除草剂抗性蛋白、基因和用途的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种除草剂抗性蛋白、基因和用途。


背景技术：

2.杂草可以迅速耗尽土壤中的水分和各种作物所需要的养分，还与作物竞争生长空间，严重影响作物生长发育。随着农村城市化发展和农村劳动力转移，人工除草已经不经济也不现实。耕作制度的改变比如自然免耕和作物直播等轻便栽培方式的推广实施，草害问题越来越突出，严重制约农作物的高产和稳产，急需解决方案。在这种背景下除草剂的使用成为必然的选择，现在的耕地和非耕地除草越来越依赖使用除草剂。
3.根据除草机制的不同，除草剂可以被分为很多类型。但根据其有无选择性来划分，可简单地分为灭生性除草剂和选择性除草剂两大类。特别流行的草甘膦、2,4-d、草铵膦和百草枯等都属于灭生性除草剂。这些灭生性除草剂多用于非耕地、铁路、公路、仓库、森林防火道等地除草。随着转基因除草剂抗性作物的出现和推广应用，一些灭生性除草剂也大面积地用于农田除草，比如草甘膦、2,4-d和草铵膦用于有抗性的玉米、大豆、棉花、甜菜等地除草，而不伤害农作物。
4.草甘膦已经在全球广泛使用超过25年，由此导致对草甘膦和草甘膦耐性作物技术的过度依赖，长期使用单一除草剂草甘膦对野生杂草种群施加了高的选择压力，导致抗性杂草发生。据报道，已有40几种杂草表现出对草甘膦的抗性，pest manag sci 2018；74:1089
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1093，包括阔叶杂草和禾本科杂草，如多种野苋菜(amaranthus spp.)、豚草(ambrosia spp.)、小飞蓬(conyza canadensis)、牛筋草(eleusine indica)、刺撒笼(salsola tragus)等。
5.2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)是激素类除草剂的代表，是另一类灭生性除草剂，与草甘膦混合或单独使用可以防除草甘膦抗性杂草。2,4-d已经在耕地和非耕地用于广谱阔叶杂草控制超过65年，但仍然在全球广泛使用。另一方面，2,4-d对双子叶植物(如大豆或棉花)的选择性特别差，一般不用于敏感性双子叶作物除草；即使对禾本科作物也不十分安全。这些因素也同时限制了2,4-d在农田除草中的应用。
6.2,4-d有个优点，即在土壤里的半衰期较短，对后茬作物没有明显影响。根据这一线索，科学家找到了许多能够降解2,4-d化合物的土壤微生物。已经广泛研究能降解2,4-d的是真养雷氏菌(ralstonia eutropha)，其降解基因叫tfda。tfda编码aad类酶，α-酮戊二酸依赖型双加氧酶(aads,α-ketoglutarate dependent aryloxyalkanoate dioxygenases)。该类酶可降解2,4-d、二甲四氯等苯氧乙酸类除草剂，可将2,4-d脱去乙酸基团生成毒性较低的2,4-二氯苯酚(dcp)。tfda酶蛋白有个taud结构域负责降解2,4-d。目前已报道的2,4-d降解主要通过两条代谢途径：
①
在α-酮戊二酸依赖型双加氧酶基因tfda(来自真养产碱菌jmp134)或cadabc(来自短根瘤菌hw13)的作用下，催化2,4-d脱去乙酸基团生成毒性比2,4-d低100倍的2,4-二氯苯酚(dcp)，随后2,4-二氯苯酚在羟化酶tfdb的催化下被转化为3,5-二氯邻苯二酚，然后依次在tfdc、tfdd、tfde、tfdf的作用下开环最终被
降解为β-酮己二酸，进入三羧酸循环。
②
在球褐固氮菌(azotobacter chroococcum)中，2,4-d在未知脱氯酶的作用下首先脱去一个氯原子生成对氯苯氧乙酸，随后氧化脱去乙酸基团生成对氯苯酚，进一步羟基化生成4-氯邻苯二酚，然后开环被降解为β-酮己二酸，最终进入三羧酸循环。还有些aad酶，例如来源于食酸戴尔福特菌(comamonas acidovorans)的aad-12，可以催化其他类除草剂，如吡啶氧乙酸类的氯氟吡氧乙酸类(绿草定triclopyr和氟草烟fluroxypyr)以及芳氧基苯氧基丙酸酯类(aopp)除草剂(cn101688219b；us2019/0017066al；us10167483b2；anne westendorf,dirk benndorf,roland h.m
ü
ller,wolfgang babel.2002.the two enantiospecific dichlorprop/α-ketoglutarate-dioxygenases from delftia acidovorans mc1
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protein and sequence data of rdpa and sdpa.microbiol.res.(2002)157,317
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322,http://www.urbanfischer.de/journals/microbiolres；jonathan r.chekan,chayanid ongpipattanakul,terry r.wright,bo zhang,j.martin bollinger jr.,lauren j.rajakovich,carsten krebs,robert m.cicchillo,and satish k.nair.2019.molecular basis for enantioselective herbicide degradation imparted by aryloxyalkanoate dioxygenases in transgenic plants)。
7.随着转基因技术的发展，aad酶类编码基因被转入敏感植物如棉花和烟草，转基因植物获得了2,4-d抗性，这为解决草甘膦抗性杂草提供了技术方案。美国陶氏农科(dow agrosciences)公司推出了转基因玉米、大豆、棉花等作物，分别表达aad1、aad12和aad13来降解2,4-d类的除草剂(t.r.wright et al.,robust crop resistance to broadleaf and grass herbicides provided by aryloxyalkanoate dioxygenase transgenes.proc.natl.acad.sci.u.s.a.107,20240
–
20245(2010))，这使2,4-d为代表的激素类除草剂在农田除草上的应用提供了条件。
8.综上，除草剂的类型繁多，但目前筛选到的降解基因数目和各自的抗谱非常有限，不能满足作物除草剂抗性性状培育的需要，急需筛选更多类型的基因为转基因作物研发提供基因资源。
9.发明概述
10.为解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种除草剂抗性蛋白、基因和用途。
11.本发明提供一种重组dna分子，其包含下述的核酸序列：
12.(1)编码包含与选自以下组的至少一个氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的蛋白或其生物活性片段的核酸序列或其互补序列：seq id no:41、seq id no:51、seq id no:59、seq id no:63、seq id no:65、seq id no:67、seq id no:69、seq id no:83、seq id no:85、seq id no:87、seq id no:89、seq id no:91、seq id no:93、seq id no:95、seq id no:97、seq id no:99、seq id no:101、seq id no:103、seq id no:105、seq id no:107、seq id no:109、seq id no:111、seq id no:113、seq id no:115、seq id no:123、seq id no:143、seq id no:145、seq id no:147、seq id no:149和seq id no:151；
13.(2)seq id no:42、seq id no:52、seq id no:60、seq id no:64、seq id no:66、seq id no:68、seq id no:70、seq id no:84、seq id no:86、seq id no:88、seq id no:
90、seq id no:92、seq id no:94、seq id no:96、seq id no:98、seq id no:100、seq id no:102、seq id no:104、seq id no:106、seq id no:108、seq id no:110、seq id no:112、seq id no:114、seq id no:116、seq id no:124、seq id no:144、seq id no:146、seq id no:148、seq id no:150或seq id no:152所示的核酸序列或其互补序列；
14.(3)在严谨条件下与(1)或(2)所示序列杂交的核酸序列；或
15.(4)因遗传密码的简并性而与(1)或(2)所示序列编码相同氨基酸序列的核酸序列或其互补序列。
16.在一个具体实施方式中，所述重组dna分子可操作地连接至在植物细胞中有功能的异源启动子。
17.本发明提供一种dna构建体，其包含可操作地连接至所述的重组dna分子的在植物细胞中有功能的异源启动子。
18.在另一个具体实施方式中，所述dna构建体存在于转基因植物的基因组中。
19.本发明提供一种蛋白或其生物活性片段，其由所述的重组dna分子编码。
20.本发明另外提供一种蛋白或其生物活性片段，其氨基酸序列与选自以下组的至少一个氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性：seq id no:41、seq id no:51、seq id no:59、seq id no:63、seq id no:65、seq id no:67、seq id no:69、seq id no:83、seq id no:85、seq id no:87、seq id no:89、seq id no:91、seq id no:93、seq id no:95、seq id no:97、seq id no:99、seq id no:101、seq id no:103、seq id no:105、seq id no:107、seq id no:109、seq id no:111、seq id no:113、seq id no:115、seq id no:123、seq id no:143、seq id no:145、seq id no:147、seq id no:149和seq id no:151。
21.在一个具体实施方式中，所述的蛋白或其生物活性片段，其对选自以下类型的除草剂中的至少一种具有加氧酶活性：激素类除草剂、accase抑制剂类除草剂。
22.本发明提供一种植物、种子、细胞或植物部分，其包含所述的重组dna分子、所述的dna构建体、或所述的蛋白或其生物活性片段。
23.在一个具体实施方式中，所述的植物、种子、细胞或植物部分，其包含对选自以下类型的除草剂中的至少一种的耐受性：激素类除草剂、accase抑制剂类除草剂。
24.本发明提供一种分离的多核苷酸，其中包含所述的重组dna分子、所述的dna构建体、或编码所述蛋白或其生物活性片段的核酸序列或其互补序列。
25.本发明提供一种植物基因组，其中包含所述的多核苷酸。
26.本发明提供一种载体，其中包含所述的多核苷酸以及与之可操作连接的同源启动子。
27.在一个具体实施方式中，所述启动子为诱导型启动子或植物基因组中的自身基因启动子。
28.本发明提供一种宿主细胞，其中包含所述的多核苷酸或所述的载体。
29.本发明提供一种用于产生或提高除草剂耐受性的植物或种子的方法，其包括用所述的重组dna分子或所述的dna构建体转化植物细胞或组织，和从所述转化的植物细胞或组织再生除草剂耐受性植物。
30.本发明提供通过前述方法所生产的植物或种子。
31.本发明提供一种用于赋予植物、种子、细胞或植物部分以除草剂耐受性的方法，所述方法包括在所述植物、种子、细胞或植物部分中表达所述的蛋白或其生物活性片段；
32.或者，其中包括将表达所述的蛋白或其生物活性片段的植物与另一植物杂交，以及筛选能产生或提高对除草剂耐受性的植物、种子、细胞或植物部分；
33.或者，其中包括对所述植物、种子、细胞或植物部分进行基因编辑，以实现在其中表达所述的蛋白或其生物活性片段。
34.在一个具体实施方式中，所述植物、种子、细胞或植物部分包含所述的dna构建体。
35.本发明提供所述的重组dna分子、所述的dna构建体、所述的蛋白或其生物活性片段、所述的多核苷酸、所述的植物基因组、所述的载体或所述的宿主细胞用于产生或提高植物、种子、细胞或植物部分对除草剂耐受性的用途。
36.本发明提供一种用于控制植物生长区域中的杂草的方法，其包括使含有耐受除草剂的植物或种子的植物生长区域与所述除草剂接触，所述植物或种子包括前述的植物或种子、通过前述方法制备的植物或种子、或包含所述的重组dna分子的植物或种子。
附图说明
37.图1.aad-12表达菌大肠杆菌菌内降解2,4-d产生酚类物质，加入显色液后显现红色。
38.图2-1.筛选得到的16个能够降解2,4-d的新的aad类似基因表达菌(编号d42、d43、d44、d45、d46、d47、d48、d49、d50、d30、d72、d73、d74、d75、d76和d58，d＝qyd)菌内降解谱测试。测试化合物包括2,4-d、二甲四氯、2,4-d丁酸、麦草畏、氯氟吡氧乙酸、绿草定和属于accase抑制剂的精喹禾灵测试。结果显示，这些基因所编码的aad类似酶除对2,4-d降解外，对二甲四氯也有强的降解能力；其中d42、d43、d46、d47、d48、d30、d72、d73、d74、d76和d58(d＝qyd)对绿草定显示微弱降解；对其余的都不降解。pet15b空载体，作为阴性对照；aad12是阳性对照。
39.图2-2.筛选得到的另外9个能够降解2,4-d的新的aad类似基因表达菌(编号d21、d51、d52、d53、d54、d55、d56、d57、d62，d＝qyd)菌内降解谱测试。测试化合物包括2,4-d、二甲四氯、2,4-d丁酸、麦草畏、氯氟吡氧乙酸、绿草定和属于accase抑制剂的精喹禾灵。结果显示，这些aad类似酶除对2,4-d降解外，对二甲四氯也有更强的降解能力；但对其余的都不降解。pet15b空载体，作为阴性对照；aad12是阳性对照。
40.图3.aad类似基因在拟南芥中过表达的代表性载体。aad类似基因的表达由patubq10(＝atubi10启动子)拟南芥泛素启动子和甘露减合成酶mas(mannopine synthase)终止子调控下进行。筛选标记是潮霉素抗性基因(hygr＝hpt)。
41.图4-1.转aad类似基因拟南芥t1代幼苗代表性2,4-d抗性筛选试验。平板培养基中含有2,4-d化合物(0.3μmol)。col-0：野生型拟南芥columbia-0品种，在2,4-d的作用下其种子根受到抑制，不能生长。pqyxxxx代表用各种过表达载体蘸花转化后的t1代幼苗：没有被正常转化的(即野生型)，或者虽然被正常转化但其转基因不抗2,4-d的植株，其种子根也不能生长，那些种子根能够正常长出的植株，表明是转基因，而且能够抗2,4-d。
42.图4-2.转aad类似基因拟南芥t1代幼苗2,4-d丁酸钠抗性筛选试验。平板培养基中含有2,4-d丁酸钠化合物(0.7μmol)。col-0：野生型拟南芥columbia-0品种，在2,4-d丁酸钠
的作用下其种子根受到抑制，不能生长。pqyxxxx代表用各种过表达载体蘸花转化后的t1代幼苗：没有被正常转化的(即野生型)，或者虽然被正常转化但其转基因不抗2,4-d丁酸钠的植株，其种子根也不能生长，那些种子根能够正常长出的植株，表明是转基因，而且能够抗2,4-d丁酸钠。
43.图4-3.转aad类似基因拟南芥t1代幼苗二甲四氯抗性筛选试验。平板培养基中含有二甲四氯化合物(0.1μmol)。col-0：野生型拟南芥columbia-0品种，在二甲四氯的作用下其种子根受到抑制，不能生长。pqyxxxx代表用各种过表达载体蘸花转化后的t1代幼苗：没有被正常转化的(即野生型)，或者虽然被正常转化但其转基因不抗二甲四氯的植株，其种子根也不能生长，那些种子根能够正常长出的植株，表明是转基因，而且能够抗二甲四氯。
44.图5-1.转aad类似基因拟南芥t2代幼苗2,4-d抗性试验。平板培养基中含有2,4-d化合物(0.3μmol)。col-0：野生型拟南芥columbia-0品种，其种子根不能生长。pqyxxxx代表用各种过表达载体蘸花转化后的t2代幼苗，每个载体测试两个株系：有的转基因拟南芥种子根生长正常，有的生长也不正常，这表明基因本身在2,4-d抗性上的差异，也可能是表达量上(不同转化事件)的差异。
45.图5-2.转aad类似基因拟南芥t2代幼苗代表性二甲四氯抗性试验。平板培养基中含有二甲四氯化合物(0.1μmol)。col-0：野生型拟南芥columbia-0品种，其种子根不能生长。pqyxxxx代表用各种过表达载体蘸花转化后的t2代幼苗，每个载体测试两个株系：有的转基因拟南芥种子根生长正常，有的生长也不正常，这表明基因本身在二甲四氯抗性上的差异，也可能是表达量上(即不同转化事件)的差异。
46.图5-3.转aad类似基因拟南芥t2代幼苗代表性2,4-d丁酸钠抗性试验。平板培养基中含有2,4-d丁酸钠化合物(0.7μmol)。col-0：野生型拟南芥columbia-0品种，其种子根不能生长。pqyxxxx代表用各种过表达载体蘸花转化后的t2代幼苗，每个载体测试两个株系：有的转基因拟南芥种子根生长正常，有的生长也不正常，这表明基因本身在2,4-d丁酸钠抗性上的差异，也可能是表达量上(即不同转化事件)的差异。
47.图6-1.代表性转基因拟南芥t2代苗对2,4-d(喷雾)的抗性。col-0：野生型拟南芥columbia-0品种，喷雾2,4-d(100克/公顷)处理10天后全死亡，而所有转基因拟南芥的所有株系均无明显伤害。
48.图6-2.代表性转基因拟南芥t2代苗对二甲四氯(喷雾)的抗性。col-0：野生型拟南芥columbia-0品种，喷雾二甲四氯(100克/公顷)处理10天后全死亡，而所有转基因拟南芥的所有株系均无明显伤害。
49.图6-3.代表性转基因拟南芥t2代苗对2,4-d丁酸钠(喷雾)的抗性。col-0：野生型拟南芥columbia-0品种，喷雾2,4-d丁酸钠(100克/公顷)处理10天后伤害严重，而所有转基因拟南芥的所有株系均无明显伤害。
50.图7-1.pqy2329转aad类似基因qyd42(seq id no.83)玉米过表达载体。qyd42的表达由玉米泛素启动子和nos终止子调控；筛选基因blpr(草铵膦抗性基因)表达由camv35s启动子及其终止子调控。
51.图7-2.代表性转基因玉米事件t1代苗对2,4-d(喷雾)的抗性。wt(野生型)：玉米b104喷雾2,4-d(4.48公斤/公顷)处理14天后茎基部肿大，而pqy2329转基因事件的茎基部无明显畸形。
52.图8-1.pqy2330转aad类似基因qyd42(seq id no.83)大豆过表达载体。qyd42的表达由双camv35s启动子和nos终止子调控；筛选基因blpr(草铵膦抗性基因)表达由甘露减合成酶(mannopine synthase)mas启动子及其终止子调控。
53.图8-2.代表性转基因大豆事件t1代苗对2,4-d(喷雾)的抗性。wt(野生型)：大豆william82喷雾2,4-d(4.48公斤/公顷)处理10天后死亡，而pqy2330转基因事件正常，喷水对照没有差异。
54.发明详述
55.提供以下定义和方法以更好地限定本发明并指导本领域的普通技术人员实施本发明。除非另外说明，否则术语应根据相关领域的普通技术人员的常规用法来理解。
56.在本发明中，“激素类除草剂”是本身有除草活性的物质或者与能改变其效果的其他除草剂和/或添加剂合用的物质，其属于植物激素干扰型除草剂，在本领域中是熟知的，例如包括以下有效成分或其衍生物中的至少一种：
57.(1)吡啶羧酸类(pyridine carboxylic acids)：氨氯吡啶酸(毒莠定)、氯氟吡氧乙酸(氟草烟)、氯氟吡氧乙酸异辛酯、氯氨吡啶酸、二氯吡啶酸、三氯吡氧乙酸(绿草定)、氯氟吡啶酯、氟氯吡啶酯、氟氯氨草酯等；
58.(2)苯甲酸类(benzoic acids)：麦草畏、草灭平、草芽畏、萘草胺等；
59.(3)苯氧羧酸类(phenoxycarboxylic acids)：2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、2,4-二氯苯氧丁酸(2,4-d丁酸)、2,4-d异丙酸、氯甲酰草胺、二甲四氯、二甲四氯异丙酸、二甲四氯丁酸等；
60.(4)喹啉羧酸类(quinoline carboxylic acids)：二氯喹啉酸、氯甲喹啉酸等；
61.(5)其他：草除灵等。
[0062]“accase抑制剂类除草剂”是以乙酰辅酶a羧化酶为作用靶标的除草剂，在本领域中是熟知的，例如包括以下有效成分或其衍生物中的至少一种：
[0063]
(1)芳氧苯氧丙酸类：精喹禾灵、炔草酯、氰氟草酯、禾草灵、精噁唑禾草灵、精吡氟禾草灵、高效氟吡禾草灵、噁唑酰草胺、噁草酸、喹禾糠酯等；
[0064]
(2)环己烯酮类：禾草灭、烯草酮、环苯草酮、丁苯草酮、噻草酮、烯禾啶、吡喃草酮、三甲苯草酮等；
[0065]
(3)苯并吡啶类：唑啉草酯等。
[0066]
在本说明书的上下文中，如果使用活性化合物的通用名称的缩写形式，则在每种情况下包括所有的常规衍生物，例如酯和盐，以及异构体，特别是光学异构体，特别是一种或多种市售形式。如果通用名称表示酯或盐，则在每种情况下还包括所有其他的常规衍生物，例如其他的酯和盐、游离酸和中性化合物，以及异构体，特别是光学异构体，特别是一种或多种市售形式。给出的化合物的化学名称表示至少一种被通用名称涵盖的化合物，通常是优选的化合物。例如，2,4-d或2,4-d丁酸衍生物包含但不限于：2,4-d或2,4-d丁酸盐如钠盐、钾盐、二甲铵盐、三乙醇铵盐、异丙胺盐、胆碱等，以及2,4-d或2,4-d丁酸酯如甲酯、乙酯、丁酯、异辛酯等；二甲四氯衍生物包含但不限于：二甲四氯钠盐、钾盐、二甲铵盐、异丙胺盐等，以及二甲四氯甲酯、乙酯、异辛酯、乙硫酯等。
[0067]
在本发明中，“除草剂耐受性”和“除草剂抗性”两个术语可以互换使用，均指的是对除草剂的耐受性和对除草剂的抗性，意指植物、种子、细胞或植物部分抵抗一种或多种除
草剂的毒性作用的能力。植物、种子、细胞或植物部分的除草剂耐受性可通过将植物、种子、细胞或植物部分与合适的对照进行比较来测量。例如，除草剂耐受性可通过将除草剂施加至包含编码能够赋予除草剂耐受性的蛋白质的重组dna分子的植物(测试植物)和不包含编码能够赋予除草剂耐受性的蛋白质的重组dna分子的植物(对照植物)，且然后比较两种植物的植物损伤，其中测试植物的除草剂耐受性通过与对照植物的损伤率相比减少的损伤率指示。当与对照植物、种子、细胞或植物部分相比时，除草剂耐受性植物、种子、细胞或植物部分显示对除草剂的毒性作用的反应降低。如本文所用，“除草剂耐受性性状”是与野生型植物或对照植物相比赋予植物改善的除草剂耐受性的转基因性状。
[0068]
在本发明中，“野生型”意指天然存在的，其和突变是相对来说的。
[0069]
术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。
[0070]
如本领域中所熟知的，可以从蛋白质的n和/或c末端缺失一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。在本发明中，“生物活性片段”是指本发明的蛋白的一部分，其保留了蛋白的生物学活性。例如，蛋白的生物学活性片段可以是在所述蛋白质的n和/或c末端缺失了一个或多个(例如1－50个、1－25个、1－10个或1－5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸残基的部分，但其仍然保留了全长蛋白的生物学活性。
[0071]
本发明中，“严谨条件”可以指6m尿素、0.4％sds、0.5
×
ssc的条件或与其同等的杂交条件，也可以指严谨性更高的条件，例如6m尿素、0.4％sds、0.1
×
ssc或与其同等的杂交条件。在各种条件中，温度可约为40℃以上，如需要严谨性更高的条件时，温度例如可约为50℃，进一步可约为65℃。
[0072]
本领域技术人员十分清楚，由于遗传密码的简并性，有多种不同的核酸序列可以编码本文公开的氨基酸序列。产生编码相同蛋白质的其他核酸序列在本领域普通技术人员的能力范围内，因此本发明涵盖因遗传密码子的简并性而编码相同氨基酸序列的核酸序列。例如，为了在目标宿主生物例如植物中实现异源基因的高表达，可以对所述基因采用宿主生物偏好的密码子进行优化，以使其更好地表达。
[0073]
在本发明中，“宿主生物”应理解为可以引入突变型蛋白编码核酸的任何单细胞或多细胞生物，包括例如细菌如大肠杆菌，真菌如酵母(例如酿酒酵母)、霉菌(例如曲霉菌)，植物细胞和植物等。
[0074]
术语“多核苷酸”和“核酸”可以互换使用，包括dna、rna或者其杂交体，可以是双链或单链的。术语“分离”，当提及核酸时，是指这样的核酸，所述核酸与其天然存在于其中的基因组的实质部分分开和/或与天然伴随该核酸的其他细胞组分基本上分离。例如，已经通过合成(如通过连续碱基缩合)而产生的任意核酸被认为是分离的。同样地，重组表达的核酸、克隆的核酸、通过引物延伸反应(例如pcr)产生的核酸或另外切离基因组的核酸也被认为是分离的。
[0075]
术语“对照”意指为比较目的而设计的实验对照。例如，转基因植物分析中的对照植物是与实验植物(即其待测试的植物)相同类型但不含实验植物的转基因插入片段、重组dna分子或dna构建体的植物。
[0076]
术语“重组”是指为遗传工程化的结果并且因此通常不会在自然界中发现并且通
过人为干预产生的非天然dna、多肽或蛋白质。“重组dna分子”是包含不天然存在的并且因此是人为干预的结果的dna序列的dna分子，例如编码工程化蛋白质的dna分子。另一个实例是由至少两个彼此异源的dna分子(如编码蛋白质的dna分子和可操作地连接的异源启动子)的组合组成的dna分子。“重组多肽”或“重组蛋白质”是包含不天然存在的氨基酸序列并且因此是人为干预的结果的多肽或蛋白质，例如工程化蛋白质。
[0077]
术语“转基因”是指作为人为干预(如通过植物转化方法)的结果人工并入生物体基因组中的dna分子。如本文所用，术语“转基因的”意指包含转基因，例如“转基因植物”是指在其基因组中包含转基因的植物，“转基因性状”是指由并入植物基因组中的转基因的存在传递或赋予的特征或表型。作为这种基因组改变的结果，所述转基因植物是与相关的野生型植物明显不同的植物，并且转基因性状是未在野生型植物中天然发现的性状。本发明的转基因植物包含通过本发明提供的重组dna分子和工程化蛋白质。
[0078]
术语“异源”是指源自不同来源且因此在自然界中通常不相关的两种或更多种物质之间的关系。例如，编码蛋白质的重组dna分子相对于可操作地连接的启动子是异源的，如果这种组合在自然界中通常不存在。此外，当特定重组dna分子不天然存在于所述特定细胞或生物体中时，其可相对于其所插入的细胞或生物体是异源的。
[0079]
术语“编码蛋白质的dna分子”或“编码多肽的dna分子”是指包含编码蛋白质或多肽的核苷酸序列的dna分子。“编码蛋白质的序列”或“编码多肽的序列”意指编码蛋白质或多肽的dna序列。“序列”意指核苷酸或氨基酸的顺序排列。编码蛋白质的序列或编码多肽的序列的边界通常由5'-末端的翻译起始密码子和3'-末端的翻译终止密码子决定。编码蛋白质的分子或编码多肽的分子可包含编码蛋白质或多肽序列的dna序列。如本文所用，“转基因表达”、“表达转基因”、“蛋白质表达”、“多肽表达”、“表达蛋白质”和“表达多肽”意指通过将dna分子转录成信使rna(mrna)并且将mrna翻译成多肽链(其可最终折叠成蛋白质)的过程产生蛋白质或多肽。编码蛋白质的dna分子或编码多肽的dna分子可以可操作地连接至dna构建体中的异源启动子，以用于在用重组dna分子转化的细胞中表达蛋白质或多肽。如本文所用，“可操作地连接”是指以使得一个dna分子可影响另一个dna分子的功能的方式连接的两个dna分子。可操作连接的dna分子可以是单个连续分子的一部分，并且可以是或可以不是相邻的。例如，启动子与dna构建体中的编码蛋白质的dna分子或编码多肽的dna分子可操作地连接，其中两个dna分子被排列成使得所述启动子可影响转基因的表达。
[0080]
术语“dna构建体”是包含两个或更多个异源dna序列的重组dna分子。dna构建体适用于转基因表达，并且可包含在载体和质粒中。dna构建体可出于转化(即将异源dna引入宿主细胞中)的目的用于载体中以便产生转基因植物和细胞，并且因此也可包含在转基因植物、种子、细胞或植物部分的质粒dna或基因组dna中。如本文所用，“载体”意指可用于植物转化目的的任何重组dna分子。如序列表中所示的重组dna分子可例如作为构建体的一部分插入载体中，所述构建体具有可操作地连接至启动子的重组dna分子，所述启动子在植物中起作用以驱动由所述重组dna分子编码的工程化蛋白质的表达。用于构建dna构建体和载体的方法是本领域中熟知的。dna构建体或包含dna构建体的载体的组分通常包括但不限于以下中的一种或多种：用于表达可操作地连接的dna的合适启动子、可操作地连接的编码蛋白质非人dna分子和3'非翻译区(3
’-
utr)。适用于实践本发明的启动子包括在植物中起作用以表达可操作地连接的多核苷酸的启动子。此类启动子是多种多样的且是本领域中熟知
的，并且包括诱导型的、病毒的、合成的、组成型、时间调控型的、空间调控型的和/或时空调控型的。另外的任选组分包括但不限于以下元件中的一个或多个：5'-utr、增强子、前导序列、顺式作用元件、内含子、叶绿体转运肽(ctp)和一个或多个选择性标记转基因。
[0081]
本发明的dna构建体可包含可操作地连接至本发明提供的编码蛋白质的dna分子的ctp分子。适用于实践本发明的ctp包括用于促进工程化蛋白分子在细胞内定位的那些。通过促进细胞内的蛋白质定位，ctp可增加工程化蛋白质的积累，保护其免受蛋白水解降解，增强除草剂耐受性水平，并且由此降低除草剂施加后的损伤水平。用于本发明的ctp分子是本领域中已知的，包括但不限于拟南芥epsps ctp(klee等人,1987)、矮牵牛epsps ctp(della-cioppa等人,1986)、玉米cab-m7信号序列(becker等人,1992；pct wo 97/41228)和豌豆谷胱甘肽还原酶信号序列(creissen等人,1991；pct wo 97/41228)。
[0082]
本发明的重组dna分子可通过本领域中已知的方法完全或部分地合成和修饰，特别是在期望提供适用于dna操作的序列(如限制性酶识别位点或重组-基因克隆位点)、植物优选序列(如植物密码子使用或kozak共有序列)或适用于dna构建体设计的序列(如间隔区或接头序列)的情况下。如本文所用，术语“百分比序列同一性”或“％序列同一性”是指在最佳比对两个序列时(在比较窗内具有总计少于参考序列的20％的适当核苷酸或氨基酸插入、缺失或空位)，与测试(“主题”)序列(或其互补链)相比，参考(“查询”)序列(或其互补链)的线性多核苷酸或多肽序列中的相同核苷酸或氨基酸的百分比。用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域的技术人员所熟知的并且可由以下工具实施：如smith和waterman的局部同源性算法、needleman和wunsch的同源性比对算法、pearson和lipman的相似性搜索方法，并且由这些算法的计算机化实现方式来实施，如使用默认参数的作为wisconsin(accelrys inc.,san diego,ca)、megalign(dnastar,inc.,1228s.park st.,madison,wis.53715)和muscle(3.6版)(rcedgar,nucleic acids research(2004)32(5):1792-1797)的一部分可获得的gap、bestfit、fasta和tfasta。测试序列和参考序列的比对片段的“同一性分数”是由两个比对序列共享的相同组分的数目除以参考序列片段中组分的总数，即整个参考序列或参考序列的较小限定部分。序列同一性百分比表示为同一性分数乘以100。一个或多个序列的比较可以是针对全长序列或其一部分，或针对更长的序列。
[0083]
在本发明中，“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，特别是单子叶或双子叶植物，例如：(1)粮食作物：稻属(oryza spp.)，例如稻(oryza sativa)、阔叶稻(oryza latifolia)、水稻(oryza sativa)、光稃稻(oryza glaberrima)；小麦属(triticum spp.)，例如普通小麦(triticum aestivum)、硬粒小麦(t.turgidumssp.durum)；大麦属(hordeum spp.)，例如大麦(hordeum vulgare)、亚利桑那大麦(hordeum arizonicum)；黑麦(secale cereale)；燕麦属(avena spp.)，例如燕麦(avena sativa)、野燕麦(avena fatua)、比赞燕麦(avena byzantina)、avena fatua var.sativa、杂种燕麦(avena hybrida)；稗属(echinochloa spp.)，例如，珍珠粟(pennisetum glaucum)、高粱(两色高粱(sorghum bicolor)、高粱(sorghum vulgare))、黑小麦、玉蜀黍或玉米、粟、稻(rice)、谷子、糜子、两色蜀黍(sorghum bicolor)、黍子、荞麦属(fagopyrum spp.)、黍(panicum miliaceum)、小米(setaria italica)、沼生菰(zizania palustris)、埃塞俄比亚画眉草(eragrostis tef)、稷(panicum miliaceum)、龙爪稷(eleusine coracana)；(2)豆类作物：大豆属(glycine spp.)，例如大豆(glycine max)、黄
豆(soja hispida)、soja max)、野豌豆属(vicia spp.)、豇豆属(vigna spp.)、豌豆属(pisum spp.)、芸豆(field bean)、羽扇豆属(lupinus spp.)、蚕豆属(vicia)、酸豆(tamarindus indica)、兵豆(lens culinaris)、山黧豆属(lathyrus spp.)、扁豆属(lablab)、蚕豆、绿豆、红豆、鹰嘴豆；(3)油料作物：花生(arachis hypogaea)、落花生属(arachis spp)、胡麻属(sesamum spp.)、向日葵属(helianthus spp.)(例如向日葵(helianthus annuus))、油棕属(elaeis)(例如油棕(eiaeis guineensis)、美洲油棕(elaeis oleifera))、大豆(soybean)、油菜(brassicanapus)、芸苔、芝麻、芥菜(brassicajuncea)、油菜籽油菜(oilseedrape)、油茶、油棕、油橄榄、蓖麻、欧洲油菜(brassica napus l.)、卡诺拉油菜(canola)；(4)纤维作物：剑麻(agave sisalana)、棉属(棉花、海岛棉(gossypium barbadense)、陆地棉(gossypium hirsutum))、红麻、剑麻、蕉麻、亚麻(linum usitatissimum)、黄麻、苎麻、大麻(cannabis sativa)、火麻；(5)水果类作物：枣属(ziziphus spp.)、香瓜属(cucumis spp.)、鸡蛋果(passiflora edulis)、葡萄属(vitis spp.)、越桔属(vaccinium spp.)、西洋梨(pyrus communis)、李属(prunus spp.)、番石榴属(psidium spp.)、石榴(punica granatum)、苹果属(malus spp.)、西瓜(citrullus lanatus)、柑桔属(citrus spp.)、无花果(ficus carica)、金桔属(fortunella spp.)、草莓属(fragaria spp.)、山楂属(crataegus spp.)、柿树属(diospyros spp.)、红仔果(eugenia unifora)、枇杷(eriobotrya japonica)、龙眼(dimocarpus longan)、番木瓜(carica papaya)、椰子属(cocos spp.)、阳桃(averrhoa carambola)、狲猴桃属(actinidia spp.)、扁桃(prunus amygdalus)、芭蕉属(musa spp.)(香蕉)、鳄梨属(persea spp.)(鳄梨(persea americana))、番石榴(psidium guajava)、曼密苹果(mammea americana)、芒果(mangifera indica)、橄榄(油橄榄(oleaeuropaea))、番木瓜(caricapapaya)、椰子(cocos nucifera)、凹缘金虎尾(malpighia emarginata)、人心果(manilkara zapota)、菠萝(ananas comosus)、番荔枝属(annona spp.)、柑桔树(柑桔属物种(citrus spp.))、波罗蜜属(artocarpus spp.)、荔枝(litchi chinensis)、茶藨子属(ribes spp.)、悬钩子属(rubus spp.)、梨、桃、杏、梅、杨梅、柠檬、金橘、榴莲、橙、草莓(straw berry)、蓝莓、哈密瓜、甜瓜、椰枣、胡桃树、樱桃树；(6)根茎类作物：木薯属(manihot spp.)、甘薯(ipomoea batatas)、芋(colocasia esculenta)、榨菜、洋葱、荸荠、油莎草、山药；(7)蔬菜类作物：菠菜属(spinacia spp.)、菜豆属(phaseolus spp.)、莴苣(lactuca sativa)、苦瓜属(momordica spp)、欧芹(petroselinum crispum)、辣椒属(capsicum spp.)、茄属(solanum spp.)(例如马铃薯(solanum tuberosum)、红茄(solanum integrifolium)或蕃茄(solanum lycopersicum))、蕃茄属(lycopersicon spp.)(例如西红柿(lycopersicon esculentum)、蕃茄(lycopersicon lycopersicum)、梨形蕃茄(lycopersicon pyriforme))、硬皮豆属(macrotyloma spp.)、无头甘蓝(kale)、棱角丝瓜(luffa acutangula)、小扁豆(lentil)、秋葵(okra)、洋葱(onion)、马铃薯(potato)、洋蓟(artichoke)、芦笋(asparagus)、西兰花(broccoli)、球芽甘蓝(brussels sprouts)、卷心菜(cabbage)、胡萝卜(carrot)、花椰菜(cauliflower)、芹菜(celery)、羽衣甘蓝(collard greens)、西葫芦(squash)、冬瓜(benincasa hispida)、石刁柏(asparagus officinalis)、旱芹(apium graveolens)、苋属(amaranthus spp.)、葱属(allium spp.)、秋葵属(abelmoschus spp.)、苦苣(cichorium endivia)、南瓜属(cucurbita spp.)、芫荽
(coriandrum sativum)、埃塞俄比亚芥(b.carinata)、萝卜(rapbanus sativus)、芸苔属(brassica)物种(例如例如欧洲油菜(brassica napus)、芜菁亚种(brassica rapa ssp.)、卡诺拉油菜(canola)、油籽油菜(oilseed rape)、芜菁油菜(turnip rape)、芥菜、甘蓝、黑芥、油菜籽油菜)、孢子甘蓝、茄科植物(茄子)、甜椒、黄瓜、丝瓜、白菜、油菜、甘蓝、葫芦、韭菜、莲、藕、生菜；(8)花卉作物：小金莲花(tropaeolum minus)、金莲花(tropaeolum majus)、美人蕉(canna indica)、仙人掌属(opuntia spp.)、万寿菊属(tagetes spp.)、兰花、文殊兰、君子兰、朱顶红、玫瑰、月季、茉莉花、郁金香、樱花、牵牛花、金盏花、荷花、雏菊、康乃馨、矮牵牛花、郁金香、百合、梅花、水仙、迎春、报春、瑞香、山茶、白玉兰、紫玉兰、琼花、君子兰、海棠、牡丹、芍药、丁香、杜鹃、西洋杜鹃、含笑、紫荆、棣棠、锦带花、连翘、云南黄馨、金雀花、仙客来、蝴蝶兰、石斛、风信子、鸢尾、马蹄莲、金盏菊、百枝莲、四季海棠、吊钟海棠、竹节海棠、天竺葵、绿萝；(9)药用作物：红花(carthamus tinctorius)、薄荷属(mentha spp.)、波叶大黄(rheum rhabarbarum)、番红花(crocus sativus)、枸杞、玉竹、黄精、知母、麦冬、贝母、郁金、砂仁、何首乌、大黄、甘草、黄芪、人参、三七、五加、当归、川芎、北柴胡、曼佗罗、洋金花、薄荷、益母草、藿香、黄芩、夏枯草、除虫菊、银杏、金鸡纳树、天然橡胶树、苜蓿、胡椒、板蓝根、白术；(10)原料作物：橡胶、蓖麻(ricinus communis)、油桐、桑、忽布、桦、桤木、漆树；(11)牧草作物：冰草属(agropyron spp.)、车轴草属(trifolium spp.)、芒(miscanthus sinensis)、狼尾草属(pennisetum sp.)、虉草(phalaris arundinacea)、柳枝稷(panicum virgatum)、草原草(prairiegrasses)、印度草(indiangrass)、大须芒草(big bluestem grass)、梯牧草(phleum pratense)、草皮草(turf)、莎草科(高山嵩草、脚苔草(carex pediformis)、低苔草)、苜蓿、梯牧草、紫花苜蓿、草木犀、紫云英、柽麻、田菁、红萍、水葫芦、紫穗槐、羽扇豆、三叶草、沙打旺、水浮莲、水花生、黑麦草；(12)糖料作物：甘蔗(甘蔗属物种(saccharum spp.))、甜菜(beta vulgaris)；(13)饮料作物：大叶茶(camellia sinensis)、茶(camellia sinensis)、茶树(tea)、咖啡(咖啡属物种(coffea spp.))、可可树(theobroma cacao)、蛇麻花(啤酒花)；(14)草坪植物：固沙草(ammophila arenaria)、早熟禾属(poa spp.)(草地早熟禾(poa pratensis)(蓝草))、剪股颖属物种(agrostis spp.)(剪股颖、匍匐剪股颖(agrostis palustris))、黑麦草属物种(lolium spp.)(黑麦草)、羊茅属物种(festuca spp.)(羊茅)、结缕草属物种(zoysia spp.)(结缕草(zoysiajaponica))、狗牙根属物种(cynodon spp.)(百慕大草、狗牙根)、侧钝叶草(stenotaphrum secunda tum)(圣奥古斯丁草)、雀稗属物种(paspalum spp.)(巴哈草)、假俭草(eremochloa ophiuroides)(百足草)、地毯草属物种(axonopus spp.)(地毯草)、指形垂穗草(bouteloua dactyloides)(野牛草)、垂穗草属变种物种(bouteloua var.spp.)(格兰马草)、马唐(digitariasanguinalis)、香附子(cyperusrotundus)、短叶水蜈蚣(kyllingabrevifolia)、阿穆尔莎草(cyperusamuricus)、加拿大飞蓬(erigeroncanadensis)、天胡荽(hydrocotylesibthorpioides)、鸡眼草(kummerowiastriata)、地锦(euphorbiahumifusa)、耕地堇菜(violaarvensis)、白颖苔草、异穗苔草、草皮草(turf)；(15)树木作物：松属(pinus spp.)、柳属(salix sp.)、槭树属(acer spp.)、木槿属(hibiscus spp.)、桉属(eucalyptus sp.)、银杏(ginkgo biloba)、箣竹属(bambusa sp.)、杨属(populus spp.)、牧豆树属(prosopis spp.)、栎属(quercus spp.)、刺葵属(phoenix spp.)、山毛榉属(fagus spp.)、吉贝(ceiba pentandra)、樟属
(cinnamomum spp.)、黄麻属(corchorus sp.)、南方芦苇(phragmites australis)、酸浆属(physalis spp.)、山蚂蝗属(desmodium spp.)、杨、常春藤、白杨、珊瑚树、银杏、栎类、臭椿、木荷、冬青、悬铃木、女贞、大叶黄扬、落叶松、黑荆树、马尾松、思茅松，云南松、南亚松、油松、红松、黑胡桃、柠檬、悬铃木、蒲桃、珙桐、木棉、爪哇木棉、洋紫荆、羊蹄甲、雨树、合欢、龙牙花、刺桐、广玉兰、苏铁、紫薇、针叶树、乔木、灌木；(16)坚果作物：巴西栗(bertholletia excelsea)、栗属(castanea spp.)、榛属(corylus spp.)、山核桃属(carya spp.)、核桃属(juglans spp.)、阿月浑子(pistacia vera)、腰果(anacardium occidentale)、澳洲坚果(全缘叶澳洲坚果(macadamia integrifolia))、碧根果、夏威夷果、开心果、巴旦木以及产生坚果的植物；(17)其他：拟南芥、臂形草、蒺藜草、大狗尾草、牛筋草、cadaba farinosa、藻类(algae)、carex elata、观赏植物、大果假虎刺(carissa macrocarpa)、菜蓟属(cynara spp.)、野胡萝卜(daucus carota)、薯蓣属(dioscorea spp.)、蔗茅属(erianthus sp.)、苇状羊茅(festuca arundinacea)、萱草(hemerocallis fulva)、百脉根属(lotus spp.)、luzula sylvatica、紫苜蓿(medicago sativa)、草木樨属(melilotus spp.)、黑桑(morus nigra)、烟草属(nicotiana spp.)、木犀榄属(olea spp.)、鸟足豆属(ornithopus spp.)、欧防风(pastinaca sativa)、接骨木属(sambucus spp.)、白芥属(sinapis sp.)、蒲桃属(syzygium spp.)、鸭茅状摩擦禾(tripsacum dactyloides)、triticosecale rimpaui、香堇(viola odorata)等。
[0084]
在本发明中，术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。
[0085]
在本发明中，“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。
[0086]
本发明的转基因植物、子代、种子、植物细胞和植物部分还可含有一种或多种另外的转基因性状。可通过使含有包含本发明提供的重组dna分子的转基因的植物与含有另外的转基因性状的另一种植物杂交来引入另外的转基因性状。如本文所用，“杂交”意指培育两种单独的植物以产生子代植物。因此，两种转基因植物可杂交以产生含有转基因性状的子代。如本文所用，“子代”意指亲本植物的任何传代的后代，并且转基因子代包含由本发明提供并且从至少一种亲本植物遗传的dna构建体。或者，可通过用包含本发明提供的重组dna分子的dna构建体共转化所述另外的转基因性状的dna构建体(例如，其中所有的dna构建体呈现为用于植物转化的同一载体的部分)或通过将另外的性状插入包含本发明提供的dna构建体的转基因植物中或反之亦然(例如，通过使用关于转基因植物或植物细胞的植物转化的任何方法)来引入另外的转基因性状。此类另外的转基因性状包括但不限于增加的昆虫抗性、增加的水利用效率、增加的产量性能、增加的抗旱性、增加的种子质量、改进的营养品质、杂交种种子生产和除草剂耐受性，其中性状是相对于野生型植物或对照植物测量的。此类另外的转基因性状是本领域的技术人员已知的；例如，美国农业部(usda)动物和植物健康检查局(aphis)提供了此类性状的列表，并且可在它们的网站www.aphis.usda.gov上找到。
[0087]
含有本发明提供的转基因性状的转基因植物和子代可与本领域中通常已知的任何培育方法一起使用。在包含两种或更多种转基因性状的植物系中，转基因性状可在包含
no.143、seq id no.145、seq id no.147、seq id no.149、seq id no.151。
[0097]
其编码基因序列经植物密码子编好性优化后分别是seq id no.2、seq id no.4、seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.12、seq id no.14、seq id no.16、seq id no.18、seq id no.20、seq id no.22、seq id no.24、seq id no.26、seq id no.28、seq id no.30、seq id no.32、seq id no.34、seq id no.36、seq id no.38、seq id no.40、seq id no.42、seq id no.44、seq id no.46、seq id no.48、seq id no.50、seq id no.52、seq id no.54、seq id no.56、seq id no.58、seq id no.60、seq id no.62、seq id no.64、seq id no.66、seq id no.68、seq id no.70、seq id no.72、seq id no.74、seq id no.76、seq id no.78、seq id no.80、seq id no.82、seq id no.84、seq id no.86、seq id no.88、seq id no.90、seq id no.92、seq id no.94、seq id no.96、seq id no.98、seq id no.100、seq id no.102、seq id no.104、seq id no.106、seq id no.108、seq id no.110、seq id no.112、seq id no.114、seq id no.116、seq id no.118、seq id no.120、seq id no.122、seq id no.124、seq id no.126、seq id no.128、seq id no.130、seq id no.132、seq id no.134、seq id no.136、seq id no.138、seq id no.140、seq id no.142、seq id no.144、seq id no.146、seq id no.148、seq id no.150、seq id no.152。
[0098]
3.侯选基因合成
[0099]
计划用pet15b作为骨架载体在大肠杆菌里表达后筛选。在pet15b ndei/bamhi位点处酶切开环后用infusion技术克隆。因此，在上述侯选基因序列的5’端和3’端分别加上5
’-
gccgcgcggcagccat-3’和5
’-
tgttagcagccggatcc-3’接头序列后在南京金斯瑞人工合成。
[0100]
实施例2：aad12基因大肠杆菌过表达、纯化和显色反应体系构建
[0101]
aad12是美国陶氏益农(dow agrosciences llc)发现的激素类除草剂降解基因，并转化到玉米、大豆等作物配合激素类除草剂进行商业化应用(t.r.wright et al.,robust crop resistance to broadleaf and grass herbicides provided by aryloxyalkanoate dioxygenase transgenes.proc.natl.acad.sci.u.s.a.107,20240
–
20245(2010))。aad12能够降解2,4-d和s-手性的吡啶羧酸类除草剂，产生2,4-二氯苯酚和类似物质，这些物质显现红色。以aad12作为模式基因建立显色反应体系，为大规模筛选激素类除草剂基因创立筛选工具。
[0102]
1.载体构建
[0103]
aad12全长有293个氨基酸，分子量31.7kda，等电点6.45，其序列来自陶氏益农发表的专利(us10167483-0004)。经植物密码子优化并分别在其5’端和3’端分别加上5
’-
gccgcgcggcagccat-3’和5
’-
tgttagcagccggatcc-3’接头序列后在南京金斯瑞人工合成。用infusion克隆技术将合成的dna在ndei/bamhi位点克隆到pet15b骨架中形成大肠杆菌表达载体pet15b-aad12。
[0104]
2.蛋白表达和纯化
[0105]
根据文献报道(fukomori and flausinger,purification and characterization of 2,4-dichlorophenoxyacetate/alpha-ketoglutarate dioxygenase journal of biological chemistry(1993)268(32):24311-24317)，将构建好的表达载体pet15b-aad12转入大肠杆菌bl21(de3)中，经iptg诱导表达，收菌裂解后利用
ni-nta柱进行纯化，sds-page检测蛋白纯化效果。
[0106]
3.酶活性测试
[0107]
由于aad-12催化底物反应后，生成酚类产物，可以利用4-氨基安替比林和铁氰化钾与产物在碱性环境下显色，生成红色产物，且在510nm有吸收，直接用酶标仪读取相关参数。
[0108]
4.用2,4-d等激素类除草剂为底物颜色筛选体系构建
[0109]
在用2,4-d为底物测试了aad12蛋白活性基础上，进一步测试菌内转化2,4-d的方法，构建高通量的颜色反应筛选体系，用于筛选对2,4-d等激素类除草剂有降解活性的基因。
[0110]
待测质粒的转化，将aad12表达质粒和空白对照质粒pet15b，分别转化到bl21(de3)蛋白表达大肠杆菌菌株中。挑取单克隆，接种于有3ml lb培养基的10ml离心管后在37℃，200rpm培养6-8小时，向培养液中加入0.1mm iptg和2mmα-酮戊二酸，再加入0.5mm 2,4-d。转到28℃继续培养过夜。第二天早上，吸取各菌液200ul离心沉淀菌体，取上清180ul到96孔酶标板中，加入ph10硼酸缓冲液20ul，然后加入2ul 8％铁氰化钾混匀后，加入2ul 2％4-氨基安替比林混匀后室温放置5min，观察颜色和检测a510。
[0111]
酶活测定结果显示，2,4-d在有aad12表达的实验组与空白载体对照组比较，实验组反应液变红。这表明实验组反应液有酚类产物生成，大肠杆菌表达的aad12具有催化活性。利用酶标仪对a510进行测定，同样可以检测到实验组较对照组吸收值明显升高。
[0112]
除对2,4-d测试外，还对另一个苯氧乙酸除草剂二甲四氯，以及2,4-d异辛酯和2,4-d丁酸进行了测试，结果表明，表达的aad-12酶对这些底物都有降解活性，见表1。利用hplc对各实验组与空白对照组中除草剂底物含量进行检测，发现加入酶催化反应后，各底物含量明显降低，证明各底物被降解。
[0113]
表1.光度法测定aad-12降解苯氧乙酸类除草剂活性
[0114][0115]
直接向aad12表达菌培养液里加2,4-d，菌液也显现红色，如图1所示。这说明可以通过在培养基中添加底物的培养方法，实现菌内降解显色，以此判断候选基因产物是否降解2,4-d。这套菌内降解显色筛选体系可以提高检测通量，对多个aad基因表达菌进行快速筛选。
[0116]
实施例3：利用建成的菌内降解显色反应体系对aad类基因进行筛选
[0117]
利用与aad12菌体内转化2,4-d为酚的颜色反应筛选方法，通过对76个aad基因进行筛选，在这些表达aag基因的重组大肠杆菌菌液里加2,4-d继续培养显色，检测到44个重组大肠杆菌菌液显现红色，说明这44个基因编码的aad类似酶对2,4-d具有催化活性(表2)。
[0118]
进一步测试了其中30个能够降解2,4-d的aad基因表达菌(见图2-1，编号d42、d43、d44、d45、d46、d47、d48、d49、d50、d30、d72、d73、d74、d75、d76和d58；见图2-2，编号d21、d51、d52、d53、d54、d55、d56、d57、d62，d＝qyd)菌内降解其它激素类除草剂化合物(二甲四氯、2,4-d丁酸、麦草畏、氯氟吡氧乙酸、绿草定)和属于accase抑制剂除草剂的精喹禾灵。另外，d26、d32、d33、d34和d35也显现红色反应。结果显示，这些酶除降解2,4-d外，还降解二甲四氯；其中d42、d43、d46、d47、d48、d30、d72、d73、d74、d76和d58(d＝qyd)对绿草定显示微弱降解；对其余的都不降解。
[0119]
表2. 76个aad类似基因激素类除草剂抗性鉴定总结
[0120]
[0121]
[0122][0123]
实施例4：转aad基因拟南芥创制和抗性测试
[0124]
1.转基因拟南芥过表达载体构建
[0125]
如图3所示，以pqy259为骨架载体，ncoi/bsteii为克隆位点，将这些在大肠杆菌过表达后表现菌内降解2,4-d的aad基因，克隆到骨架载体pqy259中产生一系列拟南芥过表达载体。在拟南芥中的表达由其atubi10拟南芥泛素启动子和mas(mannopine synthase)终止子调控。筛选标记是潮霉素抗性基因(hygr＝hpt)。
[0126]
2.拟南芥的遗传转化
[0127]
农杆菌侵染液的制备：挑取活化的农杆菌(gv3101)单克隆接种于30ml yep液体培养基【酵母粉10g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl 5g/l，25mg/l利福平(rifampicin)和50mg/l卡那霉素(karamycin)】中，28℃200rmp/min振荡培养过夜至od600值为1.0-1.5左右后，用6000rmp/min离心10min收集菌体，弃上清。用拟南芥侵染液(蔗糖50g/l,silwet l-77 300μl/l,无须调节ph)重新悬浮菌体至od600＝0.8左右备用。
[0128]
拟南芥蘸花遗传转化：拟南芥植株转化之前注意植株是否生长良好，花序盛，无胁迫反应，第一次转化在株高20cm左右进行。若土壤干燥可适当浇一些水。转化前一天用剪刀将已长出的角果剪去。将待转化植株花序浸泡于上述农杆菌菌液中30秒到1分钟，期间轻轻搅动，浸润后的植株上应该有一层液膜。将转化完成后的植株放于黑暗环境中暗培养24小时，然后取出放于正常光照环境下生长。一周以后即可按同样的方法进行第二次转化。
[0129]
待种子成熟后即可进行收获，收获后置于30℃烘箱一周左右烘干种子。
[0130]
3.t1代转基因植株与抗药性植株的筛选
[0131]
种子经过消毒液处理5min，用无菌水洗5遍后一部分铺于ms转基因筛选培养基(含30μg/ml潮霉素、100μg/ml羧苄青霉素)筛选转基因苗，同时另一部分铺于ms加药培养基【含250μg/ml头孢噻肟钠(cefotaxime sodium)、0.3μm 2,4-d】筛选除草剂抗性幼苗。将铺好种子的培养皿放于4℃春化处理3天，取出后放于光照培养箱培养(温度22℃，16小时光照，8小时黑暗，光照强度100—150μmol/m2/s，湿度75％)。一周之后可观察到野生型对照幼苗的根均未伸长，生长受到抑制，而转基因幼苗根生长正常，表现出耐药性。拍照并将转基因阳性幼苗与除草剂抗性幼苗移栽至装有土壤的小花盆中培养。
[0132]
结果(图4-1)显示，野生型拟南芥col-0(columbia-0)在含有2,4-d(0.3μmol)的平板上，不能长根。转基因拟南芥中，pqy2312(表达qyd45,seq id no.89)；pqy2309(表达qyd42,seq id no.83)；pqy2310(表达qyd43,seq id no.85)；pqy2311(表达qyd44,seq id no.87)；pqy2313(表达qyd46,seq id no.91)；pqy2314(表达qyd47,seq id no.93)；pqy2315(表达qyd48,seq id no.95)；pqy2316(表达qyd49,seq id no.97)；pqy2318(表达qyd51,seq id no.101)；pqy2319(表达qyd52,seq id no.103)；pqy2320(表达qyd53,seq id no.105)；pqy2322(表达qyd55,seq id no.109)；pqy2323(表达qyd56,seq id no.111)；pqy2324(表达qyd57,seq id no.113)，转化的拟南芥t1代苗，有少数个体长出了种子根，表现出对2,4-d的耐受性。另外，转基因t1代种子，也用分别含有2,4-d丁酸钠(0.7μmol)和二甲四氯(0.1μmol)的平板进行抗药性筛选(图4-2、4-3)。结果与2,4-d筛选相似，其中，pqy2312(表达qyd45,seq id no.89)转化的t1代苗对2,4-d抗性较弱，但对二甲四氯的抗性明显，有长根明显的植株。
[0133]
将这些长出正常根的转基因拟南芥移栽到装有土壤的盆钵中继续培养，收获t2代种子进一步鉴定。
[0134]
4.t2代转基因植株抗药性测试
[0135]
t2代过表达aad基因的九个载体pqy2309、pqy2310、pqy2311、pqy2312、pqy2313、pqy2314、pqy2315、pqy2316和pqy2317的转基因株系，在平板培养基上进一步测试其对2,4-d、2,4-d丁酸钠和二甲四氯除草剂的抗性。每个转化体测试两个事件。由于经过t1代抗性筛选，t2代大多数植株都表现抗性，尤其是pqy2312对2,4-d丁酸钠和二甲四氯的抗性表现明显，如图5-1、图5-2和图5-3所示。
[0136]
选择代表性的四个转化体pqy2309、pqy2310、pqy2311和pqy2313的t2代苗进一步喷雾测试。来自每个载体转化所产生的t2代中随机选择4个株系，待拟南芥种子发芽、移栽和幼苗长至5-7叶时，分别叶面喷施2,4-d(100g/ha)、二甲四氯(100g/ha)和2,4-d丁酸钠(100g/ha)。非转基因的野生型col-0作为阴性对照。喷施10天后评价抗性水平。结果发现，所有转基因拟南芥t2代幼苗均没有发生明显药害，非转基因野生型拟南芥全部死亡或几乎
and high throughput transgenic production[j].transgenic research,2020,29(968))。将含有过表达载体pqy2330的农杆菌(eha105)单克隆接种至5ml yep液体培养基(含25mg/l利福平(rifampicin)和50mg/l卡那霉素(karamycin))，28℃220rmp/min振荡培养8小时，转移0.2-0.3ml菌液至200ml yep液体培养基(含25mg/l利福平(rifampicin)和50mg/l卡那霉素(karamycin))中28℃220rmp/min过夜培养至菌达到指数增长期，4000rmp/min离心20min收集菌体至50ml离心管(灭菌)，弃上清，用侵染培养基(b5盐，b5维生素，30g/l蔗糖，1.67mg/l bap，0.25ml/l赤霉素，3.9g/l mes和200μm乙酰丁香酮，ph 5.0)悬浮菌体沉淀至od600＝0.6。大豆种子用氯气消毒，然后将种子保存在层流罩中的无盖容器中驱散多余的氯气。在培养皿中用无菌水浸泡灭菌种子，24℃黑暗处理16小时。用10号手术刀沿种子种脐纵向将大豆种子切成两半，每一半包含一半胚与子叶，胚轴远端部分被切除，大约一半至三分之一胚轴仍附着在子叶节端。将具有部分胚轴的种子外植体浸入侵染液中30分钟，然后移至含有b5盐和维生素的共培养培养基上，用滤纸覆盖，温度24℃，光周期为18小时光照6小时黑暗，光强度为80
–
90μmol/m2/s共培养5天。5天后，外植体用液体诱导培养基(含b5盐、b5维生素、1.11mg/l bap、30g/l蔗糖、28mg/l硫酸亚铁、38mg/l na2edta、0.6g/l mes、50mg/l卡那霉素、200mg/l头孢噻肟和100mg/l特美汀，ph 5.7)冲洗。将外植体转移至诱导培养基上(含7g/l琼脂)，子叶曲面朝下，子叶节端嵌入培养基中。培养2周后，再转移到筛选培养基(含6mg/l草铵膦)培养2周，从外植体基部切取子叶，并将含有胚轴的水平“芽垫”移入继代培养基(含ms盐、30g/l蔗糖、28mg/l硫酸亚铁、0.6g/l mes、38mg/l na2edta、0.1mg/l iaa、1mg/l玉米素核糖苷、0.5mg/l ga3、50mg/l天冬酰胺、100mg/l焦谷氨酸、50mg/l卡那、200mg/l头孢噻肟、50mg/l特美汀、6mg/l草铵膦、7g/l琼脂，ph 5.7)中，每2周继代一次。将芽基部切除浸入1mg/l吲哚3-丁酸中浸泡1-3分钟以促进生根。随后转移至生根培养基(含ms盐、b5维生素、20g/l蔗糖、28mg/l硫酸亚铁、0.59g/l mes、38mg/l na2edta、100mg/l焦谷氨酸、50mg/l天冬酰胺、7g/l琼脂，ph 5.6)持续1-2周，然后将生根的嫩枝移栽土壤对幼苗进行驯化，最后移栽温室。在t0代苗培育过程中，用草铵膦(150mg/l)涂抹叶片进一步鉴定是否转基因。
[0145]
实施例8：转基因大豆2,4-d抗性测试
[0146]
得到t1代种子并经基因型鉴定和草铵膦涂抹鉴定确认转基因后，对t1苗进行喷药测试，在大豆苗高大约20cm时叶面喷施2,4-d(4.48kg/ha)，非转基因受体亲本作为阴性对照。喷施10天后评价抗性水平。结果发现，非转基因受体亲本全部死亡，而转基因大豆(pqy2330)没有发生药害，未见任何生长抑制，如图8-2所示。
[0147]
说明书中提及的所有出版物和专利申请均通过引用并入本文，如同每篇出版物或专利申请被单独、特别地通过引用并入本文一样。
[0148]
尽管为清楚理解起见，前述发明已通过举例说明和实施例的方式较为详细地进行了描述，但显而易见的是，可以在所附权利要求书的范围内实施某些改变和修改，这样的改变和修改均在本发明的范围之内。