来加载肽10/pdna纳米粒子。(b)电纺后并入电纺的pva纳米纤维的肽10/pdna纳米粒子的凝胶阻滞测定。使用琼脂糖凝胶(1％w/v和0.25μg/ml etbr)制备凝胶，电泳显示pegfp-n1当从肽10/pegfp-n1 np解离(“释放的np sds”)时的迁移率。结果图像代表三次独立运行。
[0115]
图18：从交联pva纳米纤维释放的肽10/pegfp-n1纳米粒子的释放和转染概况。(a)从交联的pva电纺贴片的纳米粒子释放，时间长达48h，所述纳米粒子加载10μg与肽10复合的pegfp-n1。将贴片置于5ml超纯水(gibco,uk)中，并在不同时间点采集200μl样品。然后用蛋白酶-k酶处理样品以释放pdna，以便使用测定进行量化。(b)显示了用在不同时间点之间释放的肽10/pegfp-n1纳米粒子的nctc-929成纤维细胞的转染，确认释放后的功能性。结果展示为平均值
±
sem，n＝3。
[0116]
图19：处理对小鼠皮肤的表皮厚度的效应。在第7天对c57bl/6n小鼠实施安乐死后，收获创伤床并在病理检查前在10％福尔马林中固定24h。将组织切片包埋在石蜡中，并且然后切成厚度为3μm的切片，并置于nibiobank的玻璃显微镜载玻片上。处理样品以进行苏木精和曙红(h&e)染色。然后利用imagej分析软件(nih)对每个处理组的表皮厚度进行量化：a)未处理，b)未加载的纳米纤维，c)pmir-31纳米纤维，d)肽10/pegfp-n1纳米纤维，和e)肽10/pmir-31纳米纤维。f)中表皮厚度的量化。数据以平均值
±
sem报告，n＝5。(*p《0.05)。
[0117]
图20：处理对小鼠皮肤角质层(最外层)厚度的效应。在第7天对c57bl/6n小鼠实施安乐死后，收获创伤床并在病理检查前在10％福尔马林中固定24h。将组织切片包埋在石蜡中，并且然后切成厚度为3μm的切片，并置于nibiobank的玻璃显微镜载玻片上。处理样品以进行苏木精和曙红(h&e)染色。然后利用imagej分析软件(nih)对每个处理组的角质层厚度进行量化：a)未处理，b)未加载的纳米纤维，c)pmir-31纳米纤维，d)肽10/pegfp-n1纳米纤维，和e)肽10/pmir-31纳米纤维。在(f)中表示厚度。数据以平均值
±
sem报告，n＝5。(***p《0.001)。
[0118]
图21：肽10/pdna np的冻干。a)n:p10的冻干的肽10/pdna的大小分布。以10的n:p比制备肽10/pdna复合物，并在低温保护剂海藻糖(最终浓度为5％)存在下转移到玻璃冻干小瓶中，并在-40℃下冷冻1h。随后，使样品在-40℃和60毫托(mtorr)下进行24h的一次干燥，并在-30℃和120毫托下进行3h、在-30℃和190毫托下进行3h、在-25℃和190毫托下进行3h以及在20℃和190毫托下进行6h的二次干燥程序。随后重新悬浮冻干的肽10/pdna复合物，并使用malvern zetasizer nano zs仪器测量流体动力学大小和ζ电位。b)n:p为8、10和
10的新鲜制备和冻干的肽10/pdna的流体动力学大小的比较。结果展示为平均值
±
sem，n＝3。
[0119]
图22：在向携带4t1乳腺癌肿瘤的小鼠肿瘤内施用肽10/pluc复合物后24h的活体内荧光素酶组织分布。用20μg pluc以n:p 8制备肽10/pluc复合物，冻干并在100μl中重构。使用bruker invivo xtreme仪器捕获代表性生物发光图像。
[0120]
材料和方法
[0121]
肽的生成
[0122]
所有肽均是通过固态合成(fmoc chemistry)(biomatik,canada)产生，并以冻干粉末形式供应，所述冻干粉末在使用前需要重构。肽以乙酸盐形式供应，并且纯度》95％。
[0123]
质粒dna(pdna)
[0124]
pegfp-n1购自clontech(usa)(登录号：u55762.1)，pmir-31购自origene(usa)(登录号：mi0000089)，并且pcmv-red fire-fly luc(pluc)购自oxford genetics(uk)(seq id no:12)。使质粒在maxdh5α
tm
感受态细胞(life technologies,uk)中增殖，使用hipure质粒过滤器maxiprep试剂盒(life technologies,uk)纯化，并通过260nm处的uv吸收进行量化。
[0125]
细胞系
[0126]
将mcf-7和mda-mb-231乳腺癌细胞以及hacat角质形成细胞(atcc,manassas,va)在补充有10％胎牛血清(fcs)的杜贝克氏改良鹰氏培养基(dulbecco's modified eagle's medium，dmem)(invitrogen,uk)中维持为单层。将mcf-10a非致肿瘤性乳腺上皮细胞维持在补充有5％马血清(invitrogen,uk)、20ng/ml egf(thermofisher scientific,uk)、0.5mg/ml氢化可体松(sigma,uk)、100ng/ml霍乱毒素(sigma,uk)、10μg/ml胰岛素(sigma,uk)和pen/strep(invitrogen,uk)的不含酚红的dmem/f12(invitrogen,uk)中。将du145和pc-3前列腺癌细胞以及pnt2c2非致肿瘤性前列腺上皮细胞在补充有10％fcs的roswell park memorial institute培养基(rpmi)中维持为单层。将nctc-929成纤维细胞(atcc,manassas,va)在补充有10％胎马血清(fhs)的最低基本培养基(mem)(gibco,uk)中维持为单层。将hmec-1内皮细胞维持在mcdb-131培养基(thermofisher,uk)中并补充有5μl表皮生长因子(egf)(thermofisher,uk)、5μl 0.5mg/ml氢化可体松(sigma,uk)、5ml谷氨酰胺(thermofisher,uk)、5ml pen/strep(invitrogen,uk)和10％胎牛血清(fbs)。
[0127]
当细胞达到大约80％汇合时，使其传代，并且不用于超过20次传代的实验方案。将细胞维持在37℃与5％co2气氛下的孵育器中，并常规地进行支原体测试。所有活体外细胞实验均在5％co2孵育器中于37℃下进行。通过供应商进行的短串联重复序列(str)谱分析鉴定所有细胞系。
[0128]
动物
[0129]
balb/c scid和c57bl/6n小鼠购自charles river laboratories。将动物圈养在21℃和50％湿度的开放式设施中，随意进食和饮水。实验方案符合1986年英国科学法案(uk scientific act)，并且受卫生、社会服务和公共安全部门项目许可证号2794和个人许可证号1635的约束。
[0130]
肽的重构
[0131]
将冻干的肽(biomatik,canada)在分子级水中(invitrogen,uk)中重构，并在-20
n1、pluc和pmir-31用于确定肽/pdna相互作用。将200ml含有50μg/ml卡那霉素(用于pegfp-n1)、100μg/ml氨苄青霉素(用于pluc)或50μg/ml卡那霉素(用于pmir-31)的lb肉汤接种1ml经pegfp-n1或pluc转变的max efficiency dh5α感受态细胞(life technologies)的甘油贮备液，并在37℃下在轨道孵育器中孵育过夜。然后通过在4℃下以4000g离心15min收获细菌细胞。试剂盒中供应的缓冲液用于裂解细菌沉淀并沉淀出任何蛋白质。使用试剂盒中提供的阴离子交换树脂纯化pdna，用异丙醇(sigma-aldrich,uk)沉淀，风干，并重新悬浮在分子级水(invitrogen,uk)中。使用nanodrop 2000分光光度计(thermoscientific,usa)在260nm波长下通过uv分光光度法确定纯化的pdna的浓度，并通过a260/280测定确定纯度。
[0147]
肽/pegfp-n1、pluc或pmir31纳米粒子的配制
[0148]
质粒dna通过静电相互作用与每种肽按照一系列n:p比复合。根据n:p比，将一定量的肽添加到1μg的pdna水溶液中，并用分子级水将最终体积调整至50μl。然后将样品在室温下孵育30min。纳米粒子的配制准备用于表7中的线性肽。
[0149]
表7：肽7至肽12中每一种在n:p比为10下形成的纳米粒子的组分。
[0150][0151]
例如，在10的n:p比下，将11.4μg肽7添加到1μg pegfp-n1水溶液中，用水将最终体积调整至50μl，并在室温下孵育30min。
[0152]
凝胶电泳测定荧光的密度测定
–
图1
[0153]
保持初始(本文中为“原始(well)”)状态的dna是不带电的。对于肽7和肽12，这是在6至20的n:p比下实现。对于肽8、肽9、肽10和肽11，这是在4至20的n:p比下实现。
[0154]
pdna的复合-图2
[0155]
以1至20的一系列n:p比制备肽复合物和复合复合物以复合0.5μg pegfp-n1。将试剂(life technologies,uk)在tae缓冲液中以1:200稀释，并向每个50μl样品中添加50μl。使用synergy 2多模式板读取器，通过在480nm激发分析样品荧光，并在520nm测量荧光发射强度。将裸pdna对照(n:p比为0)的荧光强度视为100％荧光和0％复合，并且将从样品中检测到的任何荧光视为未复合。然后使用每个样品中未复合的pdna百分比计算复合的pdna百分比。
[0156]
图1和图2说明各种复合复合物的总电荷(图1)和包封％(图2)。对肽7、肽8和肽11中的每一个，在6至20的n:p比下，观察到总中性电荷和》70％包封。对于本发明的肽10，在4至20的n:p比下观察到总中性电荷和》70％包封。
[0157]
使用malvern zetasizer的纳米粒度测量
–
图3
[0158]
以1至20的一系列n:p比制备肽复合物(n:p比为0)和复合复合物以复合0.5μg pegfp-n1。例如，在肽7的10的n:p比下，纳米粒子包含0.5μg pegfp-n1和5.7μg肽7。用分子级水将纳米粒子补足至50μl，并在室温下孵育30min，之后使用带有dts软件的malvern zetasizer nano zs仪器(malvern instruments,uk)测量纳米粒子的平均流体动力学粒度。使用40μl的可弃式微量比色池，测量在20℃下通过动态光散射(dls)形成的纳米粒子的以数量计的平均大小。结果以平均值
±
sem报告，并且所有测量均一式三份进行。
[0159]
流体动力学大小《200nm是优选的。在6至20的n:p比下，所有肽7至肽12均具有《200nm的流体动力学大小。在6至20的n:p比下，本发明的肽10与《150nm的流体动力学大小相关。
[0160]
使用malvern zetasizer确定纳米粒子ζ电位
–
图3
[0161]
在大小测量后，随后用分子级水将50μl纳米粒子样品稀释至1000μl，并添加到折叠毛细管ζ池(malvern instruments,uk)中。在20℃下使用带有dts软件的malvern zetasizer nano zs仪器通过激光多普勒测速术测量ζ电位。结果以平均值
±
sem报告，并且一式三份测量。
[0162]
在10mv至35mv范围内的ζ电位是优选的。在8至20的n:p比下，肽7至肽12展现在10mv至35mv范围内的ζ电位。
[0163]
使用malvern zetasizer确定多分散性指数(pdi)和粒子计数(千计数/秒)-图4
[0164]
利用pegfp-n1和a)肽7、b)肽8、c)肽8、d)肽10、e)肽11或f)肽12以对应于图3中的大小和ζ电位分析的一系列n:p比制备的纳米粒子的多分散性指数(pdi)和粒子计数(千计数/秒)。用分子级水将纳米粒子补足至50μl，并在室温下孵育30min，之后使用malvern zetasizer nano zs仪器测量pdi和粒子计数。结果展示为平均值
±
sem，n＝3。
[0165]
0.15至0.4的多分散性指数是优选的。在4至20的n:p比下，肽7至肽10展现在0.15至0.40范围内的多分散性指数。在4至20的n:p比下，本发明的肽10展现在0.25至0.35范围内的多分散性指数。
[0166]
100至200的粒子计数是优选的。在4至20的n:p比下，肽7至肽10展现100至200的粒子计数。在4至20的n:p比下，本发明的肽10展现在100至150范围内的粒子计数。
[0167]
用递送pegfp-n1的肽的转染
–
图5、10、12
[0168]
为了评估肽和复合纳米粒子转染细胞的能力，在96孔组织培养板中进行转染。
[0169]
分别以2.25x104和2.5x104个细胞/孔的密度接种mcf-7和mda-mb-231乳腺癌细胞，并使其在37℃和5％co2下粘附过夜(图5)。
[0170]
分别以2.5x104和2x104个细胞/孔的密度接种pc-3和du145前列腺癌细胞，并使其在37℃和5％co2下粘附过夜(图10)。
[0171]
分别以1.75x104和2x104以及1.7x104个细胞/孔的密度接种nctc-929细胞、hmec-1细胞和hacat细胞，并使其在37℃和5％co2下粘附过夜(图10)。
[0172]
以20x103个细胞/孔的密度接种arpe细胞，并使其在37℃和5％co2下粘附过夜(图12)。
[0173]
转染前2h，用optimem(invitrogen,uk)替换培养基，并将细胞放回37℃和5％co2下的孵育器中。以50μl的总体积以一系列n:p比制备含有0.5μg pegfp-n1的纳米粒子，之后添加到适当孔中。
lite软件(leica,uk)进行分析。
[0190]
共焦显微镜图像说明了n:p 12下递送cy3标记的pdna的本发明的肽10向mda-mb-231乳腺癌细胞中的核递送。
[0191]
细胞活力
–
图11和图12b
[0192]
使用celltiter 96aqueous one solution cell proliferation assay(promega,uk)通过mts测定评估细胞活力。将mda-mb-231和pc-3细胞以1.5x 104个细胞/孔的密度接种，并且将mcf-7和du145细胞以1.2x 104个细胞/孔的密度接种，arpe、nctc-929、hmec-1和hacat细胞以1.0x 104接种，并使其在96孔板中粘附。转染细胞，转染后24h向每个孔中添加celltiter试剂，产生10％的最终体积，并返回孵育器保持2h。使用带有gen5软件的bio-tek powerwave xs板读取器读取490nm处的吸光度，并从读数中减去任何背景吸光度。细胞活力表示为未处理对照的百分比，其中未处理对照被视为100％有活力。
[0193]
图12b说明，随着n:p比增加，细胞活力降低。
[0194]
需要》60％的细胞活力。对于本发明的肽10，在6至15的n∶p比、诸如6至12的n∶p比下，获得》60％的细胞活力。
[0195]
温度稳定性-图8
[0196]
制备肽和复合复合物。使用带有dts软件的nano zs zetasizer(malvern instruments,uk)在不同温度下测量粒度。
[0197]
确定肽10/pegfp-n1纳米粒子的平均流体动力学大小，以评估在4℃至40℃的温度范围内的稳定性。肽10/pegfp-n1纳米粒子在评估的温度内是稳定的。在所测试的温度内，流体动力大小在75nm与200nm之间变化。
[0198]
在所测试的温度内，多分散性指数在0.3与0.55之间变化。在所测试的温度内，kcps在150与400之间变化。
[0199]
随时间的稳定性
–
图7
[0200]
制备肽和复合复合物。复合物在室温下储存在埃彭道夫管(eppendorf tube)中长达一个月。在指示时间点，测量粒度和ζ电位。
[0201]
确定肽10/pegfp-n1纳米粒子的平均流体动力学大小，以评估12h时间段和28天时间段内的稳定性。肽10/pegfp-n1纳米粒子在两个时间段内均稳定。流体动力学大小在12小时时间段和28天时段内在75nm与200nm之间变化。ζ电位在28天时段内在10mv与40mv之间变化。
[0202]
在向携带mda-mb-231异种移植物的小鼠全身施用肽10/pluc复合物后48h的离体荧光素酶组织分布-图13。
[0203]
用50μg pluc以n:p 8制备肽10/pluc复合物。随后通过尾静脉注射向balb/c scid小鼠施用总体积为200μl的复合物。注射后48h处死小鼠，并收获器官。使用qrt-pcr分析脑、肺、肝、肾、脾和肿瘤中荧光素酶基因表达的量化。从器官中提取总mrna，进行逆转录，并使用qrt-pcr分析相对于管家蛋白(β-肌动蛋白)的荧光素酶表达。基因表达以相对于未处理对照的倍数差异表示，并且点表示平均值
±
sem，n＝3。
[0204]
图13说明脑、肺、肝、肾、脾和肿瘤(mda-mb-231异种移植物)中增加的荧光素酶表达。
[0205]
pmir-31的即时pcr
–
图14
[0206]
根据制造商的方案，使用mirvana试剂盒(thermofisher scientific,uk)通过相分离提取rna。将纯化rna在100μl不含dna酶/rna酶的h2o(gibco,uk)中洗脱，并在-20℃下储存，直至需要。按照制造商的方案(taqman small rna测定，invitrogen,uk)，在聚丙烯试管中进行逆转录反应。使用0.15μl 100mm dntp、1μl multiscribe逆转录酶、1.5μl 10x逆转录缓冲液、0.19μl rna酶抑制剂、4.16μl不含核酸酶的h2o制备逆转录混合母液，以产生7μl/反应的最终总体积。然后将5μl rna样品(含10ng rna)和3μl 5xrt引物(mir-31或u6)添加到相关聚丙烯管中，以产生15μl的最终反应体积。将管离心5秒。使用tc-312温度循环器(techne,uk)进行逆转录。孵育循环是16℃持续30min、42℃持续30min、85℃持续5min，保持在4℃。使用透明的96孔板(roche,uk)进行qrt-pcr。根据制造商的方案(taqman small rna测定,invitrogen,uk)，为每组探针(mir-31和u6)准备反应。简单来说，准备0.5μl taqman small rna测定(20x)；5μl taqman universal pcr mastermix mix ii(2x)，无ung：3.84μl不含核酸酶的h2o；0.67μl cdna(来自rt反应)，以产生10μl/孔的总反应体积。使用lightcycler 480ii(roche,uk)使用以下循环参数进行qrt-pcr：95℃持续10min，然后95℃持续15s和60℃持续60s的40个循环。使用δδc
t
方法，使用所生成的ct值量化mir-31相对于u6的表达。结果以相对于对照的倍数变化报告。图14比较了mir-31在nctc-929成纤维细胞、hmec-1内皮细胞和hacat角质形成细胞中的表达倍数变化，以评估肽10/pmir-31的效应。在每种细胞系中，肽10/pmir-31在转染后至少48小时增加pmir-31的表达。
[0207]
创伤擦伤测定
–
图15
[0208]
将创伤擦伤培养插入物(ibidi,uk)直接与70x104个nctc-929细胞、hmec-1细胞或hacat细胞一起移液到24孔板中。接种后12h，用无菌镊子轻轻取出培养插入物，并用pbs洗涤细胞层。然后将1ml细胞培养基(2％fcs)置于24孔板的每个孔中。使用evos fl细胞成像系统(life technologies)在不同时间点对细胞成像，直至未处理对照关闭50％。剩余创伤面积表示为针对未处理对照归一化的倍数变化。该测定已被许多团体使用以测定治疗后的细胞功能性。以下是显示这一点的参考样品清单：
[0209]
grada,a.,otero-vinas,m.,prieto-castrillo,f.,obagi,z.,&falanga,v.(2017).research techniques made simple:analysis of collective cell migration using the wound healing assay.journal of investigative dermatology,137(2),e11
–
e16.https://doi.org/10.1016/j.jid.2016.11.020
[0210]
heikal,l.,ghezzi,p.,mengozzi,m.,&ferns,g.(2018).assessment of hif-1$α$expression and release following endothelial injury in-vitro and in-vivo.molecular medicine,24(1),22.https://doi.org/10.1186/s10020-018-0026-5
[0211]
liang,c.-c.,park,a.y.,&guan,j.-l.(2007).in vitro scratch assay:a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.nature protocols,2(2),329
–
333.https://doi.org/10.1038/nprot.2007.30
[0212]
图15评估了肽10/pmir-31对细胞迁移的效应。在每个细胞系中，在转染后至少48小时，与肽10/pegfp-n1相比，肽10/pmir-31减少剩余创伤面积。
[0213]
小管形成测定-图16
[0214]
将matrigel(70μl)(corning,uk)移液到96孔板中，并在37℃下孵育1h。使hmec-1细胞在单层中生长并胰蛋白酶化，之后悬浮于无血清培养基中。计数细胞，并将2.5x104个
细胞移液到matrigel上。将细胞静置过夜14h的时段，使形成小管。使用evos fl细胞成像系统(life technologies)对小管成像，然后使用wimtube软件(wimasis image analysis,munich,germany)计算总管长度和总分支点。结果以针对未处理对照归一化的倍数变化表示。肽10/pmir-31或肽10/pegfp-n1
[0215]
图16评估了肽10/pmir-31对小管形成的效应。在转染后至少48小时，与肽10/pegfp-n1相比，肽10/pmir-31增加小管形成。
[0216]
pva纳米纤维的产生-图17
[0217]
通过电纺工艺(spraybase,ireland)制造mw 146-180kda的聚(乙烯醇)(pva)的纳米纤维(sigma,uk)。产生参数包括8kv的施加电压、8cm的工作距离、4μl/min的聚合物流速和9％w/v的聚合物浓度。在2h时段内产生纳米纤维，然后使其与1％戊二醛(sigma,uk)/甲醇(sigma,uk)溶液交联4h。交联后，用甲醇洗涤纳米纤维3次，之后用超纯水(gibco,uk)洗涤3次。然后将纳米纤维风干24h。然后将纳米纤维在紫外线下灭菌1h。
[0218]
将肽10/mir31 np加载到纳米纤维中-图17
[0219]
如先前所述，以8的n:p比合成含有10μg的肽10/pmir-31的纳米粒子。一旦合成，将纳米粒子溶液直接移液到灭菌交联pva纳米纤维的1cm x 1cm切片上，并在其中浸泡和干燥24h时段。
[0220]
图17b的凝胶显示pegfp-n1当从肽10/pegfp-n1 np解离(“释放的np sds”)时的迁移率。与dna相似的完整条带显示，对从pva纳米纤维中释放的dna没有损害。
[0221]
肽10/mir31 np从纳米纤维的释放
–
图18
[0222]
将n:p比为8的并入10μg dna np的电纺纳米纤维置于5ml超纯水(gibco,uk)中，并在不同时间点采集样品，直至48h。然后将样品与蛋白酶-k(thermoscientific,uk)一起在37℃下孵育90min，得到解离的纳米粒子。使用quanti-it
tm
测定(life technologies,uk)来确定dna释放。
[0223]
图18a说明从交联的pva电纺贴片的纳米粒子释放，时间长达48h，所述纳米粒子加载10μg与肽10复合的pegfp-n1。图18b显示了用在不同时间点之间释放的肽10/pegfp-n1纳米粒子的nctc-929成纤维细胞的转染，确认释放后的功能性。在施用电纺纳米纤维后1h至2h，转染效率最佳。
[0224]
用肽10/mir31纳米纤维的活体内研究
–
图19和图20
[0225]
使用异氟醚对c57bl/6n小鼠进行麻醉，之后从背部去除毛发，最初用剪发器刮毛，然后用毛发去除膏彻底去除毛发。通过用70％酒精消毒准备手术部位。使用食指和拇指折叠和抬高背部皮肤，以产生皮肤皱褶。将小鼠置于侧卧位，并且使用5-mm直径的无菌可弃式生检穿孔器(stiefel,uk)完全去除两个皮肤层。这产生对称的全厚度创伤。将手术当天视为实验的第0天。手术后，用pva纳米纤维和对照敷料处理创伤，pva纳米纤维加载有含有20μg n:p比为8的pdna的纳米粒子。将次要敷料置于创伤上，所述次要敷料由商用透明膜tegaderm
tm
组成。手术后，将动物移至温暖区域，并监测从麻醉的恢复情况。一旦完全恢复，将动物移至常规笼舍并个别地关笼。手术后7天，对小鼠实施安乐死并收获创伤床。
[0226]
免疫组织化学
[0227]
对小鼠实施安乐死后，收获创伤床并在病理检查前在10％福尔马林中固定24h。将组织切片包埋在石蜡中，并且然后切成厚度为3μm的切片，并置于nibiobank的玻璃显微镜
载玻片上。处理样品以进行苏木精和曙红(h&e)染色。然后根据表皮厚度、血管大小和密度以及角质层厚度分析样品。
[0228]
肽10/pdna np的冻干
–
图21
[0229]
以10的n:p比制备肽10/pdna复合物，并在低温保护剂海藻糖(最终浓度为5％)存在下转移到玻璃冻干小瓶中，并在-40℃下冷冻1h。随后，使样品在-40℃和60毫托下进行24h的一次干燥，并在-30℃和120毫托下进行3h、在-30℃和190毫托下进行3h、在-25℃和190毫托下进行3h以及在20℃和190毫托下进行6h的二次干燥程序。随后重新悬浮冻干的肽10/pdna复合物，并使用malvern zetasizer nano zs仪器测量流体动力学大小和ζ电位。
[0230]
图21a显示了冻干的肽10/pdna纳米粒子的典型迹线。图21b比较了新鲜和冻干的肽10/pdna纳米粒子的流体动力学大小，在各n:p比之间无显著差异。
[0231]
肽10/pdna纳米粒子至皮下4t-1肿瘤的肿瘤内局部递送。
[0232]
将肽10/pdna直接递送至携带4t1乳腺癌异种移植物的小鼠的皮下肿瘤。以n:p 8用20μg pluc制备肽10/pluc复合物，冻干并在100μl ddh2o中重构。使用bruker invivo xtreme仪器捕获代表性生物发光图像。
[0233]
图22显示了肽10可用于将pdna局部递送至可及肿瘤中。
[0234]
结论
[0235]
设计了几种变体线性肽，所述变体线性肽保持序列长度和组成相似，但改变了组氨酸、精氨酸和色氨酸/丙氨酸残基的位置。以更好地了解肽序列对功能性的影响为总体目标，分析了肽序列变化对复合物形成、细胞摄取、内体逃逸和总转染效率的影响。
[0236]
每种线性肽均中和了pdna，并且随着n:p比增加，pdna通过琼脂糖凝胶的迁移受到阻碍。本发明的比较肽7、比较肽8、比较肽9和肽10的理论净电荷相似，并且存在最小的中和和复合变化。比较肽12的概况略有不同，两个阴离子谷氨酸残基降低了肽的净电荷。这在凝胶阻滞和复合测定中很明显，其中在6的较高n:p比下发生pdna中和，最大复合效率为70％。在所有情形下，在每个末端存在半胱氨酸残基(或其他不带电荷的极性亲水氨基酸)可能增强pdna缩合。
[0237]
每种线性肽均产生大小《150nm的纳米粒子，ζ电位约为30mv。在较高比率下，增加量的肽会减少构象的数量，直至pdna完全缩合，这与动力学和/或热力学稳定的复合物的形成一致。这个过程在比较肽11中很明显，其中大粒子在较低n:p比下形成，但粒度随着n:p比和阳离子度的增加而减小。然而，所研究的其他五种肽在n:p比为1时立即产生大小合适的纳米粒子，这指示由于包含了几个精氨酸和组氨酸残基而具有强阳离子性质。由每种肽与pdna形成的大小合适的阳离子粒子的产生指示了核酸的细胞递送的潜力。
[0238]
本发明的比较肽7、比较肽8、比较肽9和肽10的粒度分布分析显示pdi在0.2与0.4之间，指示粒度分布接近均质性。肽序列中半胱氨酸残基的存在可通过二硫键的形成增加粒子的稳定性。这些键具有在相邻肽链之间或链本身内形成的潜力，并可用于加强形成复合物的键。
[0239]
转染研究显示，除了(本发明的)肽10之外，所有线性肽在mcf-7和mda-mb-231细胞中的效率都较低。此处主要考虑肽序列，并且转染效率的差异突出了序列对细胞穿透肽(cpp)功能性的效应。比较肽7和比较肽8被设计为在肽链的边缘具有精氨酸残基，在中心处侧接色氨酸残基和组氨酸残基。相反，本发明的比较肽9和肽10被设计成在中心处具有一个
色氨酸/丙氨酸残基。肽9具有沿序列交错排列的组氨酸和精氨酸残基，但肽10在中心色氨酸/丙氨酸的每一侧具有一系列精氨酸残基，序列边缘有一系列组氨酸残基。从转染数据清楚地看出，肽10(在每个末端具有一系列组氨酸残基，侧接中心色氨酸/丙氨酸，在每个末端具有一系列精氨酸残基)最适合转染，并且这是一个意外的结果。
[0240]
肽10中侧接一系列精氨酸残基的中心色氨酸/丙氨酸可增强转染能力。中心色氨酸/丙氨酸可能锚定到细胞膜中，与侧接的一系列精氨酸残基协同作用，以促进肽通过膜双层。与仅由半胱氨酸、组氨酸和精氨酸组成的其他相似线性肽相比，肽中包含疏水性色氨酸残基可对功能性具有显著影响。据报道，疏水部分的相互作用会增强pdna的压缩，从而导致自组装粒子形成。在本发明的肽(诸如肽10)的情形下，优选的中心色氨酸残基(由于芳族侧链而为强疏水性氨基酸)可提供增强的复合物形成和与细胞膜的相互作用所需的疏水性。
[0241]
将一系列组氨酸残基并入每个序列中，以促进内体逃逸并研究序列位置是否影响功能性。在mda-mb-231细胞中对于所有肽都添加氯喹后，观察到转染显著增加。然而，在mcf-7中使用肽10未观察到转染差异，指示该肽序列必须具有至少部分内体逃逸能力。从这个结果看来，肽序列中的组氨酸位置对内体逃逸功能性具有效应。组氨酸位于中心处并在整个序列中交错，与比较肽7、比较肽8和比较肽9一样，使得组氨酸的逃逸能力无用。无论是否使用氯喹，比较肽11和比较肽12的转染都非常低，这指示另一个限速步骤正在阻碍转染；最可能的是细胞摄取没有发生。对于不含组氨酸残基的比较肽11，预期不会发生内体逃逸。用谷氨酸替换两个组氨酸残基并未增强比较肽12中的内体逃逸。认为谷氨酸负责各种肽中的融合活性，但包含在比较肽12中仅导致肽的整体阳离子度降低和组氨酸的质子海绵电位降低。在本发明的肽10的情形下，观察到一些内体逃逸活性，指示位于每个末端的组氨酸是功能性的。
[0242]
迄今为止，本发明的肽10在初始研究中显示出最大的希望；将pdna缩合并包装成适于细胞内递送的纳米粒子。用本发明的肽10在两种乳腺癌细胞系中产生的转染效率令人印象深刻，并且对内体逃逸能力的研究令人鼓舞。结合这个证据，决定将本发明的肽10用于进一步表征。
[0243]
共焦显微镜术证实，本发明的肽10将cy3标记的pdna在细胞内递送至mda-mb-231，并利用正交切片法检测核内dna。必须注意，即使在转染后4h，胞质液中仍可见大比例的cy3-pdna。鉴于氯喹研究中mda-mb-231细胞中仅有部分内体逃逸的证据，该cy3-pdna很可能被截留在内体中；阻止进展到核。同样，用增加的组氨酸残基修饰肽10可有助于克服这个问题。mcf-7细胞的情况并非如此，并且突出了所测试的细胞系之间的差异。因此，mda-mb-231细胞中的主要胞吞过程高度参与本发明的肽10的细胞摄取模式。另外，关于内体逃逸，转移性mda-mb-231细胞中稳健的胞吞途径很可能产生更高质量的内体，这些内体比在mcf-7细胞中更难逃逸。然而，在另外两种细胞系、即du145和pc-3前列腺癌细胞中观察到本发明的肽10令人印象深刻的转染效率，指示本发明的肽10是多用途的并且具有递送至一系列细胞系的潜力。
[0244]
在乳腺癌和前列腺癌细胞系中的细胞活力研究揭示，即使在20的高n:p比下，本发明的肽10也引起弱毒性(如果有的话)。这突出了本发明的肽10的无害性质。用本发明的肽10观察到的无毒性是重要的，这是因为基因治疗剂具有规避常规癌症治疗的有问题的副作用的潜力，然而，如果递送载体随后引起毒性，这将是徒劳的。
disulfides as opportunity for improving stability and transfection efficiency of oligoaminoethane polyplexes.j control release.2014；(10.1016/j.jconrel.2014.12.035).
[0265]
15.bode s a，wallbrecher r，brock r，van hest jcm，dwpm.activation of cell-penetrating peptides by disulfide bridge formation of truncated precursors.chem commun(camb).2014；50(4)：415-7.
[0266]
16.guterstam p，madani f，hirose h，takeuchi t，futaki s，ei andaloussi s，et al.elucidating cell-penetrating peptide mechanisms of action for membrane interaction，cellular uptake，and translocation utilizing the hydrophobic counter-anion pyrenebutyrate.biochim biophys acta.2009；1788(12)：2509-17.