一种检测BK病毒和JC病毒的试剂及应用的制作方法

一种检测bk病毒和jc病毒的试剂及应用
技术领域
1.本发明涉及一种检测bk病毒和jc病毒的试剂及应用，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.多瘤病毒是常见的机会性病毒，人群携带率高。常在人类儿童时期建立感染并潜伏，待人体免疫力低下时活化并引起相关疾病。其中bk病毒和jc病毒(bkv和jcv)是最早发现和最被熟知的人多瘤病毒。bkv人群携带率超过85％，在免疫力正常的人群中并不发病。而对于免疫抑制剂服用者(如器官移植受者、自身免疫病患者等)、艾滋病患者等免疫力低下的人群、孕妇和老人，bkv可能导致严重的泌尿系统疾病，如能引起6％的肾移植受者发生多瘤病毒相关肾病(pyvn)，严重时导致移植肾丧失功能；能引起大约10％的造血干细胞移植受者发生出血性膀胱炎，且无有效的抗bkv药物。因此，bkv的早期诊断对于预防bkv相关疾病的发生至关重要。其中，荧光探针法实时定量聚合酶链式反应(qpcr)诊断是临床上应用普遍的bkv定量诊断方法。bkv的基因组分为早期编码区(含lt和st基因)、晚期编码区(含agno、vp1、vp2和vp3基因)和非编码调控区(nccr)。除nccr外，编码区均被用于设计qpcr诊断的靶区域。但已申请专利的有些引物探针体系需要优化，有些靶向区域有待优化。
3.jcv常在艾滋病患者中引起进行性白质脑病(pml)，死亡率高，临床亦缺乏有效的抗病毒手段。jcv在肾移植患者中引起的pml也有报道，大约5％的多瘤病毒相关肾病由bkv以外的多瘤病毒(尤其是jcv)导致。bkv引起的pml也有报道。bkv和jcv的序列相似度高达75％，且均可在人体尿液、血液和脑脊液样本中分布。因此，设计qpcr体系时需充分考虑靶标和特异性。对于初筛来说，同时靶向bkv和jcv的体系有利于节约资源；对于精准判断bkv或jcv相关疾病，就需要特异的qpcr体系。因此，本发明仅通过反向引物选择便可兼顾这两种情况，适合临床推广。


技术实现要素：

4.本发明的目的是为解决如何通过变换反向引物而同时靶向或分别靶向bkv和jcv以定量诊断的技术问题。
5.为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种同时检测bk病毒和jc病毒的pcr试剂，包括通用正向引物，还包括同时靶向bk病毒和jc病毒的反向引物，反向引物的核苷酸序列为seq id no：3，seq id no：3为gttggggccatcttcatatg。
6.本发明提供一种能同时靶向bk病毒和jc病毒，且能分别判断bk病毒或jc病毒的pcr试剂，包括通用正向引物，还包括同时靶向bk病毒和jc病毒的反向引物，核苷酸序列为seq id no：3，seq id no：3为gttggggccatcttcatatg；靶向bk病毒的反向引物，核苷酸序列为seq id no：4，seq id no：4为ttggctttttgggagctg；靶向jc病毒的反向引物，核苷酸序列为seq id no：5，seq id no：5为gggtccttcctttctcct。
7.本发明提供一种上述pcr试剂在制备检测bk病毒和/或jc病毒的诊断试剂盒中的应用。
8.本发明提供一种上述pcr试剂在制备与bk病毒和/或jc病毒相关疾病的预后试剂盒中的应用。
9.本发明提供一种上述pcr试剂在非诊断方法和非治疗方法中的应用。
10.相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
11.bkv和jcv活化后严重威胁免疫力下降的人群，目前临床上除了削减免疫抑制强度(对器官移植患者，同时增加了器官排斥风险)外无有效的抗病毒手段。因此，二者的早期诊断对于预防其活化至关重要。同时，bkv定量监测对于评价bkv相关疾病的治疗效果、及时调回免疫抑制强度(防止器官排斥)至关重要。本发明主要目是预防bkv和jcv活化和及时评估相关疾病治疗效果，弥补现有检测体系的缺陷和不足，使检测结果更加可靠。且本发明兼顾bkv和jcv均能引起如pyvn和pml等疾病且治疗方案类似的情况，可同时靶向二者进行初筛，利于及时的免疫抑制调整。
12.本发明通过比对ncbi(national center for biotechnology information美国国立生物技术信息中心)上全部bkv序列和本发明中自主测序的bkv和jcv临床株序列，对bkv和jcv毒株覆盖广，保守性高。本发明体系的关键靶区域为bkv和jcv高度保守区中一段jcv存在片段缺口的区域。在缺口区域以外适合设计同时靶向bkv和jcv的引物探针体系，仅在缺口区域设计的反向引物便可特异性靶向bkv或jcv，且不会出现二者相互干扰引起的假阳性结果。
附图说明
13.图1为对80例样本的qpcr结果图。
具体实施方式
14.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：
15.本发明提供一种通过变换反向引物同时或分别检测bk病毒和jc病毒的荧光探针法定量核酸诊断试剂盒。
16.本发明提供一种同时检测bk病毒和jc病毒的通用探针和通用正向引物，通用探针的核苷酸序列为seq id no：1，seq id no：1为tgtacgggactgtaacacctgctcttg；通用正向引物的核苷酸序列为seq id no：2，seq id no：2为ctcctcaatggatgttgcc。通过变换反向引物达到同时识别bk病毒和jc病毒，或分别特异性识别的目的。
17.为达到同时检测bk病毒和jc病毒的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种同时检测bk病毒和jc病毒的通用探针和通用正向引物，加上同时靶向bk病毒和jc病毒的通用反向引物，通用反向引物的核苷酸序列为seq id no：3，seq id no：3为gttggggccatcttcatatg。
18.为达到特异性检测bk病毒的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种同时检测bk病毒和jc病毒的通用探针和通用正向引物，加上特异性靶向bk病毒的反向引物，bk病毒特异性反向引物的核苷酸序列为seq id no：4，seq id no：4为ttggctttttgggagctg。
19.为达到特异性检测jc病毒的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种同时检测bk病毒和jc病毒的通用探针和通用正向引物，加上特异性靶向jc病毒的反向引物，jc病毒特异性反向引物的核苷酸序列为seq id no：5，seq id no：5为gggtccttcctttctcct。
20.本发明提供一种上述qpcr试剂在制备检测bk病毒和/或jc病毒的诊断试剂盒中的应用。
21.本发明提供一种上述qpcr试剂在制备与bk病毒和/或jc病毒相关疾病的预后试剂盒中的应用。
22.本发明提供一种上述qpcr试剂在非诊断方法和非治疗方法中的应用。
23.实施例
24.(1)选择bkv和jcv序列匹配区域。
25.1)通过分别比对已有的bkv序列，找到多个bkv和jcv序列高度匹配的区域，其中晚期编码区vp2/vp3和vp1的重叠区域有一段22bp jcv片段缺失区域，因此这一区域非常适合设计特异性靶向bkv或jcv，以及同时靶向二者的引物探针体系。
26.在二者匹配区域选择对bkv和jcv均高度保守的序列设计通用的正向引物、探针和同时靶向二者的反向引物；在jcv缺失区域附近设计jcv特异性反向引物；在jcv缺失区域对应的bkv序列中设计特异性针对bkv的特异性反向引物。并依据下列标准进行优化：
27.a.扩增片段大小介于80-180bp之间，探针长度不超过30个核苷酸；
28.b.避免引物、探针序列的二级结构和相互之间的配对；
29.c.引物退火温度(tm)介于50-65度，正反引物退火温度差不超过3度，探针退火温度比引物高5-10度；
30.d.探针不以g开头且c的含量不低于g；
31.e.通过blast(basic local alignment search tool)检验确保特异性。
32.根据以上条件，设计如下引物和探针(表1)。
33.表1.本发明设计的bkv、jcv引物和探针体系。
34.不匹配点定义为在相应位点上有不同碱基。
[0035][0036][0037]
seq id no：1为tgtacgggactgtaacacctgctcttg，在试剂盒中可用probe表示；
[0038]
seq id no：2为ctcctcaatggatgttgcc，在试剂盒中可用f表示；
[0039]
seq id no：3为gttggggccatcttcatatg，在试剂盒中可用rpy表示；
[0040]
seq id no：4为ttggctttttgggagctg，在试剂盒中可用rbk表示；
[0041]
seq id no：5为gggtccttcctttctcct，在试剂盒中可用rjc表示；
[0042]
(2)检验bkv的引物和探针序列。
[0043]
1)利用hiv感染者尿液，检测本发明qpcr引物探针。
[0044]
利用本体系，对收集的hiv感染者尿液80例(以采集时间为序)分别用rbk体系(特异性检测bkv)、rjc体系(特异性检测jcv)和rpy体系(同时检测bkv与jcv)进行qpcr检测，标准曲线使用通用正向引物f与rjc扩增产物克隆至t载体所得质粒。结果显示80例样本中46例bkv阳性(57.5％)，42例jcv阳性(52.5％)，22例双阳性(27.5％)。利用rpy检测阳性结果65例，仅18号样本bkv读值29.1拷贝，rpy检测阴性，其余读值与单独检测rbk或rjc结果中的高值相符，显示本体系良好的性能和准确度。如图1所示，对80例样本的qpcr结果。三组区别为：rbk体系特异性检测bkv，rjc体系特异性检测jcv，rpy体系同时检测bkv和jcv(所示读值为qpcr直接读值，未换算至尿液病毒载量)。
[0045]
已有的关于bkv和jcv的qpcr诊断体系有些引物探针序列(gc含量和退火温度等方面)需要优化，有些靶向区域有待优化。特别是随着新测序的bkv序列不断增加，要求设计优化覆盖度更高、bkv特异性更强的探针法荧光定量pcr体系。
[0046]
本发明比对了ncbi上全部bkv序列和本发明中自主测序的bkv和jcv临床株序列(暂未上传到ncbi)，本发明对bkv和jcv毒株覆盖广，保守性高。本体系的关键靶区域为bkv和jcv高度保守区中一段jcv存在片段缺口的区域。在缺口区域以外适合设计同时靶向bkv和jcv的引物探针体系，仅在缺口区域设计的反向引物便可特异性靶向bkv或jcv，且不会出现二者相互干扰引起的假阳性结果。
[0047]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
[0048]
[0049]