一种提高烟叶烟碱含量的NtJAZ1基因突变体及其应用的制作方法

一种提高烟叶烟碱含量的ntjaz1基因突变体及其应用
技术领域
1.本发明涉及遗传工程技术领域，更具体地，涉及一种提高烟叶烟碱含量的ntjaz1基因突变体及其应用。


背景技术：

2.烟碱是栽培烟草烟叶中重要的特征性化合物，是烟草植株所持有的一种生物碱，占烟草总生物碱的95％左右。
3.随着国内低焦油卷烟及细支烟市场的迅速发展，烟草工业对高烟碱含量烟叶的需求进一步增强。过去的研究表明：ntjaz1基因是烟碱合成调控中的负调控因子。而我们通过进一步的应用实践，发现来源于ntjaz1基因的其中一个突变体株系能够显著提高烟草烟叶中烟碱含量。
4.目前，国际上一些烟草公司及研究机构正致力于利用生物技术手段提高烟草烟碱含量，以提高烟草品质，降低烟碱原料生产成本。我国也深入开展烟碱合成调控的分子机理研究，为培育高烟碱烟草品种提供基因资源，具有十分重要的技术意义。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。
6.本发明主要目的在于获得提高烟叶烟碱含量的ntjaz1基因突变体，定位出该ntjaz1基因突变体的突变位点。在此基础上，提供提高烟叶烟碱含量的ntjaz1基因突变体的应用，用于提高烟草植株的烟叶烟碱含量。
7.为此，本发明的第一个目的在于，提供一种提高烟叶烟碱含量的ntjaz1基因突变体，所述提高烟叶烟碱含量的ntjaz1基因突变体的核苷酸序列如seq id no：3所示，与核苷酸序列为seq id no：1所示的ntjaz1基因相比，所述提高烟叶烟碱含量的ntjaz1基因突变体具有c.383c>t突变，使该基因编码蛋白质序列第128位氨基酸由苏氨酸thr转变成异亮氨酸ile。
8.本发明中，采用本领域通用表示法表示突变；c.383c>t突变表示ntjaz1基因cds383位的c突变为t，造成苏氨酸转变成异亮氨酸。该突变在现有技术中并未被提到，更没有任何关于该突变能提高云烟87烟草植株烟叶烟碱含量的报道；且发明人发现，该突变能够显著提高烟草烟叶中烟碱含量。
9.进一步地，所述提高烟叶烟碱含量的ntjaz1基因突变体编码的氨基酸序列如seq id no.4所示。
10.本发明的第二个目的在于，ntjaz1基因突变体应用于提高烟叶烟碱的含量，所述提高烟叶烟碱含量的ntjaz1基因突变体在获得烟叶烟碱含量提高的烟草植株中的应用。
11.本发明的第三个目的在于，本发明还提供一种ntjaz1基因突变体的制备方法，该制备方法包括ems诱变烟草种子和tilling筛选烟草突变体；
12.ems诱变烟草种子：
13.(1)：利用漂白水处理烟草种子，然后旋转离心并滤干；
14.(2)：将步骤(1)漂白后滤干的种子进行漂洗，清除漂白水，使种子不受漂白剂化学成分影响，然后进行旋转离心滤干；
15.(3)：将步骤(2)中得到的清除漂白水后旋转离心滤干种子放在温度为10℃～30℃的去离子水中浸泡10～15小时，催芽萌发，以利种子均匀诱变处理，然后进行旋转离心滤干；
16.(4)：将步骤(3)中得到的去离子水中浸泡后滤干的种子放在0.5％ems(甲基磺酸乙酯)诱变剂溶液中浸泡处理10～15个小时，然后进行旋转离心滤干；
17.(5)：将步骤(4)中得到的诱变剂溶液中浸泡处理后滤干的种子放在漂洗剂溶液中漂洗，再用去离子水冲洗，反复进行5～8次，然后使用布氏漏斗滤纸过滤干燥，得诱变处理后的m1代烟草种子。
18.tilling筛选核苷酸变化的突变体：
19.(6)：将步骤(5)中得到的诱变处理后的m1代烟草种子播种于大田，单株套袋自交收种获得m2代，每个m1代单株收获的m2代种子播种1粒种子，得到多株m2代突变体单株；
20.(7)：取步骤(6)中得到的多株m2代突变体单株叶片，利用qiagen dna提取试剂盒提取叶片dna，得到多个样品；
21.(8)：样品浓度测定及建池：将多个样品按照顺序大小排列，分别取2ul dna样品在16通道tecan infinite m200仪器上进行浓度测定；将所有的样品浓度稀释至40ng/ul，制作8倍dna池用于tilling分析。
22.(9):利用primer3设计ntjaz1基因tilling分析引物，
23.jaz1till
‑
f：acaggaaaccaaacaactacaact；
24.和jaz1till
‑
r：atagcagaagcttagtgtactggg，扩增长度为700bp左右。
25.(10):tilling分析m2代突变体，筛选核苷酸突变的单株，并进行测序验证，获得一个m3代突变体，其cds 383位的c突变为t，造成苏氨酸转变成异亮氨酸。
26.(11):步骤(10)中获得的m3代突变体植株连续自交形成纯合突变体株系。
27.(12):对步骤(11)中得到的纯合突变体株系进行烟碱含量测定，具体为在烟株旺长期，取烟株中部叶片，杀青烘干，检测烟碱含量。
28.(13):含有突变序列的烟草株系相比含有seq id no:1序列的烟草叶片烟碱含量提高40％左右。
29.本发明的有益效果是：
30.1、本发明通过系统研究，首次提出了一种提高烟叶烟碱含量的ntjaz1基因突变体，本发明提出的提高烟叶烟碱含量的ntjaz1基因突变体植株，烟叶中烟碱含量比对照提高约40％，使烟叶的烟碱含量显著提高。
31.2、本发明通过系统研究，利用tilling技术筛选核苷酸变化的突变体，获得ntjaz1基因cds区383位的c突变为t，造成苏氨酸转变成异亮氨酸的突变体，该突变体使烟叶的烟碱含量显著提高，降低了烟碱原料生产成本。
附图说明
32.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得
明显和容易理解，其中：
33.图1为突变体突变位点测序峰图。
34.图2为本发明ntjaz1突变体株系j11与对照云烟87叶片烟碱含量对比示意图。
具体实施方式
35.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
36.实施例1，本发明的第一方面，本发明提供了一种提高烟叶烟碱含量的ntjaz1基因突变体。根据本发明的实施例，提高烟叶烟碱含量的ntjaz1基因突变体的核苷酸序列如seq id no：3所示，与核苷酸序列为seq id no：1所示的ntjaz1基因相比，所述提高烟叶烟碱含量的ntjaz1基因突变体具有c.383c>t突变，使该基因编码蛋白质序列第128位氨基酸由苏氨酸thr转变成异亮氨酸ile。
37.以云烟87为例，野生型的ntjaz1基因的cdna序列如下所示：
[0038][0039]
本发明的发生c.383c>t突变的ntjaz1基因突变体，在上述野生型云烟87序列的加框示出处由碱基c突变为t。该位点的单核苷酸改变将导致ntjaz1基因第128位氨基酸由苏氨酸thr转变成异亮氨酸ile。
[0040]
发明人发现，该突变体与烟草植株的烟叶烟碱含量密切相关，从而利用该突变体，获得烟叶烟碱含量高的烟草株系；根据本发明的实施例，该突变体的核酸为培育高烟碱烟草品种提供基因资源，降低烟碱原料生产成本。
[0041]
本技术中的基因序列包括dna形式或rna形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
[0042]
进一步地，所述提高烟叶烟碱含量的ntjaz1基因突变体编码的氨基酸序列如seq id no.4所示。其中，野生型云烟87ntjaz1基因cdna编码氨基酸序列如下：
[0043][0044]
发生氨基酸突变的ntjaz1基因突变体在上述野生型序列的加框示出处由苏氨酸thr转变成异亮氨酸ile。
[0045]
通过对比发现，与seq id no.1相比，本发明的ntjaz1基因突变体的cdna具有c.383c>t突变，进而，其编码产物与野生型ntjaz1的氨基酸序列相比，该基因编码蛋白质序列第128位氨基酸由苏氨酸thr转变成异亮氨酸ile。综上，存在c.383c>t突变可改变ntjaz1的功能。
[0046]
实施例2，请参考图1，根据本发明的第二方面，提出了ntjaz1突变体的制备方法,具体制备方法包括以下步骤：
[0047]
1、烟草种子ems诱变
[0048]
(1)、选用40％漂白水处理云烟87种子6分钟，离心滤干，待用；
[0049]
(2)、将步骤(1)中漂白处理后的云烟87种子利用去离子水对种子进行漂洗1分钟，离心滤干去除漂白水成分；
[0050]
(3)、在室温条件下，去离子水浸泡步骤(2)中得到的去除漂白水成分并滤干的烟草种子10
‑
12小时，离心滤干；
[0051]
(4)、在室温条件下，0.5％ems(甲基磺酸乙酯)处理步骤(3)中得到的烟草种子12小时，离心滤干；
[0052]
(5)、将步骤(4)中得到的烟草种子加入去离子水漂洗1分钟，离心滤干，重复漂洗8次；然后使用布氏漏斗滤纸过滤干燥，得到诱变处理后的m1代种子。
[0053]
2、tilling筛选核苷酸变化的突变体。通过分析ntjaz1基因，我们筛选云烟87ems突变体库，获得一个ntjaz1基因突变的植株；
[0054]
(6)、将步骤(5)中得到的诱变处理后的m1代种子播种于大田，单株套袋自交收种获得m2代，每个m1代单株收获的m2代种子播种1粒种子，共获得1842个m2代单株。
[0055]
(7)、取骤(6)中得到的m2代突变体单株叶片作为样品，进行dna基因组提取；
[0056]
具体步骤为：将样品用液氮研磨，并用1.5ml离心管收取；在离心管中加入400ul的ap1溶液，4ul的rna酶混匀；把具有上述样品的离心管放入65℃水浴锅水浴10min，期间摇匀3次；加入130ul p3溶液，冰浴5mim；13200rpm高速离心5min，取上层液倒入紫色过滤柱，13200rpm离心2min；将滤液转入新的1.5ml离心管并加入675ul aw1溶液混匀；把混匀样品溶液分2次转入淡黄色过滤柱，10000rpm离心1min，弃除滤液；把淡黄色过滤柱放入新的2ml离心管中并加入500ul aw2溶液，10000rpm离心1min，弃滤液(此步骤重复两次)；继续将淡黄色过滤柱进行空转(10000rpm，1min)，随后放入新的1.5ml离心管中加入50ul ae溶液，静置5min，10000rpm离心1min，收集过滤液，所收集到的滤液即为基因组dna，将收集到的滤液放入4℃冰箱保存。
[0057]
(8)、样品浓度测定及建池
[0058]
分别取2ul dna基因组的滤液样品在16通道tecan infinite m200仪器上进行浓
度测定。将已知浓度的所有滤液样品分别将浓度稀释至40ng/ul，构成8倍dna池。
[0059]
(9)、tilling分析m2代突变体：
[0060]
利用primer3设计ntjaz1基因tilling分析引物，设计的扩增用引物序列如下：
[0061]
jaz1till
‑
f：acaggaaaccaaacaactacaact(seq id no.5)
[0062]
和jaz1till
‑
r：atagcagaagcttagtgtactggg(seq id no.6)
[0063]
(10)、以步骤(8)中所构成8倍dna池为模板，利用步骤(9)中所设计引物，进行pcr扩增，扩增产物即为ntjaz1的700bp长度的基因组片段；扩增产物通过毛细管电泳进行分析；
[0064]
上述扩增体系为：1.0μl 10
×
buffer，0.8μl dntp(2.5mm)，0.16μl jaz1till
‑
fprimer(10μm)，0.16μl jaz1till
‑
r primer(10um)，6.78μl h2o，1.0μl dna模板(20ng/ul)。反应程序为95℃3min，94℃30s，58℃30s，72℃30s，30个循环，72℃10min，4℃保存。
[0065]
(11)、通过步骤(10)分析后，筛选出核苷酸突变的单株，进行测序验证，获得一个m2代突变体，m2代突变体ntjaz1基因cds 383位的c突变为t，造成苏氨酸转变成异亮氨酸，获得m3代突变体。
[0066]
(12)在m3代突变体中经过测序筛选突变位点纯合的植株，自交收种。随后继续进行连续自交，形成烟草株系j11，突变位点序列如图1所示。
[0067]
实施例3，请参考图2，本发明的另一方面在于提高烟叶烟碱含量的ntjaz1基因突变体在获得烟叶烟碱含量提高的烟草植株中的应用。
[0068]
具体为：
[0069]
(1)对突变体株系进行田间试验，即，在田间种植突变体株系及对照野生型云烟87，在烟株旺长期，取烟株中部叶片，杀青烘干；利用yc/t383
‑
2010的方法检测烟叶烟碱含量。
[0070]
(2)如图2所示，经对烟叶烟碱含量进行检测，含有突变序列的烟草株系j11的烟碱相比含有seq id no:1序列的云烟87烟草植株叶片烟碱含量提高40％左右。
[0071]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0072]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。