一种透明质酸结合蛋白聚体及其在检测透明质酸中的应用的制作方法

1.本发明涉及生化检测领域，具体涉及一种透明质酸结合蛋白聚体及其在检测透明质酸中的应用。


背景技术：

2.透明质酸(ha)是一种结构简单但功能复杂的大分子糖胺聚糖，通常由2000～2500个葡萄糖醛酸-(β1-3)-n-乙酰葡糖胺二糖单位通过β1-4糖苷键形成分子量约为106～107的多聚物。透明质酸在生物界分布广泛，在人体中，透明质酸主要存在于皮肤、心脏、关节滑液和骨骼等部位，具有空间填充、润滑等多种功能。在恶性肿瘤中，透明质酸参与肿瘤细胞的增殖、黏附、迁移及诱导肿瘤的多药耐药性等，在肿瘤发展和转移中起到重要作用。
3.ha是多种疾病重要的诊断指标。ha可反映肝脏内皮细胞功能及受损程度。肝硬化时ha增高水平与肝组织病理改变程度有密切关系。ha水平达250μg/l，可判定为肝硬化；ha水平达165μg/l，可作为慢性活动性肝炎和慢性迁延性肝炎的分界；急性肝炎血清ha水平可有轻度升高。肝癌，ha明显增高。慢性肾炎及慢性肾功能不全血清ha水平明显升高，并与肌酐、尿素氮呈正相关。肺间皮细胞癌血清ha水平明显升高。作为膀胱肿瘤的标记物之一，通过检测尿液中ha的含量来辅助诊断膀胱肿瘤。ha还可应用于诊断银屑病。另外，近年来的研究证实透明质酸在肿瘤部位有过表达现象，因此透明质酸还可作为的恶性肿瘤的标记物，用于肿瘤的诊断。
4.目前市场上已有多种ha检测诊断试剂，其用于检测ha的活性成分为透明质酸结合蛋白(habp)。habp常规为牛鼻软骨提取versican蛋白或者大肠杆菌表达的versican蛋白片段。2005年，seyfried第一次报道使用drosophila expression system重组表达人versican g1 domain(1-350aa of np_001157569.1)，并实验确认其具有透明质酸结合功能(seyfried,mcvey et al.2005)。2011年，clark在escherichia coli bl21(de3)plyss cells系统中表达了与seyfried相同碱基序列的vg1蛋白，但其为包涵体形式，且对ha检测的灵敏度较低。
5.cn104093415b公开了另一种重组ha结合蛋白，然而这种功能序列来自tsg-6。现有临床诊断中常用habp常规为牛鼻软骨提取versican蛋白或者大肠杆菌表达的versican蛋白片段vg1。现有vg1蛋白的单体亲和力低，缺乏一种高亲和力的vg1蛋白。


技术实现要素：

6.鉴于现有技术存在上述缺陷，本发明的目的在于提供一种新的透明质酸检测蛋白及其用途。本发明人在进行重组透明质酸酶结合蛋白开发时意外地发现，采用vg1和fc表达形成融合蛋白(vg1-fc)的情况下，比tsg-6-连接模块(lm)具有更高的亲和力、更好的特异性。另一方面，由于vg1-fc的亲和力高、特异性好，无需biotin标记即可达到市售试剂盒以及现有技术tsg-6-连接模块的灵敏度。基于vg1-fc蛋白开发的试剂盒，可有效检测如血液、组织中的ha，为ha相关的研究提供新的选择。
7.针对现有技术的缺陷，本发明的技术方案之一为：一种结合透明质酸的二聚体蛋白，所述二聚体蛋白包括2个单体，其中每个单体包括第一蛋白功能区和第二蛋白功能区，所述第一蛋白功能区包含如seq id no:1所示的序列，或与其具有85％、90％、95％、98％或99％以上的同一性的序列；所述第一蛋白功能区通过所述第二蛋白功能区形成二聚体形式。
8.所述二个单体可以相同也可以不同，其中二个第一蛋白功能区可以相同也可以不同，而二个第二蛋白功能区可以相同也可以不同；在不同时，二个蛋白功能区的氨基酸序列具有85％、90％、95％、98％或99％以上的同一性。
9.较佳地，所述第二蛋白功能区包含如seq id no:2所示的序列。优选地，所述第二蛋白功能区还包含如seq id no:8所示的序列。
10.较佳地，所述单体包含如seq id no:3所示的序列。优选地，所述单体包含如seq id no:4所示的序列。
11.为解决上述技术问题，本发明的技术方案之二为：一种编码含上述任一项所述结合透明质酸的二聚体蛋白的单体的核酸分子。优选地，所述核酸分子包含如seq id no:5和seq id no:6所示的序列。
12.为解决上述技术问题，本发明的技术方案之三为：一种表达载体，其包含如上所述的核酸分子。
13.为解决上述技术问题，本发明的技术方案之四为：一种原核或真核宿主细胞，其包含如上所述的表达载体。优选地，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
14.为解决上述技术问题，本发明的技术方案之五为：如上任一项所述二聚体蛋白、如上所述核酸分子、如上所述表达载体或如上所述宿主细胞在制备疾病的体内诊断和治疗药物制剂和/或药物组合物中的应用。
15.为解决上述技术问题，本发明的技术方案之六为：一种包括如上所述的透明质酸结合蛋白的检测试剂盒。
16.较佳地，所述检测试剂盒包含透明质酸降解酶。优选地，所述透明质酸降解酶为透明质酸酶。更优选地，所述透明质酸酶为hyal1、hyal2、hyal3、哺乳动物睾丸透明质酸酶、透明质酸酶融合蛋白、所述透明质酸酶的变体和/或所述透明质酸酶的变体的修饰物。进一步优选地，所述透明质酸酶为人类睾丸透明质酸酶，所述人类睾丸透明质酸酶为序列如seq id no:9所示的ph20。
17.所述试剂盒应用于组织或者流体样品中透明质酸的检测，所述组织来源于人、鼠等物种。所述组织优选为人的基质组织。所述人的基质组织更优选为来自肿瘤的基质组织样品。所述流体包括血液、血清、尿液、汗液、精液、唾液、脑脊液或淋巴。
18.为解决上述技术问题，本发明的技术方案之七为：一种透明质酸检测方法，一种透明质酸检测方法，其包括以下步骤：
19.(1)取含透明质酸的样品；所述样品为基质组织样品或流体样品，所述基质组织优选来自肿瘤的基质组织样品，所述流体样品包括血液、血清、尿液、汗液、精液、唾液、脑脊液和/或淋巴样品；
20.(2)使用如上所述的检测试剂盒检测所述样品。所述透明质酸检测方法优选还包括用显色液进行显色的步骤。所述显色液优选dab。
21.较佳地，所述透明质酸检测方法还包括步骤(3)根据检测结果，对样品中的透明质酸含量进行定量或半定量分析。
22.在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
23.本发明所用试剂和原料均市售可得。
24.本发明的积极进步效果在于：
25.本发明提供一种新型的透明质酸结合蛋白，并提供了其在检测和定量生物学样品中透明质酸的应用，包含该蛋白的试剂盒可用于诊断和预估患者的病情发展、治疗效果及预后。
26.本发明得到的透明质酸结合蛋白片段，可便捷地去除fc片段，作为体外诊断试剂，其不沉淀抗原，可减少假阳性率。所得透明质酸结合蛋白片段对透明质酸的亲和力高，透明质酸结合蛋白的二聚体对透明质酸亲和力远高于现有技术，具有更高的检测灵敏度。所述透明质酸结合蛋白片段作为体内诊断试剂，标记放射性核素以后，在正常组织中半衰期比全长抗体短，可快速降解，有利于减少由于fc效应功能导致的身体正常组织的伤害。
附图说明
27.图1为kj-v01表达载体的示意图。
28.图2为ha包被时，各结合蛋白梯度稀释加样，对应酶联抗体检测数据绘制的od450曲线图。
29.图3为ha包被时，各结合蛋白梯度稀释加样，对应酶联抗体检测数据绘制的od450曲线图。
30.图4为ha包被时，各结合蛋白梯度稀释加样，对应酶联抗体检测数据绘制的od450曲线图。
31.图5为vg1-fc而具体蛋白应用于皮肤组织免疫组化的实验结果图。
具体实施方式
32.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
33.实施例1.vg1-fc蛋白的表达
34.委托基因合成公司，针对提供的氨基酸序列进行密码子优化并全基因合成编码vg1-fc(seq id no:5、seq id no:6)、vg1-his、tsg-6-fc的dna片段，克隆至本发明人构建的kj-v01表达载体(图1)，所述表达载体由下述原件构成：
35.1)谷氨酰胺合成酶基因，作为筛选标记，
36.2)复制起点，ori，
37.3)来自载体puc18的复制起点，其容许此质粒在大肠杆菌中复制，
38.4)β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性，
39.5)来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
40.6)人1-免疫球蛋白聚腺苷酸化(“poly a”)信号序列。
41.如上所述，全基因合成vg1-fc(seq id no:4)、vg1-his(seq id no:7)、tsg-6-fc序列(见cn104093415b，seq id no:215)，并使用ecori和hindiii酶切后克隆入相同酶切的kj-v01载体中，最终构建vg1-fc/kj-v01、vg1-his/kj-v01、tsg-6-fc/kj-v01。
42.将上述构建好的vg1-fc/kj-v01、vg1-his/kj-v01、tsg-6-fc/kj-v01表达载体转化大肠杆菌top10，挑取阳性克隆接种于100ml lb培养基中扩增。利用qiagen公司质粒纯化试剂盒(plasmid plus midi kit cat:12943)制备转染级dna。得到的质粒采用scai单酶切线性化，后采用酚氯仿抽提、乙醇沉淀的方法对酶切后质粒进行纯化(方法来自《分子克隆实验指南第三版》)。采用gibco公司的脂质体法试剂盒将质粒dna转染入cho-k1(中国仓鼠卵巢细胞，购自atcc)，操作方法按照生产商说明书进行。
43.转染后24-48小时将细胞以一定细胞密度接种至96孔板，细胞培养基为含筛选药物的筛选培养基，静置培养3～4周后克隆陆续长出。挑选较大的单克隆进行换液吹散，24小时后取上清进行vg1-fc/kj-v01、vg1-his/kj-v01、tsg-6-fc/kj-v01检测。采用ha包被在immunox elisa板上，选择响应值较高的克隆依次扩增至24孔板、t25培养瓶、t75培养瓶、125ml摇瓶，挑选生长良好的克隆进行扩增收液，收液后上清使用proa柱子或者镍柱进行纯化。纯化后的蛋白保存在pbs，ph7.4的体系中。
44.seq id no:1
45.lhkvkvgksppvrgslsgkvslpchfstmptlppsyntseflrikwskievdkngkdlkettvlvaqngnikigqdykgrvsvpthpeavgdasltvvkllasdaglyrcdvmygiedtqdtvsltvdgvvfhyraatsrytlnfeaaqkacldvgaviatpeqlfaayedgfeqcdagwladqtvrypiraprvgcygdkmgkagvrtygfrspqetydvycyvdhldgdvfhltvpskftfeeaakecenqdarlatvgelqaawrngfdqcdygwlsdasvrhpvtvaraqcgggllgvrtlyrfenqtgfpppdsrfdaycfk
46.seq id no:2
47.cppcpapellg
48.seq id no:3
49.lhkvkvgksppvrgslsgkvslpchfstmptlppsyntseflrikwskievdkngkdlkettvlvaqngnikigqdykgrvsvpthpeavgdasltvvkllasdaglyrcdvmygiedtqdtvsltvdgvvfhyraatsrytlnfeaaqkacldvgaviatpeqlfaayedgfeqcdagwladqtvrypiraprvgcygdkmgkagvrtygfrspqetydvycyvdhldgdvfhltvpskftfeeaakecenqdarlatvgelqaawrngfdqcdygwlsdasvrhpvtvaraqcgggllgvrtlyrfenqtgfpppdsrfdaycfkrrmcdkthtcppcpapellg
50.seq id no:4
51.lhkvkvgksppvrgslsgkvslpchfstmptlppsyntseflrikwskievdkngkdlkettvlvaqngnikigqdykgrvsvpthpeavgdasltvvkllasdaglyrcdvmygiedtqdtvsltvdgvvfhyraatsrytlnfeaaqkacldvgaviatpeqlfaayedgfeqcdagwladqtvrypiraprvgcygdkmgkagvrtygfrspqetydvycyvdhldgdvfhltvpskftfeeaakecenqdarlatvgelqaawrngfdqcdygwlsdasvrhpvtvaraqcgggllgvrtlyrfenqtgfpppdsrfdaycfkrrmcdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
52.seq id no:5
53.ctgcacaaggtgaaagtgggcaaatcccctccagtgaggggatctctgagcggcaaagtgagcctcccttgtcacttcagcacaatgcctactctgcctccaagctacaacactagcgagtttctgaggatcaagtggtccaagatcgaggtcgacaagaacggaaaggatctgaaggagacaactgtgctcgtcgctcagaacggcaacatcaagatcggccaagattataaaggcagagtctccgtgccaacacatccagaggctgtgggcgatgcctctctgacagtggtcaagctgctggctagcgacgccggactgtataggtgtgacgtgatgtacggcatcgaagacacacaagatactgtgagcctcacagtcgatggcgtggtgttccactatagggctgccacttctaggtacacactcaacttcgaggccgctcagaaagcttgtctcgacgtgggcgctgtgatcgctactccagagcagctgttcgccgcctacgaggacggcttcgagcaatgtgatgccggctggctcgccgaccagactgtgagataccctattagggcccctagagtcggatgctacggcgacaaaatgggaaaggccggcgtgagaacttacggatttaggagcccacaagagacttatgacgtctactgctacgtggaccatctggatggcgatgtcttccatctgacagtgccatccaagttcactttcgaggaggccgccaaggaatgcgaaaaccaagatgctaggctggccacagtcggagaactgcaagccgcttggaggaacggcttcgatcagtgcgactatggctggctctccgatgctagcgtcagacacccagtgacagtggctagagctcagtgtggaggaggactcctcggcgtgaggactctgtataggttcgagaaccagactggcttccctcctccagattctaggttcgacgcctactgtttcaag
54.seq id no:6
55.tgcccaccttgtcccgcccctgaactgctgggc
56.seq id no:7
57.gkvslpchfstmptlppsyntseflrikwskievdkngkdlkettvlvaqngnikigqdykgrvsvpthpeavgdasltvvkllasdaglyrcdvmygiedtqdtvsltvdgvvfhyraatsrytlnfeaaqkacldvgaviatpeqlfaayedgfeqcdagwladqtvrypiraprvgcygdkmgkagvrtygfrspqetydvycyvdhldgdvfhltvpskftfeeaakecenqdarlatvgelqaawrngfdqcdygwlsdasvrhpvtvaraqcgggllgvrtlyrfenqtgfpppdsrfdaycfkpkeathhhhhh
58.seq id no:8
59.rrmcdktht
60.seq id no:9
61.lnfrappvipnvpflwawnapsefclgkfdepldmslfsfigsprinatgqgvtifyvdrlgyypyidsitgvtvnggipqkislqdhldkakkditfympvdnlgmavidweewrptwarnwkpkdvyknrsielvqqqnvqlslteatekakqefekagkdflvetiklgkllrpnhlwgyylfpdcynhhykkpgyngscfnveikrnddlswlwnestalypsiylntqqspvaatlyvrnrvreairvskipdaksplpvfaytrivftdqvlkflsqdelvytfgetvalgasgiviwgtlsimrsmkscllldnymetilnpyiinvtlaakmcsqvlcqeqgvcirknwnssdylhlnpdnfaiqlekggkftvrgkptledleqfsekfycscystlsckekadvkdtdavdvciadgvcidaflkppmeteepqify
62.实施例2.vg1-fc二聚体蛋白和单体vg1(his标签)蛋白的亲和力测试
63.取1mg/ml透明质酸溶液用0.5mol/l碳酸钠溶液(ph9.6)稀释10倍，混匀，100μl/孔加入96孔板中，2～8℃包被过夜。vg1-fc二聚体蛋白和vg1(his标签)蛋白稀释至1000ng/ml起始，后10倍稀释至100ng/ml，再继续2倍比梯度稀释5个点，一共7个浓度点加入包被透明质酸的96孔板，100μl孔，37℃孵育约1小时。vg1-fc用anti-human igg fcγ-hrp(thermo fisher scientific)酶联抗体检测，vg1(his标签)用anti-6x his抗体(hrp)(abcam)酶联抗体检测，然后经tmb底物显色，molecular devices，spectra max m2e酶标仪450/630nm测量吸光度值。vg1-fc二聚体蛋白相较于单体vg1(his标签)蛋白，在ha包被板上明显表现出卓越的亲和力(图2)。
64.实施例3.vg1-fc二聚体蛋白和tsg-6-fc二聚体蛋白的亲和力测试
65.取1mg/ml透明质酸溶液用0.5mol/l碳酸钠溶液(ph9.6)稀释10倍，混匀，100μl/孔加入96孔板中，2～8℃包被过夜。vg1-fc二聚体蛋白与tsg-6-fc二聚体蛋白稀释至10nm起始，后10倍稀释至1nm，再继续2倍比梯度稀释5个点，一共7个浓度点加入包被透明质酸的96孔板，100μl孔，37℃孵育约1小时。用anti-human igg fcγ-hrp(thermo fisher scientific)酶联抗体检测，然后经tmb底物显色，molecular devices，spectra max m2e酶标仪450/630nm测量吸光度值。vg1-fc二聚体蛋白相较于单体tsg-6-fc，在ha包被板上明显表现出更高的亲和力。vg1-fc的ec50值为0.38
±
0.04nm，tsg-6-fc的ec50值为0.91
±
0.11nm，p＜0.01(图3)。
66.实施例4.vg1-fc与tsg-6-fc二聚体蛋白相比，具有更高的亲和力
67.本实施例进一步在和专利申请cn104093415b相同的检测条件下评估vg1-fc和tsg-6-fc的亲和力情况。根据试剂盒说明书对vg1-fc和tsg-6-fc蛋白进行伯胺活性剂nhs-peg4-生物素(thermo fisher scientific)的直接缀合。取200μl 1mg/ml的pbs体系下蛋白与相应体积的20mm nhs-peg4-生物素试剂冰上孵育2小时或者室温孵育30-60分钟，然后通过试剂盒中zeba
tm spin desalting column进行纯化收集标记蛋白。nhs-peg4-生物素的n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)基团在ph 7-9下特异性且高效的与赖氨酸和n-末端氨基酸反应形成稳定的酰胺键。亲水的聚乙二醇(peg)间隔臂赋予生物素化分子水溶性，减少溶液中储存的生物素化蛋白的聚集。peg间隔臂同时还能为生物素化试剂提供长而灵活的连接，最小化与生物素化蛋白分子结合的空间位阻。
68.取1mg/ml透明质酸溶液用0.5mol/l碳酸钠溶液(ph9.6)稀释10倍，混匀，100μl/孔加入96孔板中，2～8℃包被过夜。生物素化的vg1二聚体蛋白和tsg-6-fc蛋白稀释至10nm起始，后10倍稀释至1nm，再继续2倍比梯度稀释5个点，一共7个浓度点加入包被透明质酸的96孔板，100μl孔，37℃孵育约1小时。hrp标记streptavidin(beyotime biotechnology)酶联抗体检测，然后经tmb底物显色，molecular devices，spectra max m2e酶标仪450/630nm测量吸光度值。生物素化的vg1-fc相较于生物素化的tsg-6-fc，在ha包被板上仍然明显表现出更高的亲和力，1nm浓度下，vg1-fc和tsg-6-fc两种蛋白od450nm分别为0.99
±
0.01和0.14，p＜0.01(图4)。
69.实施例5.vg1二聚体蛋白的免疫组化应用
70.采用免疫组化方法检测正常人皮肤组织ha的表达。对正常人皮肤组织石蜡包埋切片进行脱蜡复水，先将切片置于二甲苯中10分钟，2次，然后依次在100％，95％，85％和75％乙醇，每级放置5-10分钟。再用蒸馏水浸洗5分钟。将切片置于柠檬酸盐缓冲液(ph6.0)中高温热修复8分钟，自然冷却至室温。pbs冲洗三次，每次3分钟。使用3％h2o2孵育15分钟，封闭内源性过氧化物酶，随后采用pbs冲洗三次，每次3分钟。
71.设置3个试验组别，ph20预处理组、正常试验组及阴性对照组。ph20预处理组切片放入用酶稀释液稀释至约90单位/ml的重组人ph20(rhinobio)的溶液中，37℃环境下孵育2小时；其他正常试验组和阴性对照组直接放入酶稀释液中，37℃环境下孵育2小时。孵育完成后，滴加50-100μl山羊血清，37℃温箱孵育20分钟，甩干不洗。ph20预处理组切片滴加20μg/ml的vg1二聚体蛋白溶液，正常试验组滴加20、2、0.2、0.04μg/ml的不同浓度vg1溶液，阴性对照组滴加等量pbs，4℃冰箱过夜，37℃温箱复温1.5小时。所有切片从温箱中取出，用
pbs冲洗三次，每次3分钟，滴加50-100μl hrp标记streptavidin(beyotime biotechnology)，37℃温箱孵育20分钟。pbs冲洗三次，每次3分钟，随后采用dab显色液(auragene)进行显色，室温孵育1-5分钟，镜下控制反应时间。将显色后的片子蒸馏水洗涤，浸泡于苏木素中复染3-5秒，蒸馏水冲洗，pbs返蓝。各级酒精(60-100％)脱水，每级5分钟。取出后置于二甲苯10分钟，2次，中性树胶封片、显微镜观察，进行拍照，结果如图5所示。
72.通过以上免疫组化的方法选择合适的vg1二聚体蛋白使用浓度范围，其显示最佳使用浓度在0.2～2μg/ml。
73.综上可见，本发明得到的vg1-fc二聚体蛋白和vg1二聚体蛋白对透明质酸的亲和力较现有技术更高，同时其在免疫组化实验中也显示出较佳的检测效果。
74.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。