一种从发酵液中分离纯化L-丝氨酸的方法与流程

一种从发酵液中分离纯化l-丝氨酸的方法
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种从发酵液中分离纯化l-丝氨酸的方法。


背景技术：

2.l-丝氨酸是一种具有重要生理功能的非必需氨基酸，在医药、化妆品和化工等领域具有广泛的用途。目前，l-丝氨酸的生产方法主要有化学合成法、蛋白水解法、酶法转化法和微生物发酵法。其中，微生物发酵法是伴随着现代生物技术发展而兴起的一种氨基酸生产方法，微生物发酵法的关键是通过诱变育种和基因编辑等手段选育出具有较大潜在工业价值的氨基酸生产菌株，再结合相关工程发酵技术实现氨基酸的大规模、高效率生产。
3.发酵法是目前最常用的l-丝氨酸生产方法，从发酵液中分离纯化l-丝氨酸是发酵法生产l-丝氨酸的重要步骤，直接影响l-丝氨酸产品生产效率和生产成本。因此，采取有效措施提高l-丝氨酸的收率是目前亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种精氨酸转瓜氨酸的提取纯化方法。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种从发酵液中分离纯化l-丝氨酸的方法，包括以下步骤：
7.(1)将含有l-丝氨酸的发酵液用纯水稀释至l-丝氨酸的浓度≤10g/l，调节ph值至3.5-4.0，然后陶瓷膜过滤，收集滤液；
8.(2)将滤液浓缩至l-丝氨酸的浓度为400-450g/l，得到浓缩液；
9.(3)将浓缩液进行板框脱色，得到脱色液；
10.(4)将脱色液依次经阳离子交换树脂、阴离子交换树脂处理，得到净化液；
11.(5)将净化液离心结晶，收集晶体，洗涤，干燥，即分离纯化得到l-丝氨酸。
12.优选的，步骤(2)中，采用三效蒸发器进行浓缩。
13.优选的，步骤(3)中，在板框中加入活性炭对浓缩液进行脱色。
14.优选的，步骤(4)中，所述阳离子交换树脂处理具体为：将脱色液进入阳离子交换树脂柱，以水作为洗脱液，收集洗脱后的流分；其中，l-丝氨酸含量400-450g/l，杂酸含量≤10g/l的流分进入离子交换树脂柱；l-丝氨酸含量400-450g/l，10g/l＜杂酸含量≤12g/l的流分经再次板框脱色后，再进行阳离子交换树脂处理。
15.优选的，步骤(4)中，阴离子交换树脂处理采用的717阴离子交换树脂，经阴离子处理后的净化液中，l-丝氨酸含量400-450g/l，杂酸含量≤4g/l，电导率≤1000us/cm。
16.优选的，步骤(5)中，离心速率为4000rpm，离心时间为30min。
17.优选的，步骤(5)中，所述洗涤具体为：先用体积分数为50％的酒精洗涤，再用纯水洗涤。
18.本发明的有益效果：
19.(1)本发明将陶瓷膜过滤、板框脱色、阳离子交换树脂吸附、阴离子交换树脂脱色等技术手段有机的结合在一起，将l-丝氨酸从发酵液中分离纯化出来。本发明的分离纯化l-丝氨酸的方法可以实现工业化生产，而且，l-丝氨酸的收率和纯度都了显著提高。
20.(2)本发明在阳离子交换树脂吸附、阴离子交换树脂脱色和离心结晶等过程中，根据处理液中主酸和杂酸的含量进行反复套用，从而极大提高了l-丝氨酸的收率。
附图说明
21.图1：对基因敲除后的菌株进行验证的结果；其中，1-11分别对应为gpma、sdaa、mtfa、pta、glya、sdac、sera、sstt、tdcc、acea和cyca基因的敲除验证结果；每个电泳图中，自左至右各泳道依次为：敲除抗性基因之后、pkd3敲除基因之后、需要敲除的基因、marker
22.图2：质粒pqe-n的结构示意图。
23.图3：构建的第一重组表达载体(pqe-serb&c)的结构示意图。
24.图4：pgex-kan质粒的结构示意图。
25.图5：构建的第二重组表达载体(pgex-sera)的结构示意图。
26.图6：l-丝氨酸检测的二级质谱谱图。
具体实施方式
27.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
28.术语说明：
29.本发明中所用的“纯水”，未标明其他要求时，均符合gb 6682-2008中要求的化验室用水。
30.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
31.本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，如无特殊说明，均可通过商业渠道购买得到。
32.本发明的方法主要适用于现有大肠杆菌发酵生产得到的含有l-丝氨酸的发酵液的分离纯化。其中，本发明实施例和对比例中所使用的“含有l-丝氨酸的发酵液”是由如下方法制备得到的：
33.1、构建l-丝氨酸生产菌：
34.采用red同源重组技术将大肠杆菌(escherichia coli str.k-12substr.mg1655)中的gpma、sdaa、mtfa、pta、glya、sdac、sera、sstt、tdcc、acea和cyca基因敲除，敲除质粒选择pkd3质粒，氯霉素抗性(图1)，获得大肠杆菌工程菌(escherichia coliδssttδsdacδtdccδcycaδmtfaδglyaδptaδsdaaδaceaδgpmaδsera)。
35.将serb基因(seq id no.1所示)用sphⅰ和aaai双酶切处理，将serc基因(seq id no.2所示)用ncoⅰ和bglⅱ双酶切处理，将酶切处理后的serb基因和serc基因整合到经相应酶切处理后的pqe-n质粒(图2，序列如seq id no.3所示)上，构建得到第一重组表达载体(pqe-serb&c)(图3，序列如seq id no.4所示)。
36.将pgex-kan质粒(图4，序列如seq id no.5所示)用econⅰ和zraⅰ双酶切，再将经密码子优化和添加酶切位点处理的seraδ197基因(seq id no.6所示)整合到双酶切处理后的pgex-kan质粒上，获得第二重组表达载体(pgex-sera)(图5，序列如seq id no.7所示)。
37.将构建的第一重组表达载体和第二重组表达载体导入到大肠杆菌工程菌(escherichia coliδssttδsdacδtdccδcycaδmtfaδglyaδptaδsdaaδaceaδgpmaδsera)中，获得转化子，筛选出阳性转化子并进行菌落pcr验证，构建得到l-丝氨酸生产菌。
38.2、发酵生产：
39.(1)菌种活化：
40.将构建的l-丝氨酸生产菌划线接种到含有50μg/ml卡那霉素的lb平板中，30℃、培养24h。
41.(2)一级种培养：
42.从平板划取1接种环菌体接到液体lb培养基中，在30℃、ph7.0、转速20rpm的条件下培养18h。
43.(3)二级种培养：
44.以1％(体积分数)接种量，将一级种子液接种于液体lb培养基中，30℃、溶氧(do)20-40％，培养至od
600nm
值0.2-0.4(稀释100倍)。
45.(4)发酵培养：
46.将l-丝氨酸生产菌的二级种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，二级种子液的接种量为发酵培养基重量的10％，发酵培养的温度为30℃，ph为7.0，溶氧(do)为20-40％，搅拌转速200rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的od
600
值为0.50时，降温至28℃，向体系中加入iptg进行诱导培养，使iptg在体系中的终浓度为0.5mmol/l，诱导培养50h；
47.发酵培养基的组成为：甜菜糖蜜40ml/l、葡萄糖30g/l、玉米浆干粉30g/l、磷酸二氢钾2g/l、柠檬酸0.5g/l、(nh4)2so
4 5g/l、mgso4·
7h2o 0.5g/l、mnso
4 0.08g/l、feso
4 0.06g/l、维生素b
1 0.025g/l、生物素(vh)3mg/l、卡那霉素50ppm。
48.培养过程中监测体系的残糖含量，当体系的残糖含量≤1.0g/l时开始添加补料，通过流加补料使体系中的葡萄糖浓度保持在0.5-1.0g/l；所添加的补料中含有葡萄糖70g/l、甜菜糖蜜50ml/l、叶酸0.4g/l。
49.(5)诱导培养结束后进行放罐，将放罐后的发酵液采用均质机进行破菌处理，均质处理的条件为：均质压力12,000psi，均质流量300l/hr；均质处理后离心，分离上清，即生产得到含有l-丝氨酸的发酵液；经测定，发酵液中l-丝氨酸的含量为105g/l。
50.实施例1：从发酵液中分离纯化l-丝氨酸
51.(1)将含有l-丝氨酸的发酵液用纯水稀释至l-丝氨酸的浓度为10g/l，调节ph值至4.0，然后陶瓷膜过滤(陶瓷膜的孔径为100nm，过滤压力为0.5mpa)，收集滤液；
52.(2)将滤液采用三效蒸发器浓缩至l-丝氨酸的浓度为400g/l，得到浓缩液；
53.(3)将浓缩液进行板框脱色，板框中添加有活性炭，活性炭的加入量为浓缩液重量的4％，得到脱色液；脱色液中l-丝氨酸的浓度为400g/l，杂酸含量≤16g/l。
54.(4)将脱色液用硫酸调ph到4.5，进入732阳离子交换树脂柱，以水作为洗脱液，收集洗脱后的流分；其中，l-丝氨酸含量400g/l，杂酸含量≤10g/l的流分，用氨水ph调到10.0
后进入717离子交换树脂柱；l-丝氨酸含量400g/l，10g/l＜杂酸含量≤12g/l的流分经再次板框脱色后，然后再进行二次阳离子交换树脂处理；l-丝氨酸含量≤80g/l的流分进行调酸处理，然后再进行板框脱色和阳离子交换树脂处理。
55.将l-丝氨酸含量400g/l，杂酸含量≤10g/l的流分用717离子交换树脂柱处理，得到净化液；净化液中，l-丝氨酸含量400g/l，杂酸含量≤4g/l，电导率≤1000us/cm。
56.(5)将净化液离心结晶，离心条件为：离心转速4000rpm，离心时间30min，收集晶体，晶体先用体积分数为50％的酒精洗涤，再用纯水洗涤，洗涤后采用双锥真空干燥，条件如下：
57.预冻：每分钟温度降低15℃，降至-35℃；
58.速冻：制冷板层-40℃，放入制品机器全速制冷，等待2h开始抽真空；
59.升华干燥：真空值控制在10-30pa；
60.解析干燥：缓慢升温至 40℃，真空值小于20pa；
61.关闭冻干箱与冷凝器之间的真空阀门，观察60s，若压力上升小于0.5pa，冻干结束，得到l-丝氨酸干粉。
62.离心后的上清液可返回至板框脱色步骤继续进行处理。
63.对比例1：
64.(1)将含有l-丝氨酸的发酵液用纯水稀释至l-丝氨酸的浓度为10g/l，调节ph值至4.0，然后陶瓷膜过滤(陶瓷膜的孔径为100nm，过滤压力为0.5mpa)，收集滤液；
65.(2)将滤液采用三效蒸发器浓缩至l-丝氨酸的浓度为400g/l，得到浓缩液；
66.(3)将浓缩液进行板框脱色，板框中添加有活性炭，活性炭的加入量为浓缩液重量的4％，得到脱色液；
67.(4)将脱色液离心结晶，离心条件为：离心转速4000rpm，离心时间30min，收集晶体，晶体先用体积分数为50％的酒精洗涤，再用纯水洗涤，洗涤后采用双锥真空干燥，得到l-丝氨酸干粉。
68.对比例2：
69.(1)将含有l-丝氨酸的发酵液用纯水稀释至l-丝氨酸的浓度为10g/l，调节ph值至4.0，然后陶瓷膜过滤(陶瓷膜的孔径为100nm，过滤压力为0.5mpa)，收集滤液；
70.(2)将滤液采用三效蒸发器浓缩至l-丝氨酸的浓度为400g/l，得到浓缩液；
71.(3)将浓缩液直接进入732阳离子交换树脂柱，以水作为洗脱液，收集洗脱后的流分；其中，l-丝氨酸含量400g/l，杂酸含量≤10g/l的流分直接进入717离子交换树脂柱；l-丝氨酸含量400g/l，10g/l＜杂酸含量≤12g/l的流分经再次板框脱色后，然后再进行二次阳离子交换树脂处理；
72.将l-丝氨酸含量400g/l，杂酸含量≤10g/l的流分用717离子交换树脂柱处理，得到净化液；净化液中，l-丝氨酸含量400g/l，杂酸含量≤4g/l，电导率≤1000us/cm。
73.(4)将净化液离心结晶，离心条件为：离心转速4000rpm，离心时间30min，收集晶体，晶体先用体积分数为50％的酒精洗涤，再用纯水洗涤，洗涤后采用双锥真空干燥，得到l-丝氨酸干粉。
74.对比例3：
75.将实施例1中的步骤(5)中的“双锥真空干燥”调整成常规的烘箱干燥，得到l-丝氨
酸干粉。
76.对比例1-对比例3的l-丝氨酸干粉的水分含量与实施例1的l-丝氨酸干粉的水分含量保持一致。
77.对本实施例1和对比例1-2得到的成品的收率和纯度进行测定。其中，收率是先直接测定发酵液中l-丝氨酸的浓度，计算出应得l-丝氨酸的量；再进行提纯，得到丝氨酸精品后，按如下公式计算收率：
78.收率＝(丝氨酸精品的量/应得丝氨酸的量)*100％。
79.纯度是丝氨酸精品中丝氨酸占丝氨酸精品的重量百分比。
80.l-丝氨酸的检测方法如下：
81.标准品储备液配制：取l-ser标准品10mg，用水溶解并定容至10ml，制得浓度为1mg/ml的储备液；
82.衍生溶液的配制：分别称取opa15mg和nac100mg，溶于1ml甲醇，加入4ml0.1mol/l的硼砂缓冲液(ph＝10.0)混合均匀，4℃储存备用。使用前加0.1mol/l的硼砂缓冲液(ph＝10.0)稀释至所需浓度作为工作液。
83.取90μl发酵液，加10μl内标(10ug/mll-can)，20μl衍生试剂和1080μl水，涡旋混合反应3min后进样。(丝氨酸精品中l-丝氨酸含量测定是将丝氨酸精品用水溶解后再按上述方法进行测定)
84.衍生化反应：
[0085][0086]
色谱条件
[0087]
色谱柱：watersxbridge beh c18柱(150mm
×
3mm，2.5um)；流动相：13mmol/lnh4ac溶液(a)-甲醇(b)。梯度洗脱：0～5min，5％～20％b；5～8min，20％～42.5％b；8～10min，42.5％～90％b；10～11min，90％b；11～11.5min，90％～5％b；11.5～15min，5％b。体积流量：0.4ml/min；柱温：40℃；自动进样器温度为4℃；进样量：5μl。
[0088]
质谱检测参数
[0089][0090]
结果计算：面积法
[0091]
经测定，实施例1和对比例1-2纯化得到的l-丝氨酸的收率和纯度结果如下：
[0092]
表1：
[0093][0094]
以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。