用于过载层析柱的再生的方法与流程

用于过载层析柱的再生的方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术主张于2019年6月5日提出申请的美国临时申请号62/857,734的优先权益，该临时申请以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
3.本发明提供用于层析的方法。


背景技术：

4.已证实过载(ol)阳离子交换层析具有与结合和洗脱模式等效的杂质去除能力，同时加强制程以改良树脂利用率和设备效率。树脂在强结合条件下加载超过树脂动态结合容量。杂质优先结合于树脂，同时收集穿透的产物。归因于高加载密度(典型地》500g/l)，较高浓度的宿主细胞蛋白质保持结合于树脂。因此，柱在纯化制程的消毒阶段(0.5n氢氧化钠)期间结垢(高柱压力，》80psi)(图1)。需要使消毒阶段的压力增加减至最少并且在层析运行之间没有杂质遗留的改良制程。
5.过载层析的方法描述于美国专利申请公开号us 2013/0079272a1和us 2014/0301977a1中，其中的每一者均以全文引用的方式并入本文中。
6.本文引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)皆以全文引用的方式并入。


技术实现要素：

7.在一些方面，本发明提供用于清洁离子交换层析材料(例如阳离子交换层析材料)供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；b)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及c)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，再生缓冲液包含约50至约600mm乙酸钠(naoac)。在一些实施例中，再生缓冲液包含约350mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 4.0至11。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 8.3。在一些实施例中，使约3至约12倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约2至约12倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过使再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约1至5倍材料体积的储存缓冲液中。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中。
8.在一些方面，本发明提供一种用于清洁离子交换层析材料供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；b)使酸洗液穿过离子交换层析材料，c)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh和约1m nacl；以及d)将
离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，再生缓冲液和第二再生缓冲液包含约25至约600mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约350mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约40mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 2.0至7.0。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 4.0。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 5.0。在一些实施例中，使约3至约12倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约7倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，酸洗液为约167m naoac和约0.3m磷酸。在一些实施例中，使约1至约5倍材料体积的酸洗液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约3倍材料体积的酸洗液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约2至约12倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约4倍材料体积的消毒缓冲液穿过使再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约1至5倍材料体积的储存缓冲液中。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约3倍材料体积的储存缓冲液中。
9.在一些方面，本发明提供用于清洁离子交换层析材料(例如阳离子交换层析材料)供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含tris和乙酸钠；b)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及c)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，再生缓冲液包含约25至约75mm tris和约50至约100mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约50mm tris和约85mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 7至9。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 8.0。在一些实施例中，使约3至约12倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约2至约12倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过使再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约1至5倍材料体积的储存缓冲液中。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中。
10.在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料(例如阳离子交换层析材料)自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约20mm至约60mm乙酸钠。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约40mm乙酸钠。在一些实施例中，平衡缓冲液的ph为约ph 5.0至约ph 6.0。在一些实施例中，平衡缓冲液的ph为约ph 5.5。在一些实施例中，将离子交换层析材料用约3-7倍材料体积的平衡缓冲液洗涤。在一些实施例中，将离子交换层析材料用约5倍材料体积的平衡缓冲液洗涤。在一些实施例中，再生缓冲液包含约50至约600mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约350mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 4.0至11。在一些实施例中，再生缓冲液的
ph为约ph 8.3。在一些实施例中，使约3至约12倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约2至约12倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过使再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约1至5倍材料体积的储存缓冲液中。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中。
11.在一些方面，本发明提供一种用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度超过离子交换层析对该多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；f)使酸洗液穿过离子交换层析材料，g)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh和约1m nacl；以及h)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，加载密度≤约1000g/l。在一些实施例中，加载密度≥约20g/l。在一些实施例中，加载密度≥约70g/l。在一些实施例中，加载密度为离子交换层析材料对该多肽的动态结合容量的至少约2倍。在一些实施例中，加载密度为离子交换层析材料对该多肽的动态结合容量的约2倍至约100倍。在一些实施例中，加载密度为离子交换层析材料对该多肽的动态结合容量的约10倍。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约50mm至约100mm naoac和约25mm至约75mm tris。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约85mm乙酸钠和约50mm tris。在一些实施例中，平衡缓冲液的ph为约ph 6.0至约ph 10.0。在一些实施例中，平衡缓冲液的ph为约ph 8.0。在一些实施例中，将离子交换层析材料用约5至约15倍材料体积的平衡缓冲液洗涤。在一些实施例中，将离子交换层析材料用约10倍材料体积的平衡缓冲液洗涤。在一些实施例中，再生缓冲液包含约25至约600mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约350mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约40mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 2.0至7.0。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 4.0。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 5.0。在一些实施例中，使约3至约12倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约7倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，酸洗液为约167m naoac和约0.3m磷酸。在一些实施例中，使约1至约5倍材料体积的酸洗液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约3倍材料体积的酸洗液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约2至约12倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约4倍材料体积的消毒缓冲液穿过使再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约1至5倍材料体积的储存缓冲液中。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约3倍材料体积的储存缓冲液中。
12.在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含tris和乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过离
子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。
13.在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≥20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。
14.在一些实施例中，加载密度≥70g/l。在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≥20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含tris和乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。
15.在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度超过离子交换层析对该多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，加载密度为离子交换层析材料对该多肽的动态结合容量的至少约2倍。在一些实施例中，加载密度为离子交换层析材料对该多肽的动态结合容量的约2倍至约100倍。在一些实施例中，加载密度为离子交换层析材料对该多肽的动态结合容量的约10倍。
16.在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度超过离子交换层析对该多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含tris和乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。
17.在以上方面的一些实施例中，平衡缓冲液包含约20mm至约60mm乙酸钠。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约40mm乙酸钠。在一些实施例中，平衡缓冲液的ph为约ph 5.0至约ph 6.0。在一些实施例中，平衡缓冲液的ph为约ph 5.5。在一些实施例中，将离子交换层析材料用约3-7倍材料体积的平衡缓冲液洗涤。在一些实施例中，将离子交换层析材料用约5倍材料体积的平衡缓冲液洗涤。在一些实施例中，再生缓冲液包含约25至约75mm tris和约50至约100mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约50mm tris和约85mm naoac。在一
些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 7至9。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph8.0。在一些实施例中，使约3至约12倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约2至约12倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过使再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约1至5倍材料体积的储存缓冲液中。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中。
18.在本发明的一些实施例中，离子交换层析材料在层析柱中。在一些实施例中，离子交换层析材料为阳离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料包含连接至支持物基质的磺丙基部分。在一些实施例中，支持物基质包含交联聚(苯乙烯二乙烯基苯)。在一些实施例中，离子交换层析材料为poros
tm hs50材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为混合模式阳离子交换材料。在一些实施例中，混合模式阳离子交换材料为capto mmc
tm 、capto mmc
tm impres、nuvia
tm cprime
tm 或toyopearl mx trp-650m。
19.在本发明的一些实施例中，离子交换层析材料为阴离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料包含连接至支持物基质的伯胺、仲胺、叔胺或季铵离子官能团、聚胺官能团或二乙氨基乙基官能团。在一些实施例中，离子交换层析材料为混合模式阴离子交换材料。在一些实施例中，混合模式阴离子交换材料为capto adhere
tm 或capto adhere
tm impres。
20.在本发明的一些实施例中，离子交换层析材料用于大规模制备多肽。在一些实施例中，多肽为抗体、免疫粘附素、含fc蛋白质或免疫缀合物。在一些实施例中，多肽为抗体。在一些实施例中，抗体为单克隆抗体。在一些实施例中，单克隆抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一些实施例中，单克隆抗体为igg单克隆抗体。在一些实施例中，抗体为抗原结合片段。在一些实施例中，抗原结合片段为fab片段、fab’片段、f(ab’)2片段、scfv、二scfv、双scfv、串联(二、三)-scfv、fv、sdab、三功能抗体、bite、双体抗体或三体抗体。在一些实施例中，抗体为双特异性抗体。在一些实施例中，抗体选自由以下项组成的组：抗cd20抗体、抗cd40抗体、抗her2抗体、抗il6抗体、抗ige抗体、抗il13抗体、抗flu a抗体、抗tigit抗体、抗pd-l1抗体、抗vegf-a抗体、抗vegf-a/ang2抗体、抗cd79b抗体、抗st2抗体、抗因子d抗体、抗因子ix抗体、抗因子x抗体、抗aβ抗体、抗tau抗体、抗cea抗体、抗cea/cd3抗体、抗cd20/cd3抗体、抗fcrh5/cd3抗体、抗her2/cd3抗体、抗fgfr1/klb抗体、fap-4-1bbl融合蛋白和fap-il2v融合蛋白。在一些实施例中，抗体选自由以下项组成的组：奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、托珠单抗(tocilizumab)、法立昔单抗(faricimab)、泊洛妥珠单抗(polatuzumab)、甘特珠单抗(gantenerumab)、赛必妥单抗(cibisatamab)、克瑞珠单抗(crenezumab)、莫苏尼妥珠单抗(mosunetuzumab)、替瑞利尤单抗(tiragolumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、奥滨尤妥珠单抗(obinutuzumab)、兰帕珠单抗(lampalizumab)、来金珠单抗(lebrikizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)兰尼单抗(ranibizumab)、艾美赛珠单抗(emicizumab)、塞鲁单抗(selicrelumab)、普拉辛珠单抗(prasinezumab)、ro6874281和ro7122290。
21.在本发明的一些实施例中，在穿过离子交换层析材料之前将多肽使用亲和层析材
料纯化，其中离子交换层析材料为阳离子交换层析材料。在一些实施例中，亲和材料选自由以下项组成的组：蛋白质a层析、蛋白质g层析、蛋白质a/g层析、蛋白质l层析、fcxl层析、蛋白质xl层析、κ层析和κxl层析。在一些实施例中，蛋白质a亲和材料为mabselect材料、mabselect sure
tm 材料或mabselect sure
tm lx材料。在一些实施例中，使缓冲液以约15-20倍材料体积/小时穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使再生缓冲液以约10倍材料体积/小时穿过离子交换层析材料。
22.在本发明的一些实施例中，多肽在宿主细胞中产生。在一些实施例中，宿主细胞为中国仓鼠卵巢(cho)细胞。在一些实施例中，杂质包含igg片段、宿主细胞蛋白质或宿主细胞核酸中的一或多者。在一些实施例中，多肽在cho细胞中产生并且杂质包含cho宿主细胞蛋白质(chop)和/或cho核酸。
附图说明
23.图1是在不存在再生阶段的情况下过载层析运行的层析图。在消毒阶段开始时在压力尖峰期间观测到树脂的结垢。
24.图2示出抗体mab1的过载层析的poros
tm 50hs层析图的实例。
25.图3示出两种评估运行的再生阶段的尺寸排阻层析(sec)的层析图。用于评估运行1的再生缓冲液为50mm tris、85mm naoac ph 8.0。用于评估运行2的再生缓冲液为350mm naoac ph 8.3。
26.图4示出用于抗体mab1的评估运行a的层析图。
27.图5示出用于抗体mab1的评估运行b的层析图。
28.图6示出用于抗体mab2的评估运行a的层析图。
29.图7示出用于抗体mab2的评估运行b的层析图。
30.图8a和8b示出poros
tm 50hs模拟运行清洁程序的sec-hplc层析图。在图8a中再生缓冲液的顺序为1.)50mm tris、85mm naoac ph8.0，随后2.)350mm naoac ph 8.3。在图8b中再生缓冲液的顺序为1.)350mm naoac ph 8.3，随后2.)50mm tris、85mm naoac ph 8.0。
31.图9示出capto
tm adhere树脂上的机器人杂质定位筛选。示出mab3、中国仓鼠卵巢细胞蛋白质(chop)和高分子量(hmw)多肽的结合。
32.图10a-10e分别示出用于mab3的评估运行a至e的层析图。
具体实施方式
33.本文提供用于清洁离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；b)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料；以及c)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。在一些方面，本发明提供用于清洁离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含tris和乙酸钠；b)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料；以及c)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
34.本文提供用于清洁阳离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，
其中再生缓冲液包含乙酸钠；b)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料；以及c)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。在一些方面，本发明提供用于清洁阳离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含tris和乙酸钠；b)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料；以及c)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
35.本文提供用于清洁阴离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；b)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料；以及c)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。在一些方面，本发明提供用于清洁阴离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含tris和乙酸钠；b)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料；以及c)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
36.在一些方面，本发明提供一种用于清洁离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；b)使酸洗液穿过离子交换层析材料，c)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh和约1m nacl；以及d)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1nnaoh。在一些实施例中，离子交换材料为阴离子交换材料。在一些实施例中，离子交换材料为混合模式阴离子交换材料。
37.在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料；以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。在一些方面，本发明提供一种用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含tris和乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料；g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
38.在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料；以及g)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。在一些方面，本发明提供一种用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡
阳离子交换层析材料；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含tris和乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料；g)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
39.在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料；以及g)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。在一些方面，本发明提供一种用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含tris和乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料；g)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
40.在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≥20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料；以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。在一些方面，本发明提供一种用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≥20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含tris和乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料；g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
41.在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度≥20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料；以及g)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。在一些方面，本发明提供一种用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度≥20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含tris和乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过阳离子交换
层析材料；g)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
42.在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度≥20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料；以及g)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。在一些方面，本发明提供一种用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度≥20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含tris和乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料；g)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
43.在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度超过离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料；以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。在一些方面，本发明提供一种用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度超过离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含tris和乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料；g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
44.在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度超过阳离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料；以及g)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。在一些方面，本发明提供一种用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度超过阳离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含tris和乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料；g)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
45.在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度超过阴离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料；以及g)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。在一些方面，本发明提供一种用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度超过阴离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含tris和乙酸钠；f)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料；g)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
46.在一些方面，本发明提供一种用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度超过离子交换层析对该多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；f)使酸洗液穿过离子交换层析材料，g)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh和约1m nacl；以及h)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，离子交换层析材料为阳离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为阴离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为混合模式阴离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为capto
tm adhere层析材料。
47.在本发明的一些实施例中，离子交换层析(例如阳离子交换层析)用于大规模制备多肽。在一些实施例中，多肽为抗体；例如单克隆抗体。
48.定义
49.术语“多肽”或“蛋白质”在本文中可互换地用于指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可为直链或具支链的，其可包含经修饰氨基酸，并且其可由非氨基酸间隔开。这些术语还涵盖已天然地或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记组分结合。该定义内还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽，以及本技术领域中已知的其他修饰。如本文所用的术语“多肽”和“蛋白质”特定而言涵盖抗体。
[0050]“经纯化”的多肽(例如抗体或免疫粘附素)意指多肽纯度已增加，使得其以比其存在于其天然环境和/或当最初在实验室条件下合成和/或扩增时更纯的形式存在。纯度为相对术语并且不一定意指绝对纯度。
[0051]
如本文所用，“过载层析”指加载的目标产物超过层析材料对产物的动态结合容量的层析程序。杂质比产物结合得更强，从而在蛋白质穿透之后得到经纯化产物洗脱物。在一些实例中，在达到动态结合容量之后在流通物(flow through)中的级分中收集目标产物。
[0052]
如本文所用，层析材料的“材料体积”为用于层析程序的层析材料的总体积。例如，当层析材料在柱中时，材料体积为柱中的层析材料的总体积。在此实例中，“材料体积”还可称为“柱体积”。
[0053]“结合”目标抗原(例如肿瘤相关多肽抗原靶标)的多肽为以充足的亲和力结合抗原使得多肽在靶向表达抗原的细胞或组织时适合作为诊断和/或治疗剂并且不显著地与其他多肽交叉反应的多肽。在此类实施例中，如通过荧光活化细胞分选(facs)分析或放射免疫沉淀(ria)所测定，多肽与“非靶标”多肽结合的程度将小于多肽与其特定目标多肽的结合的约10％。
[0054]
关于多肽与目标分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合于”特定多肽或特定多肽靶标上的抗原决定基或“对特定多肽或特定多肽靶标上的抗原决定基具特异性”意指结合可测量地不同于非特异性相互作用。特异性结合可例如通过测定与对照分子的结合相比的分子结合来测量，该对照分子通常为具有类似结构并且不具有结合活性的分子。例如，特异性结合可通过与类似于靶标的对照分子(例如过量的非标记靶标)竞争来测定。在此情况下，若经标记靶标与探针的结合受到过量未标记靶标的竞争性抑制，则指示特异性结合。
[0055]
术语“抗体”在本文中以广义使用并且特定地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要这些抗体片段展现所需生物活性即可。术语“免疫球蛋白”(ig)在本文中与抗体可互换使用。
[0056]
抗体为天然存在的免疫球蛋白分子，其具有变化的结构，全部基于免疫球蛋白折叠。例如，igg抗体具有以二硫键键结的两条“重”链和两条“轻”链以形成功能性抗体。各重链和轻链本身包含“恒定”(c)和“可变”(v)区。v区决定抗体的抗原结合特异性，而c区提供结构支撑以及在与免疫效应子的非抗原特异性相互作用中的功能。抗体或抗体的抗原结合片段的抗原结合特异性为抗体特异性结合于特定抗原的能力。
[0057]
抗体的抗原结合特异性由v区的结构特征决定。变异性在可变结构域的110-氨基酸跨度内不均匀地分布。反而，v区由被称为“高变区”并且各自长9-12个氨基酸的具有极端变异性的较短区域隔开的称为构架区(fr)且具有15-30个氨基酸的相对不变的延伸段组成。天然重链和轻链的可变结构域各自包含主要采用β-折叠构形的四个fr，其由三个高变区(“hvr”)连接，该三个高变区形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。各链中的高变区通过fr并且与来自其他链的高变区紧密地结合在一起，促使形成抗体的抗原结合位点(参见kabat等人,sequences of proteins of immunological interest,第5版.public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现各种效应子功能，诸如使抗体参与抗体依赖性细胞毒性(adcc)。
[0058]
各v区典型地包含三个高变区，例如互补决定区(“cdr”)，其各自含有“高变环”和四个构架区。因此，抗体结合位点(以相当大亲和力结合于特定所需抗原所需的最小结构单位)将典型地包括三个cdr以及其间散布的至少三个、优选四个构架区以保持和呈现呈适当构象的cdr。经典四链抗体具有由vh和v
l
结构域合作确定的抗原结合位点。某些抗体(诸如骆驼和鲨鱼抗体)缺乏轻链并且依赖于仅由重链形成的结合位点。可制备单结构域工程化免疫球蛋白，其中结合位点由单独重链或轻链形成，vh与v
l
之间不存在合作。
[0059]
术语“可变”指可变结构域的某些部分在序列方面在抗体间不完全不同并且用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性中的事实。然而，变异性在抗体的可变结构域中不均匀分布。其在轻链与重链可变结构域中集中于称为高变区的三个区段中。可变结构域的更高度保守部分称为构架区(fr)。天然重链和轻链的可变结构域各包含主要采用β-折叠构形的四个fr，其由三个高变区连接，该三个高变区形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。各链中的高变区通过fr并且与来自其他链的高变区紧密地结合在一起，促使形成抗体的抗原结合位点(参见kabat等人,sequences of proteins of immunological interest,第5版.public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现各种效应子功能，诸如使抗体参与抗体依赖性细胞毒性(adcc)。
[0060]
术语“高变区”当在本文中使用时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区可包含来自“互补决定区”或“cdr”的氨基酸残基(例如v
l
中围绕约残基24-34(l1)、50-56(l2)和89-97(l3)，以及vh中围绕约31-35b(h1)、50-65(h2)和95-102(h3)(kabat等人,sequences of proteins of immunological interest,第5版.public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如v
l
中的残基26-32(l1)、50-52(l2)和91-96(l3)，以及vh中的26-32(h1)、52a-55(h2)和96-101(h3)(chothia和lesk j.mol.biol.196:901-917(1987))。
[0061]“构架”或“fr”残基为除如本文所定义的高变区残基外的那些可变结构域残基。
[0062]“抗体片段”包含完整抗体之一部分，优选包含其抗原结合区。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段；双体抗体；串联双体抗体(tadb)、三体抗体、线性抗体(例如美国专利号5,641,870，实例2；zapata等人,protein eng.8(10):1057-1062(1995))；单臂抗体、单可变结构域抗体、微型抗体、单链抗体分子；由抗体片段(例如包括但不限于db-fc、tadb-fc、tadb-ch3、(scfv)4-fc、sc-fv、二scfv、双scfv或串联(二、三)-scfv)形成的多特异性抗体；双特异性t细胞衔接器(bite)以及三功能抗体。
[0063]
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“fab”片段，各自具有单一抗原结合位点；以及剩余的“fc”片段，其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生f(ab')2片段，其具有两个抗原结合位点并且仍能够交联抗原。
[0064]“fv”为含有完全抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。此区域由紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体组成。正是在此构形中，各可变结构域的三个高变区相互作用以限定v
h-v
l
二聚体的表面上的抗原结合位点。总起来说，六个高变区赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使单一可变结构域(或仅包含三个对抗原具特异性的高变区的一半fv)也具有识别和结合抗原的能力，不过与整个结合位点相比亲和力较低。
[0065]
fab片段还含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(ch1)。fab'片段因在重链ch1结构域的羧基端添加包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸在内的几个残基而不同于fab片段。fab'-sh为本文中针对其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有至少一个游离硫醇基的fab'的命名。f(ab')2抗体片段最初作为两者之间具有铰链半胱氨酸的fab'片段对而产生。抗体片段的其他化学偶合也是已知的。
[0066]
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”均可基于其恒定结构域的氨基酸序列分配至两种明显不同的类型(称为κ和λ)中的一者中。
[0067]
视其重链的恒定结构域的氨基酸序列而定，抗体可分配至不同类别中。存在五大类别完整抗体：iga、igd、ige、igg和igm，并且其中若干可进一步划分成诸多个子类(同型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga和iga2。对应于不同类别的抗体的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的次单元结构和三维构形为熟知的。
[0068]“单链fv”或“scfv”抗体片段包含抗体的vh和v
l
结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一些实施例中，fv多肽在vh与v
l
结构域之间进一步包含多肽连接子，该多肽连接子使scfv能够形成抗原结合所需的结构。关于scfv的综述参见pl
ü
ckthun,the pharmacology of monoclonal antibodies,第113卷,rosenburg和moore编,springer-verlag,new york,第269-315页(1994)。
[0069]
术语“双体抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段包含相同多肽链(v
h-v
l
)中连接至轻链可变结构域(v
l
)的重链可变结构域(vh)。通过使用太短而不允许相同链上的两个结构域之间配对的连接子，结构域被迫与另一链的互补结构域配对并且形成两个抗原结合位点。双体抗体更充分地描述于例如ep 404,097；wo 93/11161；和hollinger等人,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993)中。
[0070]
术语“多特异性抗体”以广义使用并且特定地涵盖具有多抗原决定基特异性的抗体。此类多特异性抗体包括但不限于包含重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(v
l
)并且其中v
hvl
单元具有多抗原决定基特异性的抗体、具有两个或更多个v
l
和vh结构域并且各v
hvl
单元结合于不同抗原决定基的抗体、具有两个或更多个单一可变结构域并且各单一可变结构域结合于不同抗原决定基的抗体、全长抗体、抗体片段(诸如fab、fv、dsfv、scfv)、双体抗体、双特异性双体抗体、三体抗体、三功能抗体、已共价或非共价连接的抗体片段。“多抗原决定基特异性”指特异性结合于相同或不同靶标上的两种或更多种不同抗原决定基的能力。“单特异性”指仅结合一种抗原决定基的能力。根据一个实施例，多特异性抗体为以5μm至0.001pm、3μm至0.001pm、1μm至0.001pm、0.5μm至0.001pm或0.1μm至0.001pm的亲和力结合于各抗原决定基的igg抗体。
[0071]
表述“单结构域抗体”(sdab)或“单可变结构域(svd)抗体”通常指单一可变结构域(vh或vl)可赋予抗原结合的抗体。换句话说，单一可变结构域不需要为识别靶标抗原与另一可变结构域相互作用。单结构域抗体的实例包括衍生自骆驼(美洲驼和骆驼)和软骨鱼(例如铰口鲨)的那些单结构域抗体以及来自人和小鼠抗体的衍生自重组方法的那些单结构域抗体((nature(1989)341:544-546；dev comp immunol(2006)30:43-56；trend biochem sci(2001)26:230-235；trends biotechnol(2003):21:484-490；wo 2005/035572；wo 03/035694；febs lett(1994)339:285-290；wo00/29004；wo 02/051870)。
[0072]
如本文所用的术语“单克隆抗体”指获自基本上均质抗体的群体(亦即构成群体的个别抗体为相同的和/或结合相同抗原决定基)的抗体，除了在单克隆抗体的制备期间可产生的可能的变体，此类变体通常以微小量存在。与典型地包括针对不同决定位(抗原决定基)的不同抗体的多克隆抗体制剂相比，各单克隆抗体针对抗原上的单一决定位。除其特异性之外，单克隆抗体也是有利的，因为其未由其他免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”指示抗体的特征为获自基本上均质的抗体群体，并且不应被视为需要通过任何特定方法来产生抗体。例如，要根据本文所提供的方法使用的单克隆抗体可通过kohler等人,nature 256:495(1975)首先描述的杂交瘤方法来制备，或可通过重组dna方法制备(参见例如美国专利号4,
816,567)。“单克隆抗体”还可使用例如clackson等人,nature 352:624-628(1991)和marks等人,j.mol.biol.222:581-597(1991)中所描述的技术自噬菌体抗体文库分离。
[0073]
本文中的单克隆抗体特定地包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与抗体中衍生自特定物种或属于特定抗体类别或子类的对应序列相同或同源，而链的其余部分与抗体中衍生自另一物种或属于另一抗体类别或子类的对应序列相同或同源；以及此类抗体的片段，只要其展现所需生物活性即可(美国专利号4,816,567；morrison等人,proc.natl.acad.sci.usa 81:6851-6855(1984))。本文中的目标嵌合抗体包括包含衍生自非人灵长类动物(例如旧大陆猴，诸如狒狒、恒河猴或食蟹猴)的可变结构域抗原结合序列和人恒定区序列(美国专利号5,693,780)的“灵长类化”抗体。
[0074]
非人(例如鼠类)抗体的“人源化”形式为含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体为人免疫球蛋白(接受者抗体)，其中接受者的高变区的残基由具有所需特异性、亲和力的能力的非人物种(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)(供给者抗体)的高变区的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(fr)残基由对应非人残基置换。此外，人源化抗体可包含在接受者抗体中或供给者抗体中未发现的残基。进行此类修饰以进一步改进抗体效能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个并且典型地两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环并且全部或基本上全部fr为人免疫球蛋白序列的fr，除了如上文所提及的fr取代。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(典型地人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。其他细节参见jones等人,nature 321:522-525(1986)；riechmann等人,nature 332:323-329(1988)；以及presta,curr.op.struct.biol.2:593-596(1992)。
[0075]
出于本文的目的，“完整抗体”为包含重可变结构域和轻可变结构域以及fc区的抗体。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。优选地，完整抗体具有一种或多种效应子功能。
[0076]“天然抗体”通常为由两条相同轻(l)链和两条相同重(h)链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。各轻链通过一个共价二硫键连接至重链，同时在不同免疫球蛋白同型的重链间二硫键的数目不同。各重链和轻链还具有有规律地间隔开的链内二硫桥。各重链在一端具有可变结构域(vh)，随后为许多恒定结构域。各轻链在一端具有可变结构域(v
l
)并且在另一端具有恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。认为特定氨基酸残基形成轻链与重链可变结构域之间的界面。
[0077]“裸抗体”为不结合至异源分子(诸如细胞毒性部分或放射性标记)的抗体(如本文所定义)。
[0078]
在一些实施例中，抗体“效应子功能”指可归因于抗体的fc区(天然序列fc区或氨基酸序列变体fc区)的那些生物活性，并且随抗体同型而变化。抗体效应子功能的实例包括：c1q结合和补体依赖性细胞毒性；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；噬菌作用；细胞表面受体的下调。
[0079]“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“adcc”指细胞介导的反应，其中表达fc受体(fcr)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶标细胞上结合的抗体并且随后引起靶标细胞的溶解。用于介导adcc的原代细胞nk细胞仅
表达fcγriii，而单核细胞表达fcγri、fcγrii和fcγriii。造血细胞上的fcr表达概述于ravetch和kinet,annu.rev.immunol 9:457-92(1991)第464页的表3中。为评估目标分子的adcc活性，可进行体外adcc分析，诸如描述于美国专利号5,500,362或5,821,337中的体外adcc分析。适用于此类分析的效应细胞包括外周血单核细胞(pbmc)和自然杀伤(nk)细胞。可替代地或另外地，可例如在动物模型，诸如clynes等人,proc.natl.acad.sci.(usa)95:652-656(1998)中所公开的动物模型中在体内评估相关分子的adcc活性。
[0080]“人效应细胞”为表达一或多个fcr并且执行效应子功能的白细胞。在一些实施例中，细胞至少表达fcγriii并且执行adcc效应子功能。介导adcc的人白细胞的示例包括外周血单核细胞(pbmc)、自然杀伤(nk)细胞、单核细胞、细胞毒性t细胞和嗜中性粒细胞；并且pbmc和nk细胞为优选的。
[0081]
术语“fc受体”或“fcr”用于描述结合于抗体的fc区的受体。在一些实施例中，fcr为天然序列人fcr。此外，优选fcr为结合igg抗体(γ受体)的fcr并且包括fcγri、fcγrii和fcγriii子类的受体，包括等位基因变体和这些受体的替代剪接形式。fcγrii受体包括fcγriia(“活化受体”)和fcγriib(“抑制受体”)，其具有类似氨基酸序列，这些氨基酸序列主要在其胞质结构域中不同。活化受体fcγriia在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸基活化基序(itam)。抑制受体fcγriib在其胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸基抑制基序(itim)。(参见annu.rev.immunol.15:203-234(1997))。fcr综述于ravetch和kinet,annu.rev.immunol 9:457-92(1991)；capel等人,immunomethods 4:25-34(1994)；以及de haas等人,j.lab.clin.med.126:330-41(1995)中。本文中的术语“fcr”涵盖其他fcr，包括将来要鉴定的那些fcr。该术语还包括新生儿受体fcrn，其负责母体igg转移至胎儿(guyer等人,j.immunol.117:587(1976)和kim等人,j.immunol.24:249(1994))。
[0082]
如本文关于层析所用的术语“依序”指使第一层析随后为第二层析。在第一层析与第二层析之间可包括其他步骤。
[0083]
如本文关于层析所用的术语“连续”指使第一层析材料与第二层析材料直接连接或允许两种层析材料之间连续流动的另外一些机制。
[0084]
如本文所用的术语“分离的”指分子已与典型地在自然界中与其一起存在或一起产生的至少一些组分分离。例如，当多肽与产生它的细胞的至少一些组分分离时，将该多肽称为“分离的”多肽。在多肽表达之后由细胞分泌的情况下，以物理方式将含有该多肽的上清液与产生它的细胞分离被视为“分离”该多肽。类似地，当多核苷酸不为其典型地在自然界中发现的更大多核苷酸(诸如在dna多核苷酸的情况下为基因组dna或线粒体dna)的一部分，或与产生它的细胞的至少一些组分分离(例如在rna多核苷酸的情况下)时，将该多核苷酸称为“分离的”多核苷酸。因此，宿主细胞内部的载体中所含的dna多核苷酸可称为“分离的”dna多核苷酸。
[0085]“污染物”指不同于所需多肽产物的材料。污染物包括但不限于：宿主细胞材料，诸如cho宿主细胞蛋白质(chop)；浸出蛋白质a；核酸；所需多肽的变体、片段、聚集物或衍生物；另一多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基组分等。在一些实例中，污染物可为来自例如但不限于细菌细胞(诸如大肠杆菌(e.coli)细胞)、昆虫细胞、原核细胞、真核细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、真菌细胞的宿主细胞蛋白质(hcp)。
[0086]
在本文中提及“约”为一值或参数包括(并且描述)关于该值或参数本身的变化。例
如，提及“约x”的描述包括“x”的描述。
[0087]
除非上下文另外明确指示，否则如本文和随附权利要求书中所用，单数形式“一(种/个)”、“或”和“该”包括复数指示物。应了解，本文所描述的本发明的方面和变化形式包括“由方面和变化形式组成”和/或“基本上由方面和变化形式组成”。
[0088]
层析清洁的方法
[0089]
层析
[0090]
本发明提供用于清洁或再生离子交换层析材料以供再使用的方法，其中离子交换层析以过载模式使用。在一些实施例中，层析材料用于大规模纯化多肽；例如制造规模制备多肽，诸如抗体或其片段。在一些实施例中，离子交换层析材料为阳离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为阴离子交换层析材料。
[0091]
在一些方面，本发明提供用于清洁离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠(naoac)；b)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料；以及c)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。在一些实施例中，离子交换层析材料为阳离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为阴离子交换层析材料。
[0092]
在一些实施例中，再生缓冲液包含约50至约600mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含浓度范围为约50mm至600mm、100mm至600mm、150mm至600mm、200mm至600mm、250mm至600mm、300mm至600mm、350mm至600mm、400mm至600mm、450mm至600mm、500mm至600mm、550mm至600mm、50mm至550mm、50mm至450mm、50mm至400mm、50mm至350mm、50mm至300mm、50mm至250mm、50mm至200mm、50mm至150mm、50mm至100mm、100mm至550mm、150mm至500mm、200mm至450mm、250mm至400mm或300mm至400mm中的任一者的naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600或650mm中的任一者的naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约350mm naoac。
[0093]
在一些实施例中，再生缓冲液包含浓度范围为约70mm至100mm、75mm至95mm或80mm至90mm中的任一者的naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含85mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含浓度范围为约70mm至100mm、75mm至95mm或80mm至90mm中的任一者的naoac并且进一步包含tris。在一些实施例中，再生缓冲液包含浓度范围为约70mm至100mm、75mm至95mm或80mm至90mm中的任一者的naoac并且进一步包含约25mm至75mm、30mm至75mm、35mm至40mm、45mm至75mm、50mm至75mm、25mm至70mm、25mm至65mm、25mm至60mm、25mm至55mm或25mm至50mm中的任一者的tris。在一些实施例中，再生缓冲液包含浓度范围为约70mm至100mm、75mm至95mm或80mm至90mm中的任一者的naoac并且进一步包含约25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm或75mm中的任一者的tris。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 4.0至约ph 11.0。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 4.0至约ph 10.5、约ph 4.0至约ph10.0、约ph 4.0至约ph 9.5、约ph 4.0至约ph 9.0、约ph 4.0至约ph8.5、约ph 4.0至约ph 8.0、约ph 5.5至约ph 11.0、约ph 5.5至约ph 10.5、约ph 5.5至约ph 10.0、约ph 5.5至约ph 9.5、约ph 5.5至约ph 9.0、约ph 5.5至约ph 8.5、约ph 5.5至约ph 8.0、约ph 6.0至约ph 11.0、约ph 6.5至约ph 11.0、约ph 7.0至约p h 11.0、约ph 7.5至约ph 11.0、约ph 8.0至约ph 11.0、约ph 6.0至约ph 11.0、约ph 6.5至约ph 10.5、约ph 7.0至约ph 10.0、约ph 7.5至约ph 9.5或约ph 8.0至约ph 9.0。在一些实施例中，再生缓冲
液为约ph 7.5、约ph 8.0、约ph 8.1、约ph 8.2、约ph 8.3、约ph 8.4、约ph 8.5或约ph 9.0。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 8.3。在一些实施例中，包含约350mm naoac的再生缓冲液的ph为约ph 8.3。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 8。在一些实施例中，包含约50mm tris和约85mm naoac的再生缓冲液的ph为约ph 8.0。
[0094]
在一些实施例中，使约3至约12、约3至约11、约3至约10、约3至约9、约3至约8、约3至约7、约3至约6、约3至约5、约3至约4、约4至约12、约5至约12、约6至约12、约7至约12、约8至约12、约9至约12、约10至约12、约11至约12、约5至约12、约5至约10、约8至约12或约9至约11倍材料体积(例如柱体积)的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约3、4、5、6、7、8、9、10、11或12倍材料体积(例如柱体积)中的任一者的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约10倍材料体积(例如柱体积)的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。
[0095]
在一些方面，本发明提供一种用于清洁离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；b)使酸洗液穿过离子交换层析材料，c)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh和约1m nacl；以及d)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1nnaoh。在一些实施例中，离子交换层析材料为阳离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为阴离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为混合模式阴离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为capto
tm adhere层析材料。
[0096]
在一些实施例中，再生缓冲液包含约50至约600mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含浓度范围为约50mm至600mm、100mm至600mm、150mm至600mm、200mm至600mm、250mm至600mm、300mm至600mm、350mm至600mm、400mm至600mm、450mm至600mm、500mm至600mm、550mm至600mm、50mm至550mm、50mm至450mm、50mm至400mm、50mm至350mm、50mm至300mm、50mm至250mm、50mm至200mm、50mm至150mm、50mm至100mm、100mm至550mm、150mm至500mm、200mm至450mm、250mm至400mm或300mm至400mm中的任一者的naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600或650mm中的任一者的naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约350mm naoac。
[0097]
在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 2.0至约ph 7.0。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 2.0至约ph 6.5、约ph 2.0至约ph 6.0、约ph 2.0至约ph 5.5、约ph 2.0至约ph 5.0、约ph 2.0至约ph 4.5、约ph 2.0至约ph 4.0、约ph 2.0至约ph 3.5、约ph 2.0至约ph 3.0、约ph 2.0至约ph 2.5、约ph 2.5至约ph 7.0、约ph 3.0至约ph 7.0、约ph 3.5至约ph 7.0、约ph 4.0至约ph 7.0、约ph 4.5至约ph 7.0、约ph 5.0至约ph 7.0、约ph 5.5至约ph 7.0、约ph 6.0至约ph 7.0或约ph 6.5至约ph 7.0。在一些实施例中，再生缓冲液为约ph 2.0、约ph 8.0、约ph 2.5、约ph 3.0、约ph 3.5、约ph 4.0、约ph 4.5、约ph5.0、约ph 5.5、约ph 6.0、约ph 6.5或约ph 7.0。在一些实施例中，再生缓冲液为350mm naoac，ph 4.0。在一些实施例中，再生缓冲液为350mm naoac，ph 5.0。在一些实施例中，再生缓冲液为40mm naoac，ph 4.0。在一些实施例中，再生缓冲液为40mm naoac，ph 5.0。
[0098]
在一些实施例中，使约3至约12、约3至约11、约3至约10、约3至约9、约3至约8、约3至约7、约3至约6、约3至约5、约3至约4、约4至约12、约5至约12、约6至约12、约7至约12、约8
至约12、约9至约12、约10至约12、约11至约12、约5至约12、约5至约10、约8至约12或约9至约11倍材料体积(例如柱体积)的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约3、4、5、6、7、8、9、10、11或12倍材料体积(例如柱体积)中的任一者的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约7倍材料体积(例如柱体积)的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。
[0099]
在一些实施例中，酸洗液包含naoac。在一些实施例中，酸洗液包含磷酸。在一些实施例中，酸洗液包含naoac和磷酸。在一些实施例中，酸洗液中naoac的浓度大于约0.1m至小于约0.5m中的任一者。在一些实施例中，酸洗液中naoac的浓度为约0.100m、0.120m、0.130m、0.140m、0.150m、0.160m、0.161m、0.162m、0.163m、0.164m、0.167m、0.168m、0.169m、0.170m、0.180m、0.190m、0.200m、0.250m、0.300m、0.350m、0.400m、0.450m或0.500m中的任一者。在一些实施例中，酸洗液中磷酸的浓度为约0.10m、0.15m、0.20m、0.25m、0.30m、0.35m、0.40m、0.45m、0.50m、0.55m或0.60m中的任一者。在一些实施例中，酸洗液包含约0.167m naoac和约0.3m磷酸。
[0100]
在一些实施例中，使约1至约5、约1至约4、约1至约3、约1至约2、约2至约5、约2至约4、约2至约3、约3至约5、约3至约4、约4至约5倍材料体积(例如柱体积)的酸洗液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约1、2、3、4或5倍材料体积(例如柱体积)中的任一者的酸洗液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约3倍材料体积(例如柱体积)的酸洗液穿过离子交换层析材料。
[0101]
在一些方面，本发明提供用于清洁离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使第一再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；b)使第二再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中第二再生缓冲液包含乙酸钠，c)使酸洗液穿过离子交换层析材料，使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh和约1m nacl；以及d)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1nnaoh。在一些实施例中，离子交换层析材料为阳离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为阴离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为混合模式阴离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为capto
tm adhere层析材料。
[0102]
在一些实施例中，第一再生缓冲液和/或第二再生缓冲液包含约50至约600mm naoac。在一些实施例中，第一再生缓冲液和/或第二再生缓冲液包含浓度范围为约25mm至600mm、30mm至600mm、40mm至600mm、50mm至600mm、75mm至600mm、100mm至600mm、125mm至600mm、150mm至600mm、175mm至600mm、200mm至600mm、225mm至600mm、250mm至600mm、275mm至600mm、300mm至600mm、325mm至600mm、350mm至600mm、375mm至600mm、400mm至600mm、450mm至600mm、500mm至600mm、550mm至600mm、25mm至550mm、25mm至500mm、25mm至475mm、25mm至450mm、25mm至425mm、25mm至400mm、25mm至375mm、25mm至550mm、25mm至325mm、25mm至300mm、25mm至275mm、25mm至250mm、25mm至225mm、25mm至200mm、25mm至175mm、25mm至150mm、25mm至125mm、25mm至100mm、25mm至90mm、25mm至80mm、25mm至70mm、25mm至60mm、25mm至50mm、25mm至40mm或25mm至30mm中的任一者的naoac。在一些实施例中，第一再生缓冲液包含约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600mm中的任一者的naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约350mm naoac。
[0103]
在一些实施例中，第一再生缓冲液和/或第二再生缓冲液的ph为约ph 2.0至约ph 7.0。在一些实施例中，第一再生缓冲液和/或第二再生缓冲液的ph为约ph 2.0至约ph 6.5、约ph 2.0至约ph 6.0、约ph 2.0至约ph 5.5、约ph 2.0至约ph 5.0、约ph 2.0至约ph 4.5、约ph 2.0至约ph 4.0、约ph 2.0至约ph 3.5、约ph 2.0至约ph 3.0、约ph 2.0至约ph 2.5、约ph 2.5至约ph 7.0、约ph 3.0至约ph 7.0、约ph 3.5至约ph 7.0、约ph 4.0至约ph 7.0、约ph 4.5至约ph 7.0、约ph 5.0至约ph 7.0、约ph 5.5至约ph 7.0、约ph 6.0至约ph 7.0或约ph 6.5至约ph 7.0。在一些实施例中，再生缓冲液为约ph 2.0、约ph 8.0、约ph 2.5、约ph 3.0、约ph 3.5、约ph 4.0、约ph 4.5、约ph 5.0、约ph 5.5、约ph 6.0、约ph 6.5或约ph 7.0。
[0104]
在一些实施例中，第一再生缓冲液为约40mm naoac和约ph 4.0，并且第二再生缓冲液为约350mm naoac和约ph 4.0。在一些实施例中，第一再生缓冲液为约40mm naoac和约ph 5.0，并且第二再生缓冲液为约350mm naoac和约ph 5.0。在一些实施例中，第一再生缓冲液为约350mm naoac和约ph 4.0，并且第二再生缓冲液为约40mm naoac和约ph 4.0。在一些实施例中，第一再生缓冲液为约350mm naoac和约ph 5.0，并且第二再生缓冲液为约40mm naoac和约ph 5.0。
[0105]
在一些实施例中，使约3至约12、约3至约11、约3至约10、约3至约9、约3至约8、约3至约7、约3至约6、约3至约5、约3至约4、约4至约12、约5至约12、约6至约12、约7至约12、约8至约12、约9至约12、约10至约12、约11至约12、约5至约12、约5至约10、约8至约12或约9至约11倍材料体积(例如柱体积)的第一再生缓冲液和/或第二再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约3、4、5、6、7、8、9、10、11或12倍材料体积(例如柱体积)中的任一者的第一再生缓冲液和/或第二再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约10倍材料体积(例如柱体积)的第一再生缓冲液和/或第二再生缓冲液穿过离子交换层析材料。
[0106]
在一些实施例中，酸洗液包含naoac。在一些实施例中，酸洗液包含磷酸。在一些实施例中，酸洗液包含naoac和磷酸。在一些实施例中，酸洗液中naoac的浓度大于约0.1m至小于约0.5m中的任一者。在一些实施例中，酸洗液中naoac的浓度为约0.100m、0.120m、0.130m、0.140m、0.150m、0.160m、0.161m、0.162m、0.163m、0.164m、0.167m、0.168m、0.169m、0.170m、0.180m、0.190m、0.200m、0.250m、0.300m、0.350m、0.400m、0.450m或0.500m中的任一者。在一些实施例中，酸洗液中磷酸的浓度为约0.10m、0.15m、0.20m、0.25m、0.30m、0.35m、0.40m、0.45m、0.50m、0.55m或0.60m中的任一者。在一些实施例中，酸洗液包含约0.167m naoac和约0.3m磷酸。
[0107]
在一些实施例中，使约1至约5、约1至约4、约1至约3、约1至约2、约2至约5、约2至约4、约2至约3、约3至约5、约3至约4、约4至约5倍材料体积(例如柱体积)的酸洗液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约1、2、3、4或5倍材料体积(例如柱体积)中的任一者的酸洗液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约3倍材料体积(例如柱体积)的酸洗液穿过离子交换层析材料。
[0108]
在一些实施例中，消毒缓冲液包含naoh。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.1n至约1.0n naoh、约0.1n至约0.9n naoh、约0.1n至约0.8n naoh、约0.1n至约0.7n naoh、约0.1n至约0.8n naoh、约0.1n至约0.6n naoh、约0.1n至约0.5n naoh、约0.2n至约1.0n naoh、约0.3n至约1.0n naoh、约0.4n至约1.0n naoh、约0.5n至约1.0n naoh、约0.2n至约
0.8n naoh、约0.3n至约0.7n naoh或约0.4n至约0.6n naoh。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.1n、0.2n、0.3n、0.4n、0.5n、0.6n、0.7n naoh、0.8n、0.9n或1.0n naoh中的任一者。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.5n naoh。
[0109]
在一些实施例中，消毒缓冲液包含naoh和nacl。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.1n至约1.0n naoh、约0.1n至约0.9n naoh、约0.1n至约0.8n naoh、约0.1n至约0.7n naoh、约0.1n至约0.8n naoh、约0.1n至约0.6n naoh、约0.1n至约0.5n naoh、约0.2n至约1.0n naoh、约0.3n至约1.0n naoh、约0.4n至约1.0n naoh、约0.5n至约1.0n naoh、约0.2n至约0.8n naoh、约0.3n至约0.7n naoh或约0.4n至约0.6n naoh。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.1n、0.2n、0.3n、0.4n、0.5n、0.6n、0.7n naoh、0.8n、0.9n或1.0n中的任一者的naoh。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.5m至约1.5m nacl、0.75m至约1.5m nacl、约1.0m nacl至约1.5m nacl、约1.25m nacl至约1.5m nacl、约0.5m nacl至约1.25m nacl、约0.5m nacl至约1.0m naoh或约0.5m nacl至约0.75m nacl。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.5m、0.75m、1.0m、1.25m或1.5m中的任一者的nacl。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.5n naoh和约1m nacl。
[0110]
在一些实施例中，使约3至约12、约3至约11、约3至约10、约3至约9、约3至约8、约3至约7、约3至约6、约3至约5、约3至约4、约4至约12、约5至约12、约6至约12、约7至约12、约8至约12、约9至约12、约10至约12、约11至约12、约5至约12、约5至约10、约8至约12或约9至约11倍材料体积(例如柱体积)的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约3、4、5、6、7、8、9、10、11或12倍材料体积(例如柱体积)中的任一者的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约10倍材料体积(例如柱体积)的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约4倍材料体积(例如柱体积)的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料。
[0111]
在一些实施例中，储存缓冲液包含naoh。在一些实施例中，储存缓冲液包含约0.05n至约0.5n naoh、0.05n至约0.4n naoh、0.05n至约0.4n naoh、0.05n至约0.3n naoh、0.05n至约0.2n naoh、0.05n至约0.1n naoh、0.1n至约0.5n naoh、0.2n至约0.5n naoh、0.3n至约0.05n naoh或0.4n至约0.5n naoh。在一些实施例中，储存缓冲液包含约0.05n、0.06n、0.07n naoh、0.08n、0.09n、0.1n、0.2n、0.3n、0.4n或0.5n中的任一者的naoh。在一些实施例中，储存缓冲液包含约0.1n naoh。
[0112]
在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约1至约10、约1至约8、约1至约6、约1至约5、约1至约4、约1至约3、约1至约2、约2至约10、约3至约20、约4至约10、约5至约10、约1至约7、约2至约6、约3至约5倍材料体积(例如柱体积)的储存缓冲液中。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍材料体积(例如柱体积)中的任一者的储存缓冲液中。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约4倍材料体积(例如柱体积)的储存缓冲液中。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约3倍材料体积(例如柱体积)的储存缓冲液中。
[0113]
在一些方面，本发明提供用于清洁离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm乙酸钠；b)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及c)将离子交换层析材料储存于储
存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于清洁离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm乙酸钠；b)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及c)将离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，离子交换层析材料为阳离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为阴离子交换层析材料。
[0114]
在一些方面，本发明提供用于清洁阳离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm乙酸钠；b)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及c)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于清洁阳离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm乙酸钠；b)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及c)将阳离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。
[0115]
在一些方面，本发明提供用于清洁阴离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm乙酸钠；b)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及c)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于清洁阴离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm乙酸钠；b)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及c)将阴离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。
[0116]
在一些实施例中，本发明提供一种用于清洁离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm乙酸钠；b)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及c)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，本发明提供一种用于清洁离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm乙酸钠；b)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及c)将离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，离子交换层析材料为阳离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为阴离子交换层析材料。
[0117]
在一些实施例中，本发明提供一种用于清洁阳离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm乙酸钠；b)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及c)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，本发明提供一种用于清洁阳离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm乙酸钠；b)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及c)将阳离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。
[0118]
在一些实施例中，本发明提供一种用于清洁阴离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm乙酸钠；b)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及c)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，本发明提供一种用于清洁阴离子交换层析材料以供再使用的方法，其中层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：a)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm乙酸钠；b)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及c)将阴离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。
[0119]
在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。在一些实施例中，离子交换层析材料为阳离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为阴离子交换层析材料。
[0120]
在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料；f)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，以及g)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
[0121]
在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；
e)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料；f)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，以及g)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
[0122]
在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≥20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。在一些实施例中，离子交换层析材料为阳离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为阴离子交换层析材料。
[0123]
在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度≥20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料；f)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，以及g)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
[0124]
在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度≥20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料；f)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，以及g)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
[0125]
在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度超过离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。在一些实施例中，离子交换层析材料为阳离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为阴离子交换层析材料。
[0126]
在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度超过阳离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料；f)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，以及g)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
[0127]
在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度超过阴离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平
衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料；f)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，以及g)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中。
[0128]
在一些实施例中，平衡缓冲液包含约10mm至约100mm、约20mm至约100mm、约30mm至约100mm、约40mm至约100mm、约10mm至约90mm、约10mm至约80mm、约10mm至约70mm、约10mm至约60mm、约10mm至约50mm、约10mm至约40mm、约10mm至约70mm、约20mm至约60mm或约30mm至约50mm naoac。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约10mm、20mm、30mm、40mm、50mm、60mm、70mm、80mm、90mm或100mm中的任一者的naoac。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约40mm naoac。
[0129]
在一些实施例中，平衡缓冲液的ph为约4.0至约8.0、约5.0至约8.0、约6.0至约8.0、约7.0至约8.0、约4.0至约7.0、约4.0至约6.0、约4.0至约5.0、约4.0至约7.0、约4.5至约6.5或约5.0至约6.0。在一些实施例中，平衡缓冲液的ph为约4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5或8.0中的任一者。在一些实施例中，平衡缓冲液的ph为约5.5。
[0130]
在一些实施例中，在加载组合物之前使约3至约10、约3至约9、约3至约8、约3至约7、约3至约6、约3至约5、约3至约4、约4至约10、约5至约10、约6至约10、约7至约10、约8至约10、约9至约10、约3至约8、约4至约7或约5至约6倍材料体积(例如柱体积)的平衡缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，在加载组合物之前使约3、4、5、6、7、8、9或10倍材料体积(例如柱体积)中的任一者的平衡缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，在加载组合物之前使约5倍材料体积(例如柱体积)的平衡缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，在加载组合物之后将离子交换材料用平衡缓冲液洗涤，直至级分中收集了充足量的多肽。
[0131]
在一些实施例中，再生缓冲液包含约50至约600mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约350mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约25至约75mm tris和约50至约100mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约50mm tris和约85mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 4.0至11.0。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 8.3。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 8.0。在一些实施例中，再生缓冲液包含在约ph 8.3下放入约350mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含在约ph 8.0下放入约50mm tris和约85mm naoac。在一些实施例中，使约3至约12倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。
[0132]
在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.1n至约1n naoh。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.5n naoh。在一些实施例中，使约2至约12倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过使再生缓冲液穿过离子交换层析材料。
[0133]
在一些实施例中，储存缓冲液包含约0.05n至约0.5n naoh。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约1至5倍材料体积的储存缓冲液中。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中。
[0134]
在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料≤1000g/l。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≤1000g/l、≤900g/l、≤800g/l、≤750g/l、≤700g/l、≤600g/l、≤500g/l、≤400g/l、≤300g/l、≤250g/l、≤200g/l、≤100g/l中的任一
者。在一些实施例中，组合物的加载密度在每公升层析材料约20g/l至约1000g/l、约50g/l至约1000g/l、约100g/l至约1000g/l、约200g/l至约1000g/l、约250g/l至约1000g/l、约300g/l至约1000g/l、约400g/l至约1000g/l、约500g/l至约1000g/l、约600g/l至约1000g/l、约700g/l至约1000g/l、约750g/l至约1000g/l、约800g/l至约1000g/l、或约900g/l至约1000g/l中的任一者之间。在一些实施例中，组合物的加载密度在每公升层析材料约20g/l至约900g/l、约20g/l至约800g/l、约20g/l至约750g/l、约20g/l至约700g/l、约20g/l至约600g/l、约20g/l至约500g/l、约20g/l至约400g/l、约20g/l至约300g/l、约20g/l至约250g/l、约20g/l至约200g/l、约20g/l至约100g/l、约20g/l至约75g/l、或约20g/l至约50g/l中的任一者之间。
[0135]
在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料≥20g/l。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≥20g/l、≥50g/l、≥75g/l、≥100g/l、≥200g/l、≥250g/l、≥300g/l、≥400g/l、≥500g/l、≥600g/l、≥700g/l、≥750g/l、≥800g/l、≥900g/l、≥1000g/l、≥1200g/l、≥1400g/l、≥1500g/l、≥1750g/l或≥2000g/l中的任一者。在一些实施例中，组合物的加载密度在每公升层析材料约20g/l至约2000g/l、约50g/l至约2000g/l、约100g/l至约2000g/l、约200g/l至约2000g/l、约250g/l至约2000g/l、约300g/l至约2000g/l、约400g/l至约2000g/l、约500g/l至约2000g/l、约600g/l至约2000g/l、约700g/l至约2000g/l、约750g/l至约2000g/l、约800g/l至约2000g/l、约900g/l至约2000g/l、约1000g/l至约2000g/l、约1250g/l至约2000g/l或约1500g/l至约2000g/l中的任一者之间。在一些实施例中，组合物的加载密度在每公升层析材料约20g/l至约1750g/l、约20g/l至约1500g/l、约20g/l至约1250g/l、约20g/l至约1200g/l或约20g/l至约1100g/l中的任一者之间。
[0136]
在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量约2倍(2-倍)、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、75倍、80倍、90倍或100倍中的任一者。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量2倍至100倍、5倍至100倍、10倍至100倍、20倍至100倍、25倍至100倍、30倍至100倍、40倍至100倍、50倍至100倍、60倍至100倍、70倍至100倍、75倍至100倍、80倍至100倍或90倍至100倍。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量2倍至100倍、2倍至75倍、2倍至50倍、2倍至25倍、2倍至20倍、2倍至15倍、2倍至14倍、2倍至13倍、2倍至12倍、2倍至11倍、2倍至10倍、2倍至9倍、2倍至8倍、2倍至7倍、2倍至6倍、2倍至5倍、2倍至4倍或2倍至3倍。
[0137]
在一些方面，本发明提供一种用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度超过离子交换层析对该多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；f)使酸洗液穿过离子交换层析材料，g)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh和约1m nacl；以及h)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，离子交换层析材料为阳离子交换
层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为阴离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为混合模式阴离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为capto
tm adhere层析材料。
[0138]
在一些实施例中，平衡缓冲液包含约50mm至约100mm、约55mm至约100mm、约60mm至约100mm、约65mm至约100mm、约70mm至约100mm、约75mm至约100mm、约80mm至约100mm、约85mm至约100mm、约90mm至约100mm、约95mm至约100mm、约50mm至约95mm、约50mm至约90mm、约50mm至约85mm、约50mm至约80mm、约50mm至约75mm、约50mm至约70mm、约50mm至约65mm、约50mm至约60mm或约50mm至约55mm naoac。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm或100mm中的任一者的naoac。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约85mm naoac。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约20mm至约80mm、约30mm至约80mm、约40mm至约80mm、约50mm至约80mm、约60mm至约80mm、约70mm至约80mm、约20mm至约70mm、约20mm至约60mm、约20mm至约50mm、约20mm至约40mm或约20mm至约30mm tris。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm或70mm中的任一者的tris。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约50mm tris。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约50mm tris和85mm naoac。
[0139]
在一些实施例中，平衡缓冲液的ph为约6.0至约10.0、约7.0至约10.0、约8.0至约10.0、约9.0至约10.0、约9.0至约9.0、约6.0至约8.0或约6.0至约7.0。在一些实施例中，平衡缓冲液的ph为约6.0.、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0中的任一者。在一些实施例中，平衡缓冲液的ph为约8.0。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约50mm tris和85mm naoac，约ph 8.0。
[0140]
在一些实施例中，在加载组合物之前使约3至约10、约3至约9、约3至约8、约3至约7、约3至约6、约3至约5、约3至约4、约4至约10、约5至约10、约6至约10、约7至约10、约8至约10、约9至约10、约3至约8、约4至约7或约5至约6倍材料体积(例如柱体积)的平衡缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，在加载组合物之前使约3、4、5、6、7、8、9或10倍材料体积(例如柱体积)中的任一者的平衡缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，在加载组合物之前使约5倍材料体积(例如柱体积)的平衡缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，在加载组合物之后将离子交换材料用平衡缓冲液洗涤，直至级分中收集了充足量的多肽。在一些实施例中，在加载组合物之后使约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍材料体积(例如柱体积)中的任一者的平衡缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，在加载组合物之后使约10倍材料体积(例如柱体积)的平衡缓冲液穿过离子交换层析材料。
[0141]
在一些实施例中，再生缓冲液包含约50至约600mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含浓度范围为约25mm至600mm、30mm至600mm、40mm至600mm、50mm至600mm、75mm至600mm、100mm至600mm、125mm至600mm、150mm至600mm、175mm至600mm、200mm至600mm、225mm至600mm、250mm至600mm、275mm至600mm、300mm至600mm、325mm至600mm、350mm至600mm、375mm至600mm、400mm至600mm、450mm至600mm、500mm至600mm、550mm至600mm、25mm至550mm、25mm至500mm、25mm至475mm、25mm至450mm、25mm至425mm、25mm至400mm、25mm至375mm、25mm至550mm、25mm至325mm、25mm至300mm、25mm至275mm、25mm至250mm、25mm至225mm、25mm至200mm、25mm至175mm、25mm至150mm、25mm至125mm、25mm至100mm、25mm至90mm、25mm至80mm、
25mm至70mm、25mm至60mm、25mm至50mm、25mm至40mm或25mm至30mm中的任一者的naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600mm中的任一者的naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约350mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约40mm naoac。
[0142]
在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 2.0至约ph 7.0。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约ph 2.0至约ph 6.5、约ph 2.0至约ph 6.0、约ph 2.0至约ph 5.5、约ph 2.0至约ph 5.0、约ph 2.0至约ph 4.5、约ph 2.0至约ph 4.0、约ph 2.0至约ph 3.5、约ph 2.0至约ph 3.0、约ph 2.0至约ph 2.5、约ph 2.5至约ph 7.0、约ph 3.0至约ph 7.0、约ph 3.5至约ph 7.0、约ph 4.0至约ph 7.0、约ph 4.5至约ph 7.0、约ph 5.0至约ph 7.0、约ph 5.5至约ph 7.0、约ph 6.0至约ph 7.0或约ph 6.5至约ph 7.0。在一些实施例中，再生缓冲液为约ph 2.0、约ph 8.0、约ph 2.5、约ph 3.0、约ph 3.5、约ph 4.0、约ph 4.5、约ph5.0、约ph 5.5、约ph 6.0、约ph 6.5或约ph 7.0。在一些实施例中，再生缓冲液的ph为约4.0。在一些实施例中，再生缓冲液为在约ph 4.0下的约350mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液为在约ph 5.0下的约350mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液为在约ph 4.0下的约40mm naoac。在一些实施例中，再生缓冲液为在约ph 4.0下的约40mm naoac。
[0143]
在一些实施例中，使约3至约12、约3至约11、约3至约10、约3至约9、约3至约8、约3至约7、约3至约6、约3至约5、约3至约4、约4至约12、约5至约12、约6至约12、约7至约12、约8至约12、约9至约12、约10至约12、约11至约12、约5至约12、约5至约10、约8至约12或约9至约11倍材料体积(例如柱体积)的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约3、4、5、6、7、8、9、10、11或12倍材料体积(例如柱体积)中的任一者的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约7倍材料体积(例如柱体积)的再生缓冲液穿过离子交换层析材料。
[0144]
在一些实施例中，酸洗液包含naoac。在一些实施例中，酸洗液包含磷酸。在一些实施例中，酸洗液包含naoac和磷酸。在一些实施例中，酸洗液中naoac的浓度为大于约0.1m至小于约0.5m中的任一者。在一些实施例中，酸洗液中naoac的浓度为约0.100m、0.120m、0.130m、0.140m、0.150m、0.160m、0.161m、0.162m、0.163m、0.164m、0.167m、0.168m、0.169m、0.170m、0.180m、0.190m、0.200m、0.250m、0.300m、0.350m、0.400m、0.450m或0.500m中的任一者。在一些实施例中，酸洗液中磷酸的浓度为约0.10m、0.15m、0.20m、0.25m、0.30m、0.35m、0.40m、0.45m、0.50m、0.55m或0.60m中的任一者。在一些实施例中，酸洗液包含约0.167m naoac和约0.3m磷酸。
[0145]
在一些实施例中，使约1至约5、约1至约4、约1至约3、约1至约2、约2至约5、约2至约4、约2至约3、约3至约5、约3至约4、约4至约5倍材料体积(例如柱体积)的酸洗液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约1、2、3、4或5倍材料体积(例如柱体积)中的任一者的酸洗液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约3倍材料体积(例如柱体积)的酸洗液穿过离子交换层析材料。
[0146]
在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.1n至约1n naoh。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.5n naoh。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.5m至约1.5m nacl。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.5m nacl至约2m nacl。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约1.0m nacl。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.5n naoh和约1m nacl。在一些实施例中，
使约1至约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约4倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料。
[0147]
在一些实施例中，储存缓冲液包含约0.05n至约0.5n naoh。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约1至5倍材料体积的储存缓冲液中。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约3倍材料体积的储存缓冲液中。
[0148]
在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料≤1000g/l。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≤1000g/l、≤900g/l、≤800g/l、≤750g/l、≤700g/l、≤600g/l、≤500g/l、≤400g/l、≤300g/l、≤250g/l、≤200g/l、≤100g/l中的任一者。在一些实施例中，组合物的加载密度在每公升层析材料约20g/l至约1000g/l、约50g/l至约1000g/l、约100g/l至约1000g/l、约200g/l至约1000g/l、约250g/l至约1000g/l、约300g/l至约1000g/l、约400g/l至约1000g/l、约500g/l至约1000g/l、约600g/l至约1000g/l、约700g/l至约1000g/l、约750g/l至约1000g/l、约800g/l至约1000g/l或约900g/l至约1000g/l中的任一者之间。在一些实施例中，组合物的加载密度在每公升层析材料约20g/l至约900g/l、约20g/l至约800g/l、约20g/l至约750g/l、约20g/l至约700g/l、约20g/l至约600g/l、约20g/l至约500g/l、约20g/l至约400g/l、约20g/l至约300g/l、约20g/l至约250g/l、约20g/l至约200g/l、约20g/l至约100g/l、约20g/l至约75g/l或约20g/l至约50g/l中的任一者之间。
[0149]
在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料≥20g/l。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≥20g/l、≥50g/l、≥75g/l、≥100g/l、≥200g/l、≥250g/l、≥300g/l、≥400g/l、≥500g/l、≥600g/l、≥700g/l、≥750g/l、≥800g/l、≥900g/l、≥1000g/l、≥1200g/l、≥1400g/l、≥1500g/l、≥1750g/l或≥2000g/l中的任一者。在一些实施例中，组合物的加载密度在每公升层析材料约20g/l至约2000g/l、约50g/l至约2000g/l、约100g/l至约2000g/l、约200g/l至约2000g/l、约250g/l至约2000g/l、约300g/l至约2000g/l、约400g/l至约2000g/l、约500g/l至约2000g/l、约600g/l至约2000g/l、约700g/l至约2000g/l、约750g/l至约2000g/l、约800g/l至约2000g/l、约900g/l至约2000g/l、约1000g/l至约2000g/l、约1250g/l至约2000g/l或约1500g/l至约2000g/l中的任一者之间。在一些实施例中，组合物的加载密度在每公升层析材料约20g/l至约1750g/l、约20g/l至约1500g/l、约20g/l至约1250g/l、约20g/l至约1200g/l或约20g/l至约1100g/l中的任一者之间。
[0150]
在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量约2倍(2-倍)、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、75倍、80倍、90倍或100倍中的任一者。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量2倍至100倍、5倍至100倍、10倍至100倍、20倍至100倍、25倍至100倍、30倍至100倍、40倍至100倍、50倍至100倍、60倍至100倍、70倍至100倍、75倍至100倍、80倍至100倍或90倍至100倍。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量2倍至100倍、2倍至75倍、2倍至50倍、2倍至25倍、2倍至20倍、2倍至15倍、2倍至14倍、2倍至13倍、2倍至12倍、2倍至11倍、2倍至10倍、2倍至9倍、2倍至8倍、2
倍至7倍、2倍至6倍、2倍至5倍、2倍至4倍或2倍至3倍。
[0151]
在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度超过离子交换层析对该多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使第一再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；f)使第二再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中第二再生缓冲液包含乙酸钠，使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含乙酸钠；h)使酸洗液穿过离子交换层析材料；i)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及j)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，离子交换层析材料为阳离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为阴离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为混合模式阴离子交换层析材料。在一些实施例中，离子交换层析材料为capto
tm adhere层析材料。
[0152]
在一些实施例中，平衡缓冲液包含约50mm至约100mm、约55mm至约100mm、约60mm至约100mm、约65mm至约100mm、约70mm至约100mm、约75mm至约100mm、约80mm至约100mm、约85mm至约100mm、约90mm至约100mm、约95mm至约100mm、约50mm至约95mm、约50mm至约90mm、约50mm至约85mm、约50mm至约80mm、约50mm至约75mm、约50mm至约70mm、约50mm至约65mm、约50mm至约60mm或约50mm至约55mm naoac。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm或100mm中的任一者的naoac。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约85mm naoac。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约20mm至约80mm、约30mm至约80mm、约40mm至约80mm、约50mm至约80mm、约60mm至约80mm、约70mm至约80mm、约20mm至约70mm、约20mm至约60mm、约20mm至约50mm、约20mm至约40mm或约20mm至约30mm tris。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm或70mm中的任一者的tris。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约50mm tris。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约50mm tris和85mm naoac。
[0153]
在一些实施例中，平衡缓冲液的ph为约6.0至约10.0、约7.0至约10.0、约8.0至约10.0、约9.0至约10.0、约9.0至约9.0、约6.0至约8.0或约6.0至约7.0。在一些实施例中，平衡缓冲液的ph为约6.0.、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10.0中的任一者。在一些实施例中，平衡缓冲液的ph为约8.0。在一些实施例中，平衡缓冲液包含约50mm tris和85mm naoac，约ph 8.0。
[0154]
在一些实施例中，在加载组合物之前使约3至约10、约3至约9、约3至约8、约3至约7、约3至约6、约3至约5、约3至约4、约4至约10、约5至约10、约6至约10、约7至约10、约8至约10、约9至约10、约3至约8、约4至约7或约5至约6倍材料体积(例如柱体积)的平衡缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，在加载组合物之前使约3、4、5、6、7、8、9或10倍材料体积(例如柱体积)中的任一者的平衡缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，在加载组合物之前使约5倍材料体积(例如柱体积)的平衡缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，在加载组合物之后将离子交换材料用平衡缓冲液洗涤，直至级分中收集了充足量的多肽。在一些实施例中，在加载组合物之后使约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15倍材料体积(例如柱体积)中的任一者的平衡缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例
中，在加载组合物之后使约10倍材料体积(例如柱体积)的平衡缓冲液穿过离子交换层析材料。
[0155]
在一些实施例中，第一再生缓冲液和/或第二再生缓冲液包含约50至约600mm naoac。在一些实施例中，第一再生缓冲液和/或第二再生缓冲液包含浓度范围为约25mm至600mm、30mm至600mm、40mm至600mm、50mm至600mm、75mm至600mm、100mm至600mm、125mm至600mm、150mm至600mm、175mm至600mm、200mm至600mm、225mm至600mm、250mm至600mm、275mm至600mm、300mm至600mm、325mm至600mm、350mm至600mm、375mm至600mm、400mm至600mm、450mm至600mm、500mm至600mm、550mm至600mm、25mm至550mm、25mm至500mm、25mm至475mm、25mm至450mm、25mm至425mm、25mm至400mm、25mm至375mm、25mm至550mm、25mm至325mm、25mm至300mm、25mm至275mm、25mm至250mm、25mm至225mm、25mm至200mm、25mm至175mm、25mm至150mm、25mm至125mm、25mm至100mm、25mm至90mm、25mm至80mm、25mm至70mm、25mm至60mm、25mm至50mm、25mm至40mm或25mm至30mm中的任一者的naoac。在一些实施例中，第一再生缓冲液包含约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550或600mm中的任一者的naoac。在一些实施例中，再生缓冲液包含约350mm naoac。
[0156]
在一些实施例中，第一再生缓冲液和/或第二再生缓冲液的ph为约ph 2.0至约ph 7.0。在一些实施例中，第一再生缓冲液和/或第二再生缓冲液的ph为约ph 2.0至约ph 6.5、约ph 2.0至约ph 6.0、约ph 2.0至约ph 5.5、约ph 2.0至约ph 5.0、约ph 2.0至约ph 4.5、约ph 2.0至约ph 4.0、约ph 2.0至约ph 3.5、约ph 2.0至约ph 3.0、约ph 2.0至约ph 2.5、约ph 2.5至约ph 7.0、约ph 3.0至约ph 7.0、约ph 3.5至约ph 7.0、约ph 4.0至约ph 7.0、约ph 4.5至约ph 7.0、约ph 5.0至约ph 7.0、约ph 5.5至约ph 7.0、约ph 6.0至约ph 7.0或约ph 6.5至约ph 7.0。在一些实施例中，再生缓冲液为约ph 2.0、约ph 8.0、约ph 2.5、约ph 3.0、约ph 3.5、约ph 4.0、约ph 4.5、约ph 5.0、约ph 5.5、约ph 6.0、约ph 6.5或约ph 7.0。
[0157]
在一些实施例中，第一再生缓冲液为约40mm naoac和约ph 4.0，并且第二再生缓冲液为约350mm naoac和约ph 4.0。在一些实施例中，第一再生缓冲液为约40mm naoac和约ph 5.0，并且第二再生缓冲液为约350mm naoac和约ph 5.0。在一些实施例中，第一再生缓冲液为约350mm naoac和约ph 4.0，并且第二再生缓冲液为约40mm naoac和约ph 4.0。在一些实施例中，第一再生缓冲液为约350mm naoac和约ph 5.0，并且第二再生缓冲液为约40mm naoac和约ph 5.0。
[0158]
在一些实施例中，使约3至约12、约3至约11、约3至约10、约3至约9、约3至约8、约3至约7、约3至约6、约3至约5、约3至约4、约4至约12、约5至约12、约6至约12、约7至约12、约8至约12、约9至约12、约10至约12、约11至约12、约5至约12、约5至约10、约8至约12或约9至约11倍材料体积(例如柱体积)的第一再生缓冲液和/或第二再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约3、4、5、6、7、8、9、10、11或12倍材料体积(例如柱体积)中的任一者的第一再生缓冲液和/或第二再生缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约10倍材料体积(例如柱体积)的第一再生缓冲液和/或第二再生缓冲液穿过离子交换层析材料。
[0159]
在一些实施例中，酸洗液包含naoac。在一些实施例中，酸洗液包含磷酸。在一些实施例中，酸洗液包含naoac和磷酸。在一些实施例中，酸洗液中naoac的浓度为大于约0.1m至小于约0.5m中的任一者。在一些实施例中，酸洗液中naoac的浓度为约0.100m、0.120m、
0.130m、0.140m、0.150m、0.160m、0.161m、0.162m、0.163m、0.164m、0.167m、0.168m、0.169m、0.170m、0.180m、0.190m、0.200m、0.250m、0.300m、0.350m、0.400m、0.450m或0.500m中的任一者。在一些实施例中，酸洗液中磷酸的浓度为约0.10m、0.15m、0.20m、0.25m、0.30m、0.35m、0.40m、0.45m、0.50m、0.55m或0.60m中的任一者。在一些实施例中，酸洗液包含约0.167m naoac和约0.3m磷酸。
[0160]
在一些实施例中，使约1至约5、约1至约4、约1至约3、约1至约2、约2至约5、约2至约4、约2至约3、约3至约5、约3至约4、约4至约5倍材料体积(例如柱体积)的酸洗液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约1、2、3、4或5倍材料体积(例如柱体积)中的任一者的酸洗液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约3倍材料体积(例如柱体积)的酸洗液穿过离子交换层析材料。
[0161]
在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.1n至约1n naoh。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.5n naoh。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.5m至约1.5m nacl。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约1.0m nacl。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.5n naoh和约1m nacl。在一些实施例中，使约1至约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料。在一些实施例中，使约4倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料。
[0162]
在一些实施例中，储存缓冲液包含约0.05n至约0.5n naoh。在一些实施例中，消毒缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约1至5倍材料体积的储存缓冲液中。在一些实施例中，将离子交换层析材料储存于约3倍材料体积的储存缓冲液中。
[0163]
在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料≤1000g/l。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≤1000g/l、≤900g/l、≤800g/l、≤750g/l、≤700g/l、≤600g/l、≤500g/l、≤400g/l、≤300g/l、≤250g/l、≤200g/l、≤100g/l中的任一者。在一些实施例中，组合物的加载密度在每公升层析材料约20g/l至约1000g/l、约50g/l至约1000g/l、约100g/l至约1000g/l、约200g/l至约1000g/l、约250g/l至约1000g/l、约300g/l至约1000g/l、约400g/l至约1000g/l、约500g/l至约1000g/l、约600g/l至约1000g/l、约700g/l至约1000g/l、约750g/l至约1000g/l、约800g/l至约1000g/l或约900g/l至约1000g/l中的任一者之间。在一些实施例中，组合物的加载密度在每公升层析材料约20g/l至约900g/l、约20g/l至约800g/l、约20g/l至约750g/l、约20g/l至约700g/l、约20g/l至约600g/l、约20g/l至约500g/l、约20g/l至约400g/l、约20g/l至约300g/l、约20g/l至约250g/l、约20g/l至约200g/l、约20g/l至约100g/l、约20g/l至约75g/l或约20g/l至约50g/l中的任一者之间。
[0164]
在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料≥20g/l。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≥20g/l、≥50g/l、≥75g/l、≥100g/l、≥200g/l、≥250g/l、≥300g/l、≥400g/l、≥500g/l、≥600g/l、≥700g/l、≥750g/l、≥800g/l、≥900g/l、≥1000g/l、≥1200g/l、≥1400g/l、≥1500g/l、≥1750g/l或≥2000g/l中的任一者。在一些实施例中，组合物的加载密度在每公升层析材料约20g/l至约2000g/l、约50g/l至约2000g/l、约100g/l至约2000g/l、约200g/l至约2000g/l、约250g/l至约2000g/l、约300g/l至约2000g/l、约400g/l至约2000g/l、约500g/l至约2000g/l、约600g/l至约2000g/l、约700g/l至约2000g/l、约750g/l至约2000g/l、约800g/l至约2000g/l、约900g/l至约
2000g/l、约1000g/l至约2000g/l、约1250g/l至约2000g/l或约1500g/l至约2000g/l中的任一者之间。在一些实施例中，组合物的加载密度在每公升层析材料约20g/l至约1750g/l、约20g/l至约1500g/l、约20g/l至约1250g/l、约20g/l至约1200g/l或约20g/l至约1100g/l中的任一者之间。
[0165]
在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量约2倍(2-倍)、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、75倍、80倍、90倍或100倍中的任一者。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量2倍至100倍、5倍至100倍、10倍至100倍、20倍至100倍、25倍至100倍、30倍至100倍、40倍至100倍、50倍至100倍、60倍至100倍、70倍至100倍、75倍至100倍、80倍至100倍或90倍至100倍。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量2倍至100倍、2倍至75倍、2倍至50倍、2倍至25倍、2倍至20倍、2倍至15倍、2倍至14倍、2倍至13倍、2倍至12倍、2倍至11倍、2倍至10倍、2倍至9倍、2倍至8倍、2倍至7倍、2倍至6倍、2倍至5倍、2倍至4倍或2倍至3倍。
[0166]
在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≤1000g/l、≤900g/l、≤800g/l、≤750g/l、≤700g/l、≤600g/l、≤500g/l、≤400g/l、≤300g/l、≤250g/l、≤200g/l、≤100g/l中的任一者。
[0167]
在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中
储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阳离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≤1000g/l、≤900g/l、≤800g/l、≤750g/l、≤700g/l、≤600g/l、≤500g/l、≤400g/l、≤300g/l、≤250g/l、≤200g/l、≤100g/l中的任一者。
[0168]
在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阴离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≤1000g/l、≤900g/l、≤800g/l、≤750g/l、≤700g/l、≤600g/l、≤500g/l、≤400g/l、≤300g/l、≤250g/l、≤200g/l、≤100g/l中的任一者。
[0169]
在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≥约20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)
将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≥约20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≥20g/l、≥50g/l、≥70g/l、≥100g/l、≥200g/l、≥250g/l、≥300g/l、≥400g/l、≥500g/l、≥600g/l、≥700g/l、≥750g/l、≥800g/l、≥900g/l、≥1000g/l、≥1200g/l、≥1400g/l、≥1500g/l、≥1750g/l或≥2000g/l中的任一者。
[0170]
在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度≥约20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度≥约20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阳离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≥20g/l、≥50g/l、≥70g/l、≥100g/l、≥200g/l、≥250g/l、≥300g/l、≥400g/l、≥500g/l、≥600g/l、≥700g/l、≥750g/l、≥800g/l、≥900g/l、≥1000g/l、≥1200g/l、≥1400g/l、≥1500g/l、≥1750g/l或≥2000g/l中的任一者。
[0171]
在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度≥约20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度≥约20g/l；
c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阴离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≥20g/l、≥50g/l、≥70g/l、≥100g/l、≥200g/l、≥250g/l、≥300g/l、≥400g/l、≥500g/l、≥600g/l、≥700g/l、≥750g/l、≥800g/l、≥900g/l、≥1000g/l、≥1200g/l、≥1400g/l、≥1500g/l、≥1750g/l或≥2000g/l中的任一者。
[0172]
在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度超过离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度超过离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量2倍至100倍。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量约10倍。
[0173]
在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度超过阳离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度超过阳离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓
冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阳离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量2倍至100倍。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量约10倍。
[0174]
在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度超过阴离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.3下的约350mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度超过离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph8.3下的约350mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阴离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量2倍至100倍。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量约10倍。
[0175]
在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液
包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≤1000g/l、≤900g/l、≤800g/l、≤750g/l、≤700g/l、≤600g/l、≤500g/l、≤400g/l、≤300g/l、≤250g/l、≤200g/l、≤100g/l中的任一者。
[0176]
在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阳离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≤1000g/l、≤900g/l、≤800g/l、≤750g/l、≤700g/l、≤600g/l、≤500g/l、≤400g/l、≤300g/l、≤250g/l、≤200g/l、≤100g/l中的任一者。
[0177]
在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下之约25mm tris及约85mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；及g)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下之约25mm tris及约85mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；及g)将阴离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≤1000g/l、≤900g/l、≤800g/l、≤750g/l、≤700g/l、≤600g/
l、≤500g/l、≤400g/l、≤300g/l、≤250g/l、≤200g/l、≤100g/l中的任一者。
[0178]
在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≥约20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1nnaoh。在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度≥约20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≥20g/l、≥50g/l、≥70g/l、≥100g/l、≥200g/l、≥250g/l、≥300g/l、≥400g/l、≥500g/l、≥600g/l、≥700g/l、≥750g/l、≥800g/l、≥900g/l、≥1000g/l、≥1200g/l、≥1400g/l、≥1500g/l、≥1750g/l或≥2000g/l中的任一者。
[0179]
在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度≥约20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度≥约20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阳离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≥20g/l、≥50g/l、≥70g/l、≥100g/l、≥200g/l、≥250g/l、≥300g/l、≥400g/l、≥500g/l、≥600g/l、≥700g/l、≥750g/l、≥800g/l、≥900g/l、≥1000g/l、≥1200g/l、≥1400g/l、≥1500g/l、≥1750g/l或≥2000g/l中的任一者。
[0180]
在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度≥约20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度≥约20g/l；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阴离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度为每公升层析材料约≥20g/l、≥50g/l、≥70g/l、≥100g/l、≥200g/l、≥250g/l、≥300g/l、≥400g/l、≥500g/l、≥600g/l、≥700g/l、≥750g/l、≥800g/l、≥900g/l、≥1000g/l、≥1200g/l、≥1400g/l、≥1500g/l、≥1750g/l或≥2000g/l中的任一者。
[0181]
在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度超过离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于离子交换层析材料上，其中加载密度超过离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1nnaoh。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量2倍至100倍。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量约10倍。
[0182]
在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平
衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度超过阳离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阳离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用阳离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阳离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡阳离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阳离子交换层析材料上，其中加载密度超过阳离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阳离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过阳离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阳离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量2倍至100倍。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量约10倍。
[0183]
在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度超过阴离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm naoac；f)使消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阴离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些方面，本发明提供用于使用阴离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化多肽的方法，其中阴离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：a)用约4倍材料体积的平衡缓冲液平衡阴离子交换层析材料，其中平衡缓冲液包含约40mm naoac；b)将组合物加载于阴离子交换层析材料上，其中加载密度超过离子交换层析材料对多肽的动态结合容量；c)收集包含该多肽的级分；d)用平衡缓冲液洗涤阴离子交换层析材料；e)使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中再生缓冲液包含在约ph 8.0下的约25mm tris和约85mm naoac；f)使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过阴离子交换层析材料，其中消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及g)将阴离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中，其中储存缓冲液包含约0.1n naoh。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量2倍至100倍。在一些实施例中，组合物的加载密度超过层析材料对多肽的动态结合容量约10倍。
[0184]
在本发明所描述的方法中的任一者的一些实施例中，层析材料为离子交换材料(例如阳离子交换材料或阴离子交换材料)。在一些实施例中，离子交换材料在层析柱(例如阳离子交换层析柱或阴离子交换层析柱)中。
[0185]
在一些实施例中，阳离子交换材料为带负电荷的固相并且具有用于与绕过或穿过固相的水溶液中的阳离子交换的游离阳离子。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，阳离子交换材料可为膜、整体料或树脂。在一些实施例中，阳离子交换材料可为树脂。阳离子交换材料可包含羧酸官能团或磺酸官能团，诸如但不限于磺酸酯、含羧基的、羧基甲基磺酸、磺异丁基、磺乙基、羧基、磺丙基、磺酰基、磺酰氧基乙基或正磷酸酯。在上文的一些实施例中，阳离子交换层析材料为阳离子交换层析树脂。在上文的一些实施例中，阳离子交换层析材料为阳离子交换层析膜。在本发明的一些实施例中，层析材料不为阳离子交换层析材料。在一些实施例中，阳离子交换层析材料用于大规模纯化多肽；例如制造规模制备多肽，诸如抗体或其片段。
[0186]
在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，离子交换材料可使用常规层析材料或对流层析材料。常规层析材料包括例如灌注材料(例如聚(苯乙烯-二乙烯基苯)树脂)和扩散材料(例如交联琼脂糖树脂)。在一些实施例中，聚(苯乙烯-二乙烯基苯)树脂可为poros
tm 树脂。在一些实施例中，交联琼脂糖树脂可为磺丙基-fast flow(“spsff”)树脂。对流层析材料可为膜(例如聚醚砜)或整体材料(例如交联聚合物)。聚醚砜膜可为mustang。交联聚合物整体材料可为交联聚(甲基丙烯酸缩水甘油酯-共-二甲基丙烯酸乙二醇酯)。
[0187]
阳离子交换材料的实例为本技术领域中已知的，包括但不限于s、s、so3整体料(monolith)、s ceramic hyperd
tm 、poros
tm xs、poros
tm hs50、poros
tm hs20、spsff、hs20、spsff、xl(spxl)、cmfast flow、capto
tm s、se hicap、so3或coo。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，阳离子交换剂为poros
tm hs50。在一些实施例中，poros
tm hs树脂可为poros
tm hs 50μm或poros
tm hs 20μm粒子。
[0188]
在本发明的一些方面，阴离子交换层析材料为带正电荷的固相并且具有用于与绕过或穿过固相的水溶液中的阴离子交换的游离阴离子。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，阴离子交换材料可为膜、整体料或树脂。在一实施例中，阴离子交换材料可为树脂。在一些实施例中，阴离子交换材料可包含伯胺、仲胺、叔胺或季铵离子官能团、聚胺官能团或二乙氨基乙基官能团。在上文的一些实施例中，阴离子交换层析材料为阴离子交换层析柱。在上文的一些实施例中，阴离子交换层析材料为阴离子交换层析膜。阴离子交换材料的实例为本技术领域中已知的并且包括但不限于poros
tm hq 50、poros
tm pi 50、poros
tm d、q、qff和deae
[0189]
在一些实施例中，离子交换层析材料为混合模式离子交换层析材料。混合模式层析材料包含能够进行以下功能中的一者或多者的官能团：阴离子交换、阳离子交换、氢键结和疏水相互作用。在一些实施例中，离子交换层析材料为混合模式阳离子交换层析材料。阳离子交换混合模式材料的实例包括但不限于capto mmc
tm
、capto mmc
tm impres、nuvia
tm cprime
tm 和toyopearl mx trp-650m。在一些实施例中，离子交换层析材料为混合模式阴离子交换层析材料。阴离子交换混合模式材料的实例包括但不限于capto adhere
tm 和capto adhere
tm impres。
[0190]
在一些实施例中，离子交换层析材料用于纯化多种多肽产物。在一些实施例中，离子交换层析材料用于纯化多种抗体产物。在一些实施例中，清洁方法之后的遗留物包含以下中的一者或多者：《0.25mg/ml总蛋白、《1ppm igg片段、《1ppm igg聚集物、《1ppm浸出蛋白质a、《1μg/ml cze lif、《1ppm chop和《1pg/ml cho dna。
[0191]
在一些实施例中，在多肽的纯化中将离子交换层析与一个或多个其他层析程序组合。在一些实施例中，在抗体的纯化中将离子交换层析与一个或多个其他层析程序组合。在一些实施例中，在多肽的大规模纯化中；例如在多肽(诸如抗体或其片段)的制造规模制备中将离子交换层析与一个或多个其他层析程序组合。在一些实施例中，在多肽的大规模纯化中；例如在多肽(诸如抗体或其片段)的制造规模制备中将离子交换层析与一个或多个其他层析程序组合。在一些实施例中，在过载离子交换层析之前进行一个或多个其他层析程序。在一些实施例中，在过载离子交换层析之后进行一个或多个其他层析程序。在一些实施例中，在过载离子交换层析之前进行一个或多个其他层析程序，并且在过载离子交换层析之后进行一个或多个其他层析程序。在一些实施例中，将过载离子交换层析与选自由以下项组成的组的一个或多个层析程序组合：混合模式层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、疏水相互作用层析(hic)、亲和层析和尺寸排阻层析。
[0192]
在一些实施例中，在多肽的纯化中将阳离子交换层析与一个或多个其他层析程序组合。在一些实施例中，在抗体的纯化中将阳离子交换层析与一个或多个其他层析程序组合。在一些实施例中，在多肽的大规模纯化中；例如在多肽(诸如抗体或其片段)的制造规模制备中将阳离子交换层析与一个或多个其他层析程序组合。在一些实施例中，在多肽的大规模纯化中；例如在多肽(诸如抗体或其片段)的制造规模制备中将阳离子交换层析与一个或多个其他层析程序组合。在一些实施例中，在过载阳离子交换层析之前进行一个或多个其他层析程序。在一些实施例中，在过载阳离子交换层析之后进行一个或多个其他层析程序。在一些实施例中，在过载阳离子交换层析之前进行一个或多个其他层析程序，并且在过载阳离子交换层析之后进行一个或多个其他层析程序。在一些实施例中，将过载阳离子交换层析与选自由以下项组成的组的一个或多个层析程序组合：混合模式层析、阴离子交换层析、疏水相互作用层析(hic)、亲和层析、尺寸排阻层析和其他阳离子交换层析。
[0193]
用于单克隆抗体的2000l纯化制程的实例包括收获产生该抗体的cho细胞以产生原料流。在每公升树脂≤30g/l的加载密度下以结合和洗脱模式对原料流进行蛋白质a亲和层析(例如mabselect sure
tm
)，在每公升树脂≤85g/l的加载密度下以结合和洗脱模式对蛋白质a洗脱物进行阳离子交换层析(例如poros
tm xs)，在每公升树脂≤100g/l的加载密度下以流通模式对阳离子交换洗脱物进行混合模式阴离子交换层析(例如ff)，以及对混合模式阴离子交换级分进行超滤/透滤(例如3)以按50g/l的最终浓度对抗体进行调配。
[0194]
用于单克隆抗体的2000l纯化制程的另一实例包括收获产生该抗体的cho细胞以产生原料流。在每公升树脂≤30g/l的加载密度下以结合和洗脱模式对原料流进行蛋白质a亲和层析(例如mabselect sure
tm )，在每公升树脂≤41g/l的加载密度下以结合和洗脱模式对蛋白质a洗脱物进行阳离子交换层析(例如poros
tm hs)，在每公升树脂≤100g/l的加载密度下以流通模式对阳离子交换洗脱物进行混合模式阴离子交换层析(例如
ff)，对混合模式阴离子交换级分进行过滤以去除病毒(例如1:1pro)(在1.2-2.6kg/m2下)，以及对原料流进行超滤/透滤以按50g/l的最终浓度对抗体进行调配。
[0195]
用于单克隆抗体的12000l制造规模纯化制程的实例包括收获产生该抗体的cho细胞以产生原料流。对原料流进行洗涤剂病毒灭活步骤(例如triton-cg110)，在每公升树脂≤40g/l的加载密度下以结合和洗脱模式对原料流进行蛋白质a亲和层析(例如mabselect sure
tm
)，在每公升树脂≤1000g/l的加载密度下以过载模式对蛋白质a洗脱物进行阳离子交换层析(例如poros
tm hs)，在每公升树脂≤350g/l的加载密度下以流通模式对阳离子交换洗脱物进行混合模式阴离子交换层析(例如capto
tm adhere)，以及对混合模式阴离子交换级分进行超滤/透滤(例如3)以按60g/l的最终浓度对抗体进行调配。
[0196]
用于单克隆抗体的12000l制造规模纯化制程的另一实例包括收获产生该抗体的cho细胞以产生原料流。在每公升树脂≤35g/l的加载密度下以结合和洗脱模式对原料流进行蛋白质a亲和层析(例如mabselect sure
tm
)，在每公升树脂≤800g/l的加载密度下以过载模式对蛋白质a洗脱物进行阳离子交换层析(例如poros
tm hs)，在每公升树脂≤250g/l的加载密度下以流通模式对阳离子交换洗脱物进行混合模式阴离子交换层析(例如capto
tm adhere)，对混合模式阴离子交换级分进行过滤以去除病毒(例如1:1pro)(在9-10kg/m2下)，以及对原料流进行超滤/透滤以按100g/l的最终浓度对抗体进行调配。
[0197]
在本发明的一些方面，将过载阳离子交换层析与亲和层析材料组合使用。亲和层析材料的实例包括但不限于用蛋白质a和/或蛋白质g衍生的层析材料。亲和层析材料的实例包括但不限于ultra plus、蛋白质afast flow、蛋白质a、mabselect、mabselect sure
tm 和mabselect sure
tm lx、蛋白质l、fcxl、蛋白质xl、κ层析和κxl层析。在上文的一些实施例中，亲和层析材料为亲和层析柱。在上文的一些实施例中，亲和层析材料为亲和层析膜。
[0198]
在本发明的一些方面，将过载离子交换层析(例如过载阳离子交换层析)与混合模式层析材料组合使用。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，层析材料为混合模式材料，其包含能够进行以下功能中的一者或多者的官能团：阴离子交换、阳离子交换、氢键结和疏水相互作用。在一些实施例中，混合模式材料包含能够进行阴离子交换和疏水相互作用的官能团。混合模式材料可含有n-苯甲基-n-甲基乙醇胺、4-巯基-乙基-吡啶、己基胺或苯基丙基胺作为配体或含有交联聚烯丙基胺。混合模式材料的实例包括capto
tm adhere树脂、qma树脂、capto
tm mmc树脂、mep hypercel
tm
树脂、hea hypercel
tm
树脂、ppa hypercel
tm
树脂或chromasorb
tm
膜或stic。在一些实施例中，混合模式材料为capto
tm adhere树脂。在上文的一些实施例中，混合模式材料为混合模式层析柱。在上文的一些实施例中，混合模式材料为混合模式膜。
[0199]
在本发明的一些方面，将过载离子交换层析(例如过载阳离子交换层析)与阴离子交换层析材料组合使用。在一些实施例中，阴离子交换层析材料为带正电荷的固相并且具有用于与绕过或穿过固相的水溶液中的阴离子交换的游离阴离子。在本文所描述的方法中
的任一者的一些实施例中，阴离子交换材料可为膜、整体料或树脂。在一实施例中，阴离子交换材料可为树脂。在一些实施例中，阴离子交换材料可包含伯胺、仲胺、叔胺或季铵离子官能团、聚胺官能团或二乙氨基乙基官能团。在上文的一些实施例中，阴离子交换层析材料为阴离子交换层析柱。在上文的一些实施例中，阴离子交换层析材料为阴离子交换层析膜。
[0200]
在本发明的一些方面，将过载离子交换层析(例如过载阳离子交换层析)与疏水相互作用层析材料组合使用。疏水相互作用层析(hic)为根据疏水性分离生物分子的液相层析技术。hic层析材料的实例包括但不限于己基650、丁基650、苯基650、醚650、source、resource、hi-trap、辛基苯基在上文的一些实施例中，hic层析材料为hic层析柱。在上文的一些实施例中，hic层析材料为hic层析膜。
[0201]
在本发明的一些方面，将过载离子交换层析(例如过载阳离子交换层析)与羟磷灰石(ha)层析材料组合使用。羟磷灰石层析材料的实例包括但限于ha和cht羟磷灰石。在上文的一些实施例中，ha层析材料为ha层析柱。在上文的一些实施例中，ha层析材料为ha层析膜。
[0202]
在一些实施例中，过载离子交换层析在柱中进行(即，柱层析)。在一些实施例中，在柱中进行一个或多个其他层析程序。
[0203]
在一些实施例中，本发明提供用于清洁或再生碱稳定性层析材料(例如碱稳定性层析柱)的方法。
[0204]
在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，流速为小于约每小时50倍材料体积、每小时40倍材料体积或每小时30倍材料体积中的任一者。流速可为约每小时5倍材料体积至每小时50倍材料体积、每小时10倍材料体积至每小时40倍材料体积或每小时18倍材料体积至每小时36倍材料体积中的任一者。在一些实施例中，流速为约每小时9倍材料体积、每小时18倍材料体积、每小时25倍材料体积、每小时30倍材料体积、每小时36倍材料体积或每小时40倍材料体积中的任一者。
[0205]
在一些实施例中，层析材料在层析柱中。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，流速为小于约50柱体积(cv)/h、40cv/h、30cv/h、20cv/h或15cv/h中的任一者。流速可为约5cv/h至50cv/h、10cv/h至40cv/h或15cv/h至20cv/h中的任一者。在一些实施例中，流速为约10cv/h、15cv/h、20cv/h、25cv/h、30cv/h或40cv/h中的任一者。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，流速为小于约100cm/h、75cm/h或50cm/h中的任一者。流速可为约25cm/h至150cm/h、25cm/h至100cm/h、50cm/h至100cm/h或65cm/h至85cm/h中的任一者。
[0206]
柱床高度为所用层析材料的高度。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，柱床高度为大于约3cm、10cm或15cm中的任一者。柱床高度可为约3cm至35cm、5cm至15cm、3cm至10cm或5cm至8cm中的任一者。在一些实施例中，柱床高度为约3cm、5cm、10cm、15cm、20cm、25cm或30cm中的任一者。在一些实施例中，柱床高度基于加载物中多肽或污染物的量来测定。在一些实施例中，层析材料在用于多肽的大规模纯化的柱中；例如多肽(诸如抗体或其片段)的制造规模制备中。在一些实施例中，制造规模层析材料具有约10cm、15cm、20cm、25cm或30cm中的任一者的柱床高度。
[0207]
柱床直径为所用层析材料的直径。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，柱床直径为大于约80cm、100cm或120cm中的任一者。在一些实施例中，柱床直径为约50cm、60cm、70cm、80cm、90cm、100cm、110cm、120cm、130cm、140cm、150cm、160cm、170cm、180cm、190或200cm中的任一者。在一些实施例中，柱床直径基于加载物中多肽或污染物的量来测定。在一些实施例中，层析材料在用于多肽的大规模纯化的柱中；例如多肽(诸如抗体或其片段)的制造规模制备中。在一些实施例中，制造规模层析材料具有约50cm、60cm、70cm、80cm、90cm、100cm、110cm、120cm、130cm、140cm、150cm、160cm、170cm、180cm、190或200cm中的任一者的柱床直径。
[0208]
在一些实施例中，层析在体积大于约1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、40ml、50ml、75ml、100ml、200ml、300ml、400ml、500ml、600ml、700ml、800ml、900ml、1l、2l、3l、4l、5l、6l、7l、8l、9l、10l、25l、50l、100l、200l、300l、400l、500l、600l、700l、800l、900l或1000l的柱或容器中进行。在一些实施例中，容器具有14cm的柱床高度和80cm的柱床体积；例如大规模蛋白质a柱。在一些实施例中，容器具有19cm的柱床高度和100cm的柱床体积，例如大规模阴离子交换柱。在一些实施例中，容器具有30cm的柱床高度和120cm的柱床体积，例如大规模离子交换柱。
[0209]
如本文所用，加载物为加载至层析材料上的组合物。在一些实施例中，加载物为加载至先前已用于分离不同多肽的层析材料上的多肽。加载缓冲液为用于将包含目标产物的组合物加载至层析材料上的缓冲液。可在加载所要纯化的组合物之前将层析材料用平衡缓冲液平衡。在一些实例中，在将组合物加载至层析材料上之后和目标多肽自固相洗脱之前使用洗涤缓冲液。在一些实施例中，洗涤缓冲液与加载缓冲液相同。在一些实施例中，可通过洗涤缓冲液(例如过载模式)自层析材料去除一些相关产物(例如多肽)。
[0210]
如本文所用，洗脱为自层析材料去除产物，例如多肽。在本发明的一些实施例中，洗脱为“模拟洗脱”，其中对层析材料应用洗脱程序，在该洗脱程序中在最后的清洁程序之后不加载蛋白质。在本发明的一些实施例中，在本文所描述的清洁程序中的任一者之后对层析材料应用模拟洗脱程序。在一些实施例中，模拟洗脱模拟了将用于洗脱蛋白质并且将应用于材料以确定在实际制备运行期间是否可能存在遗留材料(例如污染物)的洗脱。模拟洗脱可用作用于评估清洁程序的功效的手段。
[0211]
洗脱缓冲液为用于自层析材料洗脱多肽或其他目标产物的缓冲液。在许多情况下，洗脱缓冲液具有不同于加载缓冲液的物理特征。例如，洗脱缓冲液可具有不同于加载缓冲液的电导率或不同于加载缓冲液的ph。在一些实施例中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液低的电导率。在一些实施例中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液高的电导率。在一些实施例中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液低的ph。在一些实施例中，洗脱缓冲液具有比加载缓冲液高的ph。在一些实施例中，洗脱缓冲液具有与加载缓冲液不同的电导率和不同的ph。洗脱缓冲液可具有较高或较低的电导率及较高或较低的ph的任何组合。
[0212]
电导率指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。在溶液中，电流通过离子迁移而流动。因此，随水溶液中存在的离子的量增加，溶液将具有更高的电导率。电导率的基本测量单位为西门子(siemen)(或姆欧(mho))、姆欧(ms/cm)，并且可使用电导率计(诸如各种型号的orion电导率计)测量。由于电解电导率为溶液中的离子运输电流的能力，故可通过改变溶液中的离子浓度来改变溶液的电导率。例如，可改变缓冲剂的浓度和/或溶液中盐
(例如氯化钠、乙酸钠或氯化钾)的浓度以实现所需电导率。优选地，改变各种缓冲液的盐浓度以实现所需电导率。
[0213]
污染物
[0214]
本发明提供用于在大规模纯化多肽时；例如多肽(诸如抗体或其片段)的制造规模制备中使用的层析材料的再使用的方法。该方法提供多种多肽产物的层析材料的多次使用。例如，使用本发明的方法，可将第一抗体以工业规模在层析材料上纯化，随后为本文所描述的清洁/再生层析材料的方法，并且接着随后为第二抗体产物的工业规模纯化。在一些实施例中，使用本发明的方法来减少使用层析材料纯化的先前产物的“遗留”。在一些实施例中，遗留污染物包括但不限于全抗体、igg片段、fc、fc片段和抗体聚集物。
[0215]
在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，至少一种污染物为以下中的至少一者或多者：宿主细胞材料，诸如chop；浸出蛋白质a；核酸；所需多肽的变体、片段、聚集物或衍生物；另一多肽；内毒素；病毒污染物；细胞培养基组分、羧肽酶b、庆大霉素(gentamicin)等。在一些实例中，污染物可为来自例如但不限于细菌细胞(诸如大肠杆菌细胞)、昆虫细胞、原核细胞、真核细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、禽类细胞、真菌细胞的宿主细胞蛋白质(hcp)。
[0216]
浸出蛋白质a为自与其结合的固相剥离或洗涤的蛋白质a。例如，浸出蛋白质a可自蛋白质a层析材料浸出。蛋白质a的量可例如通过elisa来测量。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，浸出蛋白质a的量降低大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任一者。浸出蛋白质a的量可降低约10％至99％、30％至95％、30％至99％、50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％至99％中的任一者。在一些实施例中，浸出蛋白质a的量降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。在一些实施例中，该降低通过将自纯化步骤回收的组合物中浸出蛋白质a的量与纯化步骤之前组合物中浸出蛋白质a的量相比较来测定。
[0217]
宿主细胞蛋白质(hcp)为来自产生多肽的细胞的蛋白质。例如，chop为来自宿主细胞的蛋白质，亦即中国仓鼠卵巢蛋白质。chop的量可通过酶联免疫吸附测定(“elisa”)或meso scale discovery(“mso”)来测量。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，在模拟洗脱中洗脱物中hcp(例如chop)的量为极小的。在一些实施例中，将使用与不使用清洁方法或清洁方法之前与之后来自模拟洗脱的洗脱物中宿主细胞蛋白质的含量相比较。
[0218]
测量dna(诸如宿主细胞dna)的方法为本技术领域中已知的并且描述于实例部分中。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，dna的量降低大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任一者。dna的量可降低约10％至99％、30％至95％、30％至99％、50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％至99％中的任一者。dna的量可降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％中的任一者。在一些实施例中，该降低通过将自纯化步骤回收的组合物中dna的量与纯化步骤之前组合物中dna的量相比较来测定。
[0219]
片段多肽可为低分子量(lmw)蛋白质。在一些实施例中，片段化的多肽为目标多肽的片段。lmw蛋白质的实例包括但不限于fab(片段抗原结合)、fc(片段，可结晶的)区或两者或目标抗体的任何随机片段化部分的组合。测量片段化蛋白质(例如lmw蛋白质)的方法为本技术领域中已知的并且描述于实例部分中。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施
例中，lmw蛋白质的量降低大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。lmw蛋白质的量可降低约10％至99％、30％至95％、30％至99％、50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％至99％中的任一者。lmw蛋白质的量可降低约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。在一些实施例中，该降低通过将自纯化步骤回收的组合物中片段化蛋白质(例如lmw蛋白质)的量与纯化步骤之前组合物中片段化蛋白质(例如lmw蛋白质)的量相比较来测定。
[0220]
聚集多肽可为高分子量(hmw)蛋白质。在一些实施例中，聚集多肽为目标多肽的多聚体。hmw蛋白质可为目标多肽的二聚体、高至8倍单体或更大。测量聚集蛋白质(例如hmw蛋白质)的方法为本技术领域中已知的。在一些实施例中，模拟洗脱中hmw的含量为极小的；例如小于约5ppm、小于约4ppm、小于约3ppm、小于约2ppm或小于约1ppm。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，聚集蛋白质的量降低大于约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。聚集蛋白质的量可降低约10％至99％、30％至95％、30％至99％、50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％至99％中的任一者。聚集蛋白质的量可降低约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％中的任一者。在一些实施例中，该降低通过将自纯化步骤回收的组合物中聚集蛋白质(例如hmw蛋白质)的量与纯化步骤之前组合物中聚集蛋白质(例如hmw蛋白质)的量相比较来测定。
[0221]
细胞培养基组分指存在于细胞培养基中的组分。细胞培养基可为收获细胞时的细胞培养基。在一些实施例中，细胞培养基组分为庆大霉素。庆大霉素的量可通过elisa测量。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，细胞培养基组分的量降低大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％中的任一者。细胞培养基组分的量可降低约10％至99％、30％至95％、30％至99％、50％至95％、50％至99％、75％至99％或85％至99％中的任一者。在一些实施例中，细胞培养基组分的量降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％中的任一者。在一些实施例中，该降低通过将自纯化步骤回收的组合物中细胞培养基组分的量与纯化步骤之前组合物中细胞培养基组分的量相比较来测定。
[0222]
用于检测污染物的方法
[0223]
本发明提供用于评估清洁可再使用的层析材料的有效性的方法。例如，通过上文所描述的本发明方法清洁先前已加载并且洗脱至少一次的多肽的层析材料。接着对材料进行模拟洗脱，其中在清洁程序之后未将额外的多肽加载于材料上。模拟洗脱可跟在先前加载于材料上的多肽所使用的洗脱程序之后或洗脱程序可跟在用于将在清洁程序之后纯化的多肽的洗脱程序之后。在一些实施例中，在模拟洗脱之前对材料进行模拟加载。模拟加载使用与将多肽加载于材料上相同的程序，只是该加载中不包括多肽。在一些实施例中，将来自模拟洗脱的洗脱物收集于一种或多种级分中。在一些实施例中，将模拟洗脱的洗脱物收集于单一级分中。在一些实施例中，针对包括来自先前加载的层析材料的遗留多肽的污染物、igg片段、浸出蛋白质a、chop和cho dna，对洗脱物或洗脱物的样品进行分析。
[0224]
多肽定量
[0225]
多肽(诸如单克隆抗体(mab))的浓度可使用uv-可见分光光度计(8453型号g1103a；agilent technologies；santa clara,ca,u.s.a.)或nanodrop
tm 1000型号nd-1000
(thermo fisher scientific；waltham,ma,u.s.a.)经由280和320nm下的吸光度来测定。除先前加载于可再使用的层析材料上的多肽或加载至通过本发明的方法清洁的材料上的多肽以外的物质(亦即杂质)可能浓度太低而对uv吸光度没有可感知的影响。按需要，可将样品用适当的在0.1-1.0吸光度单位范围内的无干扰稀释剂稀释。一式两份地进行样品制备和uv测量并且记录平均值。mab吸收系数可在1.42至1.645/mg
·
ml
·
cm范围内。
[0226]
总蛋白可通过毛细管区带电泳/激光诱导荧光检测来测定。
[0227]
igg检测
[0228]
完整人igg及人igg片段可使用完整人igg特异性或igg片段特异性elisa检测。人fc可使用人fc特异性elisa检测。
[0229]
igg聚集物
[0230]
igg聚集物可使用尺寸排阻层析法检测。igg聚集物典型地大于完整igg。
[0231]
cho宿主细胞蛋白质(chop)定量
[0232]
elisa可用于对称为chop的cho宿主细胞蛋白质的含量进行定量。将抗chop抗体固定于微量滴定板孔上。将含有chop、标准物和对照的样品的稀释液在孔中培育，随后与同辣根过氧化物酶(hrp)结合的抗chop抗体一起培育。可使用邻苯二胺检测hrp酶活性，并且通过在微量滴定板读数器中在490nm下读取吸光度来对chop进行定量。基于夹心elisa的原理，过氧化物酶的浓度对应于chop浓度。elisa的分析范围典型地为5-320ng/ml，测定内变化性《10％。chop值可以单位ng/ml报告。或者，可用chop值除以多肽浓度并且可以ppm(百万分率；例如每毫克多肽中的chop奈克数)报告结果。可使用chop elisa对样品中的总chop含量进行定量，但不对个别蛋白质的浓度进行定量。
[0233]
cho dna定量
[0234]
产物样品中的cho dna可使用实时pcr(taqman pcr)定量。可首先使用qiagen的病毒仿生机器人套组(virus biorobot kit)提取来自样品和对照的dna。使用abi的序列检测系统在96孔板中使用pcr引物和探针对提取的样品、对照和标准dna进行taqman实时聚合酶链反应(pcr)。引物由灰仓鼠(cricetulus griseus)基因组中的重复dna序列的110碱基对区段限定。将探针在5'端用荧光报告基团染料标记并且在3'端用淬灭基团染料标记。当探针完整时，报告基团的发射光谱受到淬灭基团的抑制。聚合酶的5'核酸酶活性将探针水解并且释放报告基团，从而使得荧光发射增加。序列检测器对与在dna扩增期间连续测量的荧光发射增加成正比的扩增产物进行定量。针对标准曲线计算dna已扩增超过临限值的循环数目(ct)。可产生在1pg/ml-10,000pg/ml范围内的标准曲线，将其用于对样品中的dna进行定量。
[0235]
浸出蛋白质a定量
[0236]
蛋白质a汇集物中浸出蛋白质a的含量可通过夹心蛋白质a elisa来测定。将鸡抗葡萄球菌蛋白a抗体固定于微量滴定板孔上。样品处理程序可包括在夹心elisa上运行样品之前进行样品稀释以及使用微波辅助加热作为预处理步骤解离蛋白质a/igg复合物。若蛋白质a存在于样品中，则可结合于经包被的抗体。所结合的蛋白质a使用辣根过氧化物酶结合的抗蛋白质抗体来检测。辣根过氧化物酶酶活性使用产生比色信号的双组分tmb受质溶液来定量。
[0237]
多肽
[0238]
本发明的方法可用于清洁用于多种多肽的纯化中的层析材料。在一些实施例中，层析材料大规模地使用；例如在多肽(诸如抗体或其片段)的制造规模制备中使用。在一些实施例中，层析材料用于第一多肽(诸如第一抗体)的纯化中，接着将该材料通过本发明的方法进行清洁，并且接着层析材料可用于纯化第二多肽，诸如第二抗体。在一些实施例中，清洁为有效的，使得包含第二纯化多肽的制剂基本上不含第一多肽。在一些实施例中，包含第二纯化多肽(例如第二抗体)的制剂包含小于1ppm的第一多肽(例如第一抗体)。在一些实施例中，第二纯化多肽包含小于1ppm、2ppm、3ppm、4ppm、5ppm、10ppm、20ppm、30ppm、40ppm、50ppm或100ppm中的任一者的第一多肽。
[0239]
在一些实施例中，本发明的方法用于再使用用于纯化治疗性多肽的层析材料。在一些实施例中，多肽为拮抗剂。在一些实施例中，多肽为激动剂。在一些实施例中，多肽为抗体。在一些实施例中，多肽为抗原决定基经标记的。在一些实施例中，多肽保留生物和/或免疫活性。在一些实施例中，多肽为拮抗剂。在一些实施例中，多肽起始补体依赖性细胞毒性。在一些实施例中，多肽为抗体或免疫粘附素。
[0240]
在一些实施例中，多肽(第一多肽和/或第二多肽)具有大于约5,000道耳顿、10,000道耳顿、15,000道耳顿、25,000道耳顿、50,000道耳顿、75,000道耳顿、100,000道耳顿、125,000道耳顿或150,000道耳顿中的任一者的分子量。多肽可具有约50,000道耳顿至200,000道耳顿或100,000道耳顿至200,000道耳顿中的任一者的分子量。或者，用于本文中的用途的多肽可具有约120,000道耳顿或约25,000道耳顿的分子量。
[0241]
pi为等电点并且为特定分子或分子表面不带净电荷时的ph。在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，多肽(例如第一多肽和/或第二多肽)的pi可为约6至10、7至9或8至9中的任一者。在一些实施例中，多肽具有约6、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10中的任一者的pi。
[0242]
要使用通过本文所描述的方法清洁的可再使用的层析材料纯化的多肽通常使用重组技术产生。用于产生重组蛋白的方法描述于例如美国专利号5,534,615和4,816,567中，这些专利特定地以引用的方式并入本文中。在一些实施例中，目标蛋白质在cho细胞中产生(参见例如wo94/11026)。当使用重组技术时，多肽可在细胞内、在周质间隙中产生或直接地分泌至培养基中。
[0243]
要使用通过本文所描述的方法清洁的可再使用的层析材料纯化的多肽可回收自培养基或来自宿主细胞溶解产物。可通过各种物理或化学方法(诸如冻融循环、超音处理、机械破碎或细胞溶解剂)将用于表达多肽的细胞破碎。若在细胞内产生多肽，则作为第一步骤，例如通过离心或超滤去除微粒碎屑，亦即宿主细胞或溶解片段。carter等人，bio/technology 10:163-167(1992)描述用于分离分泌至大肠杆菌的周质间隙的多肽的程序。简言之，在存在乙酸钠(ph 3.5)、edta和苯基甲基磺酰氟(pmsf)的情况下经约30min将细胞浆解冻。可通过离心去除细胞碎片。在多肽分泌至培养基中的情况下，通常首先使用市售多肽浓缩过滤器(例如或millipore超滤单元)将来自此类表达系统的上清液浓缩。可将诸如pmsf的蛋白酶抑制剂包括于前述步骤中的任一者中以抑制蛋白水解并且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。
[0244]
可使用通过本文所描述的方法清洁的可再使用的层析材料纯化的多肽的实例包括但不限于免疫球蛋白、免疫粘附素、抗体、酶、激素、融合蛋白、含fc蛋白质、免疫缀合物、
细胞因子和白细胞介素。多肽的实例包括但不限于哺乳动物蛋白质，诸如肾素；激素；生长激素，包括人生长激素及牛生长激素；生长激素释放因子；副甲状腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素a-链；胰岛素b-链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；促黄体生成激素；胰高血糖素；凝血因子，诸如因子viiic、因子ix、组织因子和冯
·
威利布兰德因子(von willebrands factor)；抗凝血因子，诸如蛋白质c；心房利钠因子；肺表面活性剂；纤维蛋白溶酶原活化剂，诸如尿激酶或人尿液或组织型纤维蛋白溶酶原活化剂(t-pa)；铃蟾素；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；脑啡肽酶；rantes(活化后通常调控t细胞表达和分泌)；人巨噬细胞炎性蛋白质(mip-1-α)；血清白蛋白，诸如人血清白蛋白；缪勒管抑制物质(muellerian-inhibiting substance)；松弛肽a-链；松弛肽b-链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；酶；微生物蛋白质，诸如β-内酰胺酶；dna酶；ige；细胞毒性t-淋巴细胞相关抗原(ctla)，诸如ctla-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(vegf)；激素或生长因子的受体；蛋白质a或d；类风湿因子；神经营养因子，诸如骨骼源性神经营养因子(bdnf)、神经营养素-3、神经营养素-4、神经营养素-5或神经营养素-6(nt-3、nt-4、nt-5或nt-6)或神经生长因子，诸如ngf-b；血小板源性生长因子(pdgf)；纤维母细胞生长因子，诸如afgf和bfgf；表皮生长因子(egf)；转型生长因子(tgf)，诸如tgf-α和tgf-β，包括tgf-β1、tgf-β2、tgf-β3、tgf-β4或tgf-β5；胰岛素样生长因子-i及胰岛素样生长因子-ii(igf-i和igf-ii)；des(1-3)-igf-i(脑igf-i)、胰岛素样生长因子结合蛋白(igfbp)；细胞因子；cd蛋白质，诸如cd3、cd4、cd8、cd19和cd20；红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；融合多肽，亦即包含两种或更多种异源多肽或其片段并且由重组核酸编码的多肽；含fc多肽，例如包含融合至第二多肽的免疫球蛋白fc区或其片段的融合蛋白；免疫缀合物；骨形态发生蛋白(bmp)；干扰素，诸如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；集落刺激因子(csf)，例如m-csf、gm-csf和g-csf；白细胞介素(il)，例如il-1至il-10；超氧化物歧化酶；t细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，诸如aids包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调控蛋白；整合素，诸如cd11a、cd11b、cd11c、cd18、icam、vla-4和vcam；肿瘤相关抗原，诸如ca125(卵巢癌抗原)或her2、her3或her4受体；免疫粘附素；及以上所列蛋白质中的任一者的片段和/或变体以及结合于蛋白质(包括例如以上所列蛋白质中的任一者)的抗体，包括抗体片段。
[0245]
抗体
[0246]
在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，可使用通过本文所描述的方法清洁的可再使用的层析材料纯化的多肽(例如第一多肽、第二多肽或任何后续多肽)为抗体。
[0247]
抗体的分子靶标包括cd蛋白质及其配体，诸如但不限于：(i)cd3、cd4、cd8、cd19、cd11a、cd20、cd22、cd34、cd40、cd79α(cd79a)和cd79β(cd79b)；(ii)erbb受体家族的成员，诸如egf受体、her2、her3或her4受体；(iii)细胞粘附分子，诸如lfa-1、mac1、p150,95、vla-4、icam-1、vcam和αv/β3整合素，包括其α或β次单元(例如抗cd11a、抗cd18或抗cd11b抗体)；(iv)生长因子，诸如vegf；ige；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖症(ob)受体；mpl受体；ctla-4；蛋白质c、br3、c-met、组织因子、β7等；以及(v)细胞表面和跨膜肿瘤相关抗原(taa)，诸如美国专利号7,521,541中描述的那些细胞表面和跨膜肿瘤相关抗原。
[0248]
其他示例性抗体包括选自但不限于以下的那些抗体：抗cd20抗体、抗cd40抗体、抗
her2抗体、抗il6抗体、抗ige抗体、抗il13抗体、抗a型流感抗体、抗tigit抗体、抗pd-l1抗体、抗vegf-a抗体、抗vegf-a/ang2抗体、抗cd79b抗体、抗st2抗体、抗因子d抗体、抗因子ix抗体、抗因子x抗体、抗aβ抗体、抗tau抗体、抗cea抗体、抗cea/cd3抗体、抗cd20/cd3抗体、抗fcrh5/cd3抗体、抗her2/cd3抗体、抗fgfr1/klb抗体、fap-4-1bbl融合蛋白、fap-il2v融合蛋白、抗雌激素受体抗体、抗孕激素受体抗体、抗p53抗体、抗egfr抗体、抗组织蛋白酶d抗体、抗bcl-2抗体、抗e-钙粘蛋白抗体、抗ca125抗体、抗ca15-3抗体、抗ca19-9抗体、抗c-erbb-2抗体、抗p-糖蛋白抗体、抗cea抗体、抗视网膜母细胞瘤蛋白抗体、抗ras致癌蛋白抗体、抗刘易斯x抗体(anti-lewis x antibody)、抗ki-67抗体、抗pcna抗体、抗cd3抗体、抗cd4抗体、抗cd5抗体、抗cd7抗体、抗cd8抗体、抗cd9/p24抗体、抗cd10抗体、抗cd11a抗体、抗cd11c抗体、抗cd13抗体、抗cd14抗体、抗cd15抗体、抗cd19抗体、抗cd22抗体、抗cd23抗体、抗cd30抗体、抗cd31抗体、抗cd33抗体、抗cd34抗体、抗cd35抗体、抗cd38抗体、抗cd41抗体、抗lca/cd45抗体、抗cd45ro抗体、抗cd45ra抗体、抗cd39抗体、抗cd100抗体、抗cd95/fas抗体、抗cd99抗体、抗cd106抗体、抗泛素抗体、抗cd71抗体、抗c-myc抗体、抗细胞角蛋白抗体、抗波形蛋白抗体、抗hpv蛋白抗体、抗κ轻链抗体、抗λ轻链抗体、抗黑素体抗体、抗前列腺特异性抗原抗体、抗s-100抗体、抗tau抗原抗体、抗纤维蛋白抗体、抗角蛋白抗体和抗tn抗原抗体。在一些实施例中，抗体选自由以下项组成的组：奥瑞珠单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、托珠单抗、法立昔单抗、泊洛妥珠单抗、甘特珠单抗、赛必妥单抗、克瑞珠单抗、莫苏尼妥珠单抗、替瑞利尤单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗、阿特珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、兰帕珠单抗、来金珠单抗、奥马珠单抗、兰尼单抗、艾美赛珠单抗、塞鲁单抗、普拉辛珠单抗、ro6874281和ro7122290。
[0249]
多克隆抗体
[0250]
在一些实施例中，抗体为多克隆抗体。优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂在动物中产生多克隆抗体。使用双功能剂或衍生剂(例如顺丁烯二酰亚氨基苯甲酰基磺基丁二酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基结合)、n-羟基丁二酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、丁二酸酐、socl2或r1n＝c＝nr，其中r和r1为不同烷基)使相关抗原结合至在所要免疫的物种中具免疫原性的多肽(例如钥孔戚血蓝素、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)可为有用的。
[0251]
通过将例如100μg或5μg的多肽或缀合物(分别针对兔或小鼠)与3体积的弗氏完全佐剂(freund's complete adjuvant)组合并且在多个位点皮内注射溶液来使动物对抗原、免疫原性缀合物或衍生物免疫。一个月后，通过在多个位点皮下注射用含1/5至1/10原始量的肽或缀合物的弗氏完全佐剂对动物进行加强免疫。七至14天后，对动物进行放血并且针对抗体效价对血清进行分析。对动物进行加强免疫直至效价平台期。在一些实施例中，用抗原相同但与不同多肽和/或通过不同交联试剂结合的缀合物对动物进行加强免疫。缀合物还可在重组细胞培养中作为多肽融合物而制得。另外，适当使用聚集剂(诸如明矾)来增强免疫反应。
[0252]
单克隆抗体
[0253]
在一些实施例中，在通过本发明的方法清洁的可再使用的层析材料上纯化的抗体为单克隆抗体。单克隆抗体获自基本上均质的抗体群体，亦即构成群体的个别抗体为相同的和/或结合相同抗原决定基。除了在单克隆抗体的制备期间产生的可能的变体，此类变体
通常以微小量存在。因此，修饰语“单克隆”指示抗体不为离散或多克隆抗体的混合物的特征。
[0254]
例如，单克隆抗体可使用由kohler等人,nature 256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组dna方法制备(美国专利号4,816,567)。
[0255]
在杂交瘤方法中，如本文所描述对小鼠或其他适当的宿主动物(诸如仓鼠)进行免疫以使得淋巴细胞产生或能够产生将特异性结合于用于免疫的多肽的抗体。可替代地，可在体外对淋巴细胞进行免疫。接着，使用适合融合剂(诸如聚乙二醇)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(goding,monoclonal antibodies:principles and practice,第59-103页(academic press,1986))。
[0256]
将因此制备的杂交瘤细胞接种并且使其在适合的培养基中生长，该适合的培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(hgprt或hprt)，则用于杂交瘤的培养基典型地将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(hat培养基)，这些物质防止hgprt缺陷型细胞生长。
[0257]
在一些实施例中，骨髓瘤细胞为高效融合、支持所选抗体产生细胞稳定高水平产生抗体并且对诸如hat培养基的培养基敏感的那些骨髓瘤细胞。其中，在一些实施例中，骨髓瘤细胞系为鼠骨髓瘤细胞系，诸如可购自索尔克研究所细胞分配中心(salk institute cell distribution center,sandiego,california usa)的源自mopc-21和mpc-11小鼠肿瘤的那些鼠骨髓瘤细胞系，以及可购自美国典型培养物保藏中心(american type culture collection,rockville,maryland usa)的sp-2或x63-ag8-653细胞。还描述人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系用于制备人单克隆抗体(kozbor,j.immunol.133:3001(1984)；brodeur等人，monoclonal antibody production techniques and applications第51-63页(marcel dekker,inc.,new york,1987))。
[0258]
测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。在一些实施例中，通过免疫沉淀或通过体外结合测定(诸如放射免疫测定(ria)或酶联免疫吸附测定(elisa))确定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。
[0259]
单克隆抗体的结合亲和力可例如通过munson等人,anal.biochem.107:220(1980)的斯卡查德分析(scatchard analysis)来确定。
[0260]
在将杂交瘤细胞鉴定为产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体之后，可通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆并且通过标准方法使其生长(goding,monoclonal antibodies:principles and practice第59-103页(academic press,1986))。适合用于此目的的培养基包括例如d-mem或rpmi-1640培养基。此外，可使杂交瘤细胞作为腹水肿瘤在动物中在体内生长。
[0261]
通过诸如多肽a-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、渗析或亲和层析的常规免疫球蛋白纯化程序将由亚克隆分泌的单克隆抗体适当地与培养基、腹水流体或血清分离。
[0262]
编码单克隆抗体的dna容易分离并且使用常规程序测序(例如通过使用能够特异性结合于编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。在一些实施例中，杂交瘤细胞充当此类dna的来源。在分离后，可将dna放入表达载体中，接着将其转染至原本不产生免疫球蛋白多肽的诸如大肠杆菌细胞、猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或骨髓瘤细胞的宿
主细胞中，以获得单克隆抗体在重组宿主细胞中的合成。关于在具有编码抗体的dna的细菌中重组表达的综述文章包括skerra等人,curr.opinion in immunol.5:256-262(1993)和pl
ü
ckthun,immunol.revs.,130:151-188(1992)。
[0263]
在另一实施例中，可自使用mccafferty等人,nature 348:552-554(1990)中所描述的技术产生的抗体噬菌体文库分离抗体或抗体片段。clackson等人,nature 352:624-628(1991)和marks等人,j.mol.biol.222:581-597(1991)分别描述使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续的出版物描述通过链改组(marks等人,bio/technology 10:779-783(1992))以及组合感染和体内重组作为用于构建极大噬菌体文库的策略(waterhouse等人,nuc.acids.res.21:2265-2266(1993))来产生高亲和力(nm范围)人抗体。因此，这些技术为用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方案。
[0264]
还可例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列取代同源鼠序列(美国专利号4,816,567；morrison等人,proc.natl acad.sci.usa 81:6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的所有或部分编码序列共价连接至免疫球蛋白编码序列对dna进行修饰。
[0265]
典型地，使此类非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域，或使其取代抗体的一个抗原组合位点的可变结构域以形成嵌合二价抗体，该嵌合二价抗体包含对抗原具有特异性的一个抗原组合位点和对不同抗原具有特异性的另一抗原组合位点。
[0266]
在本文所描述的方法中的任一者的一些实施例中，抗体为iga、igd、ige、igg或igm。在一些实施例中，抗体为igg单克隆抗体。
[0267]
人源化抗体
[0268]
在一些实施例中，抗体为人源化抗体。本技术领域中已描述用于人源化非人抗体的方法。在一些实施例中，人源化抗体具有自非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，其典型地取自“输入”可变结构域。人源化可基本上遵循winter及同事(jones等人,nature 321:522-525(1986)；riechmann等人,nature332:323-327(1988)；verhoeyen等人,science 239:1534-1536(1988))的方法，通过用高变区序列取代人抗体的对应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体为嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上不够完整的人可变结构域已由来自非人物种的对应序列取代。在实践中，人源化抗体典型地为其中一些高变区残基和可能一些fr残基由来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基取代的人抗体。
[0269]
选择人可变结构域(轻与重)用于制备人源化抗体对于降低抗原性而言为非常重要的。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库对啮齿动物抗体的可变结构域的序列进行筛选。接着将最接近啮齿动物序列的人序列当作人源化抗体的人构架区(fr)(sims等人,j.immunol.151:2296(1993)；chothia等人,j.mol.biol.196:901(1987))。另一方法使用自轻链或重链可变区的特定亚组的所有人抗体的共同序列衍生的特定构架区。相同构架可用于若干不同人源化抗体(carter等人,proc.natl.acad.sci.usa 89:4285(1992)；presta等人,j.immunol.151:2623(1993))。
[0270]
进一步重要的是，抗体经人源化并且保留对抗原的高亲和力和其他有利生物特性。为实现此目标，在这些方法的一些实施例中，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常为可获得的并且为熟习本技术领域者所熟悉。说明和展示所选候选免疫球蛋白序列的可能的
三维构象结构的计算机程序为可获得的。对这些展示的检查容许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能的作用，亦即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，可选择和组合来自接受者和输入序列的fr残基使得实现所需抗体特征，诸如对靶标抗原的亲和力增加。一般而言，高变区残基直接地并且最实质性地参与影响抗原结合。
[0271]
人抗体
[0272]
在一些实施例中，抗体为人抗体。作为人源化的替代方案，可产生人抗体。例如，现在有可能产生在免疫后能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况下产生完整人抗体谱的转基因动物(例如小鼠)。例如，已描述在嵌合和种系突变体小鼠中抗体重链连接区域(jh)基因的纯合子缺失引起内源性抗体产生的完全抑制。此类种系突变体小鼠中人种系免疫球蛋白基因阵列的转移将使得在抗原攻击后产生人抗体。参见例如jakobovits等人,proc.natl.acad.sci.usa 90:2551(1993)；jakobovits等人,nature 362:255-258(1993)；bruggermann等人,year in immuno.7:33(1993)；以及美国专利号5,591,669；5,589,369；和5,545,807。
[0273]
可替代地，噬菌体展示技术(mccafferty等人,nature 348:552-553(1990))可用于在体外由来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(v)结构域基因谱产生人抗体和抗体片段。根据此技术，将抗体v结构域基因框内克隆至丝状噬菌体的主要或次要外壳多肽基因(诸如m13或fd)中，并且作为功能抗体片段展示于噬菌体粒子的表面上。由于丝状粒子含有噬菌体基因组的单链dna拷贝，基于抗体的功能特性进行的选择还产生对编码展现那些特性的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟b细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种模式进行；其综述参见例如johnson,kevin s.和chiswell,david j.,current opinion in structural biology 3:564-571(1993)。v-基因区段的若干来源可用于噬菌体展示。clackson等人,nature 352:624-628(1991)自衍生自经免疫小鼠的脾脏的v基因的小随机组合文库分离多种抗噁唑酮抗体。可构建来自未免疫人供体的v基因谱并且可基本上遵循marks等人,j.mol.biol.222:581-597(1991)或griffith等人,embo j.12:725-734(1993)所描述的技术分离针对多种抗原(包括自体抗原)的抗体。还参见美国专利号5,565,332和5,573,905。
[0274]
人抗体还可由体外活化的b细胞产生(参见美国专利5,567,610和5,229,275)。
[0275]
抗体片段
[0276]
在一些实施例中，抗体为抗体片段。已开发各种技术用于产生抗体片段。传统地，经由完整抗体的蛋白水解消化来衍生这些片段(参见例如morimoto等人,journal of biochemical and biophysical methods 24:107-117(1992)和brennan等人,science 229:81(1985))。然而，这些片段现可直接由重组宿主细胞产生。例如，抗体片段可分离自上文论述的抗体噬菌体文库。可替代地，fab'-sh片段可直接自大肠杆菌回收并且化学偶合以形成f(ab')2片段(carter等人,bio/technology 10:163-167(1992))。根据另一方法，f(ab')2片段可直接自重组宿主细胞培养物分离。用于产生抗体片段的其他技术对熟练从业者而言将为显而易见的。在其他实施例中，选择的抗体为单链fv片段(scfv)。参见wo 93/16185；美国专利号5,571,894；以及美国专利号5,587,458。例如，抗体片段还可为“线性抗体”，例如如美国专利5,641,870中所描述。此类线性抗体片段可为单特异性或双特异性。
[0277]
在一些实施例中，提供本文所描述的抗体的片段。在一些实施例中，抗体片段为抗原结合片段。在一些实施例中，抗原结合片段选自由以下项组成的组：fab片段、fab'片段、f
(ab’)2片段、scfv、二scfv、双scfv、串联(二、三)-scfv、fv、sdab、三功能抗体、bite、双体抗体和三体抗体。
[0278]
双特异性抗体
[0279]
在一些实施例中，抗体为双特异性抗体。双特异性抗体为对至少两种不同抗原决定基具有结合特异性的抗体。示例性双特异性抗体可结合于两种不同抗原决定基。可替代地，双特异性抗体结合臂可与结合于白细胞上的触发分子(诸如t细胞受体分子(例如cd2或cd3))或igg的fc受体(fcγr)(诸如fcγri(cd64)、fcγrii(cd32)和fcγriii(cd16))的臂组合以便使细胞防御机制集中于该细胞。双特异性抗体可经制备呈全长抗体或抗体片段(例如f(ab')2双特异性抗体)形式。
[0280]
用于制备双特异性抗体的方法为本技术领域中已知的。传统的全长双特异性抗体产生为基于两个免疫球蛋白重链轻链对的共表达，其中两条链具有不同特异性(millstein等人,nature 305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四体瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中仅一种具有恰当的双特异性结构。恰当分子的纯化通常通过亲和层析步骤进行，相当繁琐，并且产物产率低。类似程序公开于wo 93/08829中和traunecker等人,embo j.,10:3655-3659(1991)中。
[0281]
根据不同方法，使具有所需结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域融合至免疫球蛋白恒定结构域序列。在一些实施例中，融合为与免疫球蛋白重链恒定结构域融合，包含铰链的至少一部分、ch2和ch3区。在一些实施例中，含有轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(ch1)存在于融合物中的至少一者中。将编码免疫球蛋白重链融合物和(若需要)免疫球蛋白轻链的dna插入单独的表达载体，并且共转染至适合的宿主有机体中。在当构建中使用的不相等比率的三个多肽链时提供最佳产率的实施例中，此在调节三个多肽片段的相互比例中提供极大挠性。然而，当相等比率的至少两个多肽链的表达产生高产率时或当比率不具有特定显著性时，可能将三个多肽链中的两者或全部的编码序列插入一个表达载体中。
[0282]
在此方法的一些实施例中，双特异性抗体由一条臂中的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现此非对称结构促进所需双特异性化合物自不希望的免疫球蛋白链组合中分离，因为仅一半的双特异性分子中存在免疫球蛋白轻链提供简易分离方式。此方法公开于wo 94/04690中。关于产生双特异性抗体的其他细节参见例如suresh等人,methods in enzymology 121:210(1986)。
[0283]
根据美国专利号5,731,168中所描述的另一方法，可将一对抗体分子之间的界面工程化以使自重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。在一些实施例中，界面包含抗体恒定结构域的ch3结构域的至少一部分。在此方法中，第一抗体分子的界面的一个或多个小氨基酸侧链经较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)置换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换在第二抗体分子的界面上形成大小与大侧链相同或类似的补偿性“空腔”。此提供用于相较于其他不希望的制成品(诸如同二聚体)增加异二聚体的产率的机制。
[0284]
双特异性抗体包括交联或“异源缀合”抗体。例如，异源缀合物中的抗体中的一者可偶合至亲和素，另一者偶合至生物素。已例如提出此类抗体使免疫系统细胞靶向不希望
的细胞(美国专利号4,676,980)，并且用于治疗hiv感染(wo 91/00360、wo 92/200373和ep 03089)。异源缀合抗体可使用任何方便的交联方法来制备。适合的交联剂为本技术领域中熟知，并且与许多交联技术一起公开于美国专利号4,676,980中。
[0285]
用于自抗体片段产生双特异性抗体的技术还已描述于文献中。例如，双特异性抗体可使用化学键联来制备。brennan等人,science 229:81(1985)描述将完整抗体蛋白水解裂解以产生f(ab')2片段的程序。此等片段在存在二硫醇复合剂亚砷酸钠的情况下经还原以使邻近的二硫醇稳定并且防止分子间二硫化物形成。所产生的fab'片段接着转化为硫代硝基苯甲酸酯(tnb)衍生物。接着通过用巯基乙胺还原将fab'-tnb衍生物中的一者再转化为fab'-硫醇并且与等莫耳量的另一fab'-tnb衍生物混合以形成双特异性抗体。所产生的双特异性抗体可用作用于酶的选择性固定的剂。
[0286]
此外已描述用于直接自重组细胞培养物制备和分离双特异性抗体片段的各种技术。例如，已使用亮氨酸拉链产生双特异性抗体。kostelny等人,j.immunol.148(5):1547-1553(1992)。通过基因融合将来自fos和jun蛋白的亮氨酸拉链肽连接至两种不同抗体的fab'部分。在铰链区将抗体同二聚体还原以形成单体并且接着再氧化以形成抗体异二聚体。还可利用此方法来制备抗体同二聚体。hollinger等人,proc.natl.acad.sci.usa 90:6444-6448(1993)描述的“双体抗体”技术提供用于制备双特异性抗体片段的替代机制。片段包含通过连接子连接至轻链可变结构域(v
l
)的重链可变结构域(vh)，该连接子过短而不允许相同链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的vh和v
l
结构域被迫与另一片段的互补v
l
和vh结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。此外已报道通过使用单链fv(sfv)二聚体来制备双特异性抗体片段的另一策略。参见gruber等人,j.immunol.152:5368(1994)。
[0287]
涵盖超过二价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。tutt等人,j.immunol.147:60(1991)。
[0288]
多价抗体
[0289]
在一些实施例中，抗体为多价抗体。多价抗体可比二价抗体更快地由表达与抗体结合的抗原的细胞内化(和/或异化)。本文所提供的抗体可为具有三个或更多个抗原结合位点的多价抗体(其不属于igm类别)(例如四价抗体)，其可通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而容易地产生。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多个抗原结合位点。优选二聚化结构域包含fc区或铰链区(或由其组成)。在此情况下，抗体将包含fc区和fc区氨基端的三个或更多个抗原结合位点。本文中的优选多价抗体包含三个至约八个，但优选四个抗原结合位点(或由其组成)。多价抗体包含至少一条多肽链(并且优选两条多肽链)，其中多肽链包含两个或更多个可变结构域。例如，多肽链可包含vd1-(x1)n-vd2-(x2)n-fc，其中vd1为第一可变结构域，vd2为第二可变结构域，fc为fc区的一条多肽链，x1和x2表示氨基酸或多肽，并且n为0或1。例如，多肽链可包含：vh-ch1-柔性连接子-vh-ch1-fc区链；或vh-ch1-vh-ch1-fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两个(并且优选四个)轻链可变结构域多肽。本文中的多价抗体可例如包含约两个至约八个轻链可变结构域多肽。在此涵盖的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域并且任选进一步包含cl结构域。
[0290]
在一些实施例中，抗体为多特异性抗体。多特异性抗体的实例包括但不限于包含重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(v
l
)并且其中v
hvl
单元具有多抗原决定基特异性的抗体、具有两个或更多个v
l
和vh结构域并且各v
hvl
单元结合于不同抗原决定基的抗体、具有
两个或更多个单一可变结构域并且各单一可变结构域结合于不同抗原决定基的抗体、全长抗体、抗体片段，诸如fab、fv、dsfv、scfv、双体抗体、双特异性双体抗体、三体抗体、三功能抗体、已共价或非共价连接的抗体片段。在一些实施例中，抗体具有多抗原决定基特异性；例如特异性结合于相同或不同靶标上的两种或更多种不同抗原决定基的能力。在一些实施例中，抗体为单特异性的；例如仅结合一种抗原决定基的抗体。根据一个实施例，多特异性抗体为以5μm至0.001pm、3μm至0.001pm、1μm至0.001pm、0.5μm至0.001pm或0.1μm至0.001pm的亲和力结合于各抗原决定基的igg抗体。
[0291]
其他抗体修饰
[0292]
可能需要关于效应子功能对本文所提供的抗体进行修饰，例如以便增强抗体的抗原依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和/或补体依赖性细胞毒性(cdc)。此可通过在抗体的fc区中引入一个或多个氨基酸取代来实现。可替代地或另外地，可将半胱氨酸残基引入fc区，由此允许此区域中的链间二硫键形成。由此产生的同二聚抗体可具有改良的内化能力和/或增加的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞毒性(adcc)。参见caron等人,j.exp med.176:1191-1195(1992)和shopes,b.j.,immunol.148:2918-2922(1992)。还可如wolff等人,cancer research 53:2560-2565(1993)中所描述使用异双官能交联剂制备具有增强的抗肿瘤活性的同二聚抗体。可替代地，抗体可经工程化从而具有双fc区并且可由此具有增强的补体介导的溶解和adcc能力。参见stevenson等人,anti-cancer drug design 3:219-230(1989)。
[0293]
为增加抗体的血清半衰期，可如us 2006/0067930中所描述在抗体中作出氨基酸改变，该专利特此以全文引用的方式并入。
[0294]
多肽变体和修饰
[0295]
本文所描述的多肽(包括抗体)的氨基酸序列修饰可用于通过本文所描述的方法清洁的可再使用的层析材料中。
[0296]
变体多肽
[0297]“多肽变体”意指如本文所定义与多肽的全长天然序列、缺乏信号肽的多肽序列、多肽的细胞外结构域(在存在或不存在信号肽的情况下)具有至少约80％氨基酸序列一致性的多肽，优选为活性多肽。此类多肽变体包括例如在全长天然氨基酸序列的n或c端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。一般地，tat多肽变体将与全长天然序列多肽序列、缺乏信号肽的多肽序列、多肽的细胞外结构域(在存在或不存在信号肽的情况下)具有至少约80％氨基酸序列一致性或者至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列一致性中的任一者。任选地，变体多肽与天然多肽序列相比将具有不超过一个保守氨基酸取代，可替代地与天然多肽序列相比具有不超过约2、3、4、5、6、7、8、9或10个保守氨基酸取代中的任一者。
[0298]
变体多肽例如当与全长天然多肽相比时可在n端或c端截短，或可缺乏内部残基。某些变体多肽可缺乏并非所需生物活性所必需的氨基酸残基。此等具有截短、缺失及插入的变体多肽可通过许多常规技术中的任一者来制备。所需变体多肽可为化学合成的。另一适合的技术涉及分离和通过聚合酶链反应(pcr)扩增编码所需变体多肽的核酸片段。在pcr中在5'和3'引物处采用确定核酸片段的所需端的寡核苷酸。优选地，变体多肽与本文所公开的天然多肽共同拥有至少一种生物和/或免疫活性。
[0299]
氨基酸序列插入包括长度在一个残基至含有一百或更多个残基的多肽范围内的氨基未端和/或羧基未端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有n端甲硫氨酰基残基的抗体或融合至细胞毒性多肽的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的n端或c端融合至增加抗体的血清半衰期的酶或多肽。
[0300]
例如，可能需要改良多肽的结合亲和力和/或其他生物特性。多肽的氨基酸序列变体通过将适当核苷酸变化引入抗体核酸或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如多肽的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。进行缺失、插入及取代的任何组合以得到最终构建体，前提条件为最终构建体具有所需特征。氨基酸变化还可改变多肽(例如抗体)的转译后过程，诸如改变糖基化位点的数目或位置。
[0301]
可通过将多肽的序列与同源已知多肽分子的序列相比较以及使高同源性区域中形成的氨基酸序列变化的数目最小化找到确定哪些氨基酸残基可插入、取代或缺失而不会不利地影响所需活性的指导。
[0302]
可用于鉴定对于诱变为优选位置的多肽(例如抗体)的某些残基或区域的方法如cunningham和wells,science 244:1081-1085(1989)所描述称为“丙氨酸扫描诱变”。在此，鉴定残基或目标残基群(例如带电荷的残基，诸如arg、asp、his、lys和glu)并且由中性或带负电荷的氨基酸(最佳为丙氨酸或聚丙氨酸)置换以影响氨基酸与抗原的相互作用。接着通过在取代位点处或针对取代位点引入另外的或其他变体对那些对取代展示功能灵敏性的氨基酸位置进行改进。因此，虽然用于引入氨基酸序列变化的位点为预定的，但突变本身的性质不需要为预定的。例如，为分析给定位点处的突变的效能，在目标密码子或区域处进行ala扫描或随机诱变并且针对所需活性对表达的抗体变体进行筛选。
[0303]
另一类型的变体为氨基酸取代变体。此等变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基由不同残基置换。最令人关注的用于取代诱变的位点包括高变区，但也涵盖fr改变。保守取代显示于下表1中的标题“优选取代”下。若此类取代引起生物活性变化，则可引入在表1中命名为“示例性取代”或如下文关于氨基酸类别进一步描述的更实质性的变化，并且对产物进行筛选。
[0304]
表1.示例性氨基酸取代
[0305]
[0306][0307]
对多肽的生物特性的实质性修饰通过选择对维持(a)在取代区域内的多肽骨架的结构，例如呈折叠或螺旋构象，(b)在目标位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链体积的影响显著不同的取代来实现。可根据侧链特性的相似性对氨基酸进行分组(a.l.lehninger,biochemistry第二版,第73-75页,worth publishers,new york(1975))：
[0308]
(1)非极性：ala(a)、val(v)、leu(l)、ile(i)、pro(p)、phe(f)、trp(w)、met(m)
[0309]
(2)不带电荷极性：gly(g)、ser(s)、thr(t)、cys(c)、tyr(y)、asn(n)、gln(q)
[0310]
(3)酸性：asp(d)、glu(e)
[0311]
(4)碱性：lys(k)、arg(r)、his(h)
[0312]
可替代地，可基于共同侧链特性将天然存在的残基分组：
[0313]
(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
[0314]
(2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；
[0315]
(3)酸性：asp、glu；
[0316]
(4)碱性：his、lys、arg；
[0317]
(5)影响链取向的残基：gly、pro；
[0318]
(6)芳族：trp、tyr、phe。
[0319]
非保守取代将需要将此等类别中的一者的成员换成另一类别。
[0320]
不参与维持抗体的适当构象的任何半胱氨酸残基也可经取代，通常经丝氨酸取代，以改良分子的氧化稳定性并且防止异常交联。相反地，可将半胱氨酸键添加至多肽中以改良其稳定性(尤其在抗体为诸如fv片段的抗体片段的情况下)。
[0321]
特别优选类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如人源化抗体)的一个或多个高变区残基。通常，经选择用于进一步研发的所得变体将相对于产生它们的母体抗体具有改良的生物特性。方便用于产生此类取代变体的方式涉及使用噬菌体展示实现亲和力成熟。简言之，使若干高变区位点(例如6-7个位点)突变以在各位点处产生所有可能的氨基取代。
由此产生的抗体变体由丝状噬菌体粒子以单价方式展示为与包装于各粒子内的m13的基因iii产物的融合物。接着如本文所公开针对生物活性(例如结合亲和力)对噬菌体展示变体进行筛选。为鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行丙氨酸扫描诱变以鉴定显著有助于抗原结合的高变区残基。可替代地或另外地，分析抗原-抗体复合物地晶体结构以鉴定抗体与靶标之间的接触点可为有益的。根据本文详细描述地技术，此类接触残基和相邻残基为用于取代的候选者。在产生此类变体后，如本文所描述对变体组进行筛选并且可选择在一个或多个相关测定中具有优良特性的抗体用于进一步研发。
[0322]
多肽的另一类型的氨基酸变体改变抗体的原始糖基化模式。多肽可包含非氨基酸部分。例如，多肽可为糖基化的。此类糖基化可天然地发生在多肽在宿主细胞或宿主有机体中表达期间，或可为由人干预产生的有意进行的修饰。改变意指缺失存在于多肽中的一个或多个碳水化合物部分，和/或添加不存在于多肽中的一个或多个糖基化位点。
[0323]
多肽的糖基化典型地为n-连接或o-连接的。n-连接的指碳水化合物部分连接至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-x-丝氨酸和天冬酰胺-x-苏氨酸(其中x为除脯氨酸外的任何氨基酸)为用于使碳水化合物部分酶连接至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中存在这些三肽序列中的任一者形成潜在糖基化位点。o-连接的糖基化指糖n-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者连接至羟基氨基酸，最通常为丝氨酸或苏氨酸，不过也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
[0324]
添加糖基化位点至多肽方便地通过改变氨基酸序列使得其含有上文所描述的三肽序列中的一者或多者来实现(对于n-连接的糖基化位点)。改变也可通过向原始抗体的序列中添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或由一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代来实现(对于o-连接的糖基化位点)。
[0325]
去除存在于多肽上的碳水化合物部分可以化学方式或酶促方式或通过编码充当糖基化靶标的氨基酸残基的密码子的突变取代来实现。多肽上的碳水化合物部分的酶裂解可通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现。
[0326]
其他修饰包括谷酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基分别脱酰胺为对应谷胺酰基和天冬胺酰基残基、脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化、n端胺的乙酰化以及任何c端羧基的酰胺化。
[0327]
嵌合多肽
[0328]
可以一方式对本文所描述的多肽进行修饰，以形成包含融合至另一异源多肽或氨基酸序列的多肽的嵌合分子。在一些实施例中，嵌合分子包含多肽与标签多肽的融合，此提供抗标签抗体可选择性结合的抗原决定基。抗原决定基标签通常放置于多肽的氨基端或羧基端。此类抗原决定基标记形式的多肽的存在可使用针对标签多肽的抗体来检测。另外，提供抗原决定基标签使多肽能够容易地通过亲和力纯化使用抗标签抗体或结合于抗原决定基标签的另一类型的亲和力基质进行纯化。
[0329]
在一替代实施例中，嵌合分子可包含多肽与免疫球蛋白或特定免疫球蛋白区域的融合。二价形式的嵌合分子称为“免疫粘附素”。
[0330]
如本文所用，术语“免疫粘附素”对将异源多肽的结合特异性与免疫球蛋白恒定结构域的效应子功能组合的抗体样分子进行命名。在结构上，免疫粘附素包含具有除抗体的抗原识别和结合位点外的所需结合特异性的氨基酸序列(亦即，为“异源”的)与免疫球蛋白
恒定结构域序列的融合。免疫粘附素分子的粘附素部分典型地为至少包含受体或配体的结合位点的连续氨基酸序列。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可获自任何免疫球蛋白，诸如igg-1、igg-2、igg-3或igg-4亚型、iga(包括iga-1和iga-2)、ige、igd或igm。
[0331]
ig融合优选包括可溶性(跨膜结构域缺失或灭活)形式的多肽取代ig分子内的至少一个可变区。在一特别优选实施例中，免疫球蛋白融合物包括igg1分子的铰链、ch2和ch3，或铰链、ch1、ch2和ch3区。
[0332]
多肽缀合物
[0333]
用于多肽调配物中的多肽可结合至细胞毒性剂，诸如化学治疗剂、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)，或放射性同位素(亦即，放射性缀合物)。
[0334]
可使用适用于产生此类缀合物的化学治疗剂。此外，可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉a链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素a链(来自铜绿假单胞菌)、篦麻毒素a链、相思豆毒素a链、蒴莲根毒素a链、α-八迭球菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(papi、papii和pap-s)、苦瓜抑制剂、麻风树毒素、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯。多种放射性核素可用于制备放射性结合的多肽。实例包括
212
bi、
131
i、
131
in、
90
y和
186
re。多肽和细胞毒性剂的缀合物使用诸如以下的多种双官能蛋白质-偶合剂来制备：n-丁二酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫酚)丙酸盐(spdp)、亚氨基硫杂环戊烷(it)、亚氨酸酯的双官能衍生物(诸如二亚胺代己二酸二甲酯hcl)、活性酯(诸如辛二酸二丁二酰亚胺酯)、醛(诸如戊二醛)、双迭氮基化合物(诸如双(对迭氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如2,6-二异氰酸甲代伸苯酯)和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，篦麻毒素免疫毒素可如vitetta等人,science 238:1098(1987)中所描述来制备。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(mx-dtpa)为用于使放射性核苷酸结合至多肽的示例性螯合剂。
[0335]
本文中还涵盖多肽以及诸如加里刹霉素(calicheamicin)、类美登素(maytansinoid)、单端孢霉烯(trichothene)和cc1065的一种或多种小分子毒素及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的缀合物。
[0336]
类美登素为有丝分裂抑制剂，其通过抑制微管蛋白聚合来起作用。美登素最初分离自东非灌木齿叶美登木(maytenus serrata)。随后，发现某些微生物也产生类美登素，诸如美登醇和c-3美登醇酯。还涵盖合成美登醇和衍生物及其类似物。存在许多本技术领域中已知用于制备多肽-类美登素缀合物的连接基团，包括例如美国专利号5,208,020中公开额那些连接基团。连接基团包括如上述专利中所公开的二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定性基团、光不稳性基团、肽酶不稳定性基团或酯酶不稳定性基团，二硫化物和硫醚基团为优选的。
[0337]
视连接类型而定，连接子可在各个位置处连接至类美登素分子。例如，酯键可通过使用常规偶合技术与羟基反应来形成。反应可发生在具有羟基的c-3位置、经羟基甲基修饰的c-14位置、经羟基修饰的c-15位置和具有羟基的c-20位置处。在一优选实施例中，键形成于美登醇或美登醇类似物的c-3位置处。
[0338]
另一目标缀合物包含结合至一个或多个加里刹霉素分子的多肽。加里刹霉素家族的抗生素能够在亚皮摩尔浓度下产生双链dna断裂。对于加里刹霉素家族的缀合物的制备，参见例如美国专利号5,712,374。可使用的加里刹霉素的结构类似物包括但不限于γ
1i
、α
2i
、α
3i
、n-乙酰基-γ
1i
、psag和θ
1i
。抗体可结合的另一抗肿瘤药物为qfa，其为一种抗叶酸剂。加里刹霉素与qfa均具有细胞内作用位点并且不容易跨越质膜。因此，这些药剂通过多肽(例如抗体)介导的内化进行的细胞摄取极大地增强其细胞毒性作用。
[0339]
可结合至本文所描述的多肽的其他抗肿瘤剂包括bcnu、链脲菌素、长春新碱和5-氟尿嘧啶、已知统称为ll-e33288复合物的药剂家族以及埃斯培拉霉素(esperamicin)。
[0340]
在一些实施例中，多肽可为多肽与具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或dna核酸内切酶，诸如脱氧核糖核酸酶；dna酶)之间的缀合物。
[0341]
在另一实施例中，多肽(例如抗体)可结合至“受体”(此类链霉亲和素)以便用于肿瘤预靶向中，其中向患者施用多肽受体缀合物，随后使用澄清剂将未结合的缀合物自循环中去除并且接着施用“配体”(例如亲和素)，该配体结合至细胞毒性剂(例如放射性核苷酸)。
[0342]
在一些实施例中，多肽可结合至将前药(例如肽基化学治疗剂)转化为活性抗癌药的前药活化酶。免疫缀合物的酶组分包括能够以此类方式作用于前药以便将其转化为其更具活性的细胞毒性形式的任何酶。
[0343]
可用的酶包括但不限于可用于将含磷酸酯前药转化为游离药物的碱性磷酸酶；可用于将含硫酸酯前药转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；可用于将无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱胺酶；蛋白酶，诸如沙雷氏菌属(serratia)蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(诸如组织蛋白酶b和l)，其可用于将含肽前药转化为游离药物；可用于转化含有d-氨基酸取代基的前药的d-丙胺酰基羧肽酶；碳水化合物裂解酶(诸如β-半乳糖苷酶)和可用于将糖基化前药转化为游离药物的神经氨酸酶；可用于将用β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物的β-内酰胺酶；以及可用于将在胺氮处分别用苯氧基乙酰基或苯基乙酰基衍生的药物转化为游离药物的青霉素酰胺酶，诸如青霉素v酰胺酶或青霉素g酰胺酶。可替代地，具有酶活性的抗体在本技术领域中也称为“抗体酶”，其可用于将前药转化为游离活性药物。
[0344]
其他
[0345]
多肽的另一类型的共价修饰包括将多肽连接至多种非蛋白质聚合物中的一者，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇以及聚丙二醇的共聚物。多肽也可包埋于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊以及聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、胶态药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊)中或巨乳液中。此类技术公开于remington'spharmaceutical sciences,第18版,gennaro,a.r.编,(1990)中。
[0346]
获得用于调配物和方法中的多肽
[0347]
要使用通过本文所描述的方法清洁的可再使用的层析材料纯化的多肽可使用本技术领域中熟知的方法，包括重组方法来获得。以下部分提供关于这些方法的指导。
[0348]
多核苷酸
[0349]
如本文中可互换使用，“多核苷酸”或“核酸”指任何长度的核苷酸聚合物，并且包
括dna和rna。
[0350]
编码多肽的多核苷酸可获自任何来源，包括但不限于由认为具有多肽mrna并且以可检测水平表达多肽mrna的组织制备的cdna文库。因此，编码多肽的多核苷酸可方便地获自由人组织制备的cdna文库。多肽编码基因也可自基因组文库或通过已知合成程序(例如自动化核酸合成)来获得。
[0351]
例如，多核苷酸可编码整个免疫球蛋白分子链，诸如轻链或重链。完整重链不仅包括重链可变区(vh)而且包括重链恒定区(ch)，其典型地将包含三个恒定结构域：ch1、ch2和ch3；以及“铰链”区。在一些情况下，恒定区的存在为所需的。
[0352]
可由多核苷酸编码的其他多肽包括抗原结合抗体片段，诸如单结构域抗体(“dab”)、fv、scfv、fab'和f(ab')2以及“微型抗体”。微型抗体为(典型地)已切除ch1和ck或c
l
结构域的二价抗体片段。由于微型抗体比常规抗体小，故其在临床/诊断使用中会实现更佳的组织穿透率，但为二价的，其会保留比单价抗体片段(诸如dab)更高的结合亲和力。因此，除非上下文另有指示，否则如本文所用的术语“抗体”不仅涵盖全抗体分子而且涵盖上文所论述类型的抗原结合抗体片段。优选存在于编码的多肽中的各构架区相对于对应人受体构架将包含至少一个氨基酸取代。因此，例如，构架区相对于受体构架区可包含总计三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个、十三个、十四个或十五个氨基酸取代。
[0353]
适当地，本文所描述的多核苷酸可经分离和/或纯化。在一些实施例中，多核苷酸为经分离的多核苷酸。
[0354]
术语“经分离的多核苷酸”旨在表明分子自其正常或天然环境去除或分离或已以使得其不存在于其正常或天然环境中的方式产生。在一些实施例中，多核苷酸为经纯化的多核苷酸。术语经纯化旨在表明已去除至少一些污染分子或物质。
[0355]
适当地，多核苷酸为基本上经纯化的，使得相关多核苷酸构成存在于组合物中的优势(亦即，最丰富)多核苷酸。
[0356]
多核苷酸的表达
[0357]
以下描述主要关于通过培养用含有多肽编码多核苷酸的载体转型或转染的细胞来产生多肽。当然，预期可使用本技术领域中熟知的替代方法来制备多肽。例如，适当氨基酸序列或其部分可通过使用固相技术进行直接肽合成来产生(参见例如stewart等人,solid-phase peptide synthesis w.h.freeman co.,san francisco,calif.(1969)；merrifield,j.am.chem.soc.85:2149-2154(1963))。可使用人工技术或通过自动化进行体外蛋白质合成。自动化合成可例如使用制造商的说明书使用应用生物系统肽合成器(foster city,calif.)来实现。可分开地化学合成多肽的各种部分并且使用化学或酶法组合以产生所需多肽。
[0358]
将如本文所描述的多核苷酸插入表达载体中以便产生多肽。术语“控制序列”指为可操作地连接的编码序列在特定宿主有机体中表达所必需的dna序列。控制序列包括但不限于启动子(例如天然相关或异源的启动子)、信号序列、增强子组件和转录终止序列。
[0359]
多核苷酸在其被放入与另一多核苷酸序列的功能关系时为“可操作地连接的”。例如，若前序列或分泌前导子表达为参与多肽分泌的前蛋白，则前序列或分泌前导子的核酸可操作地连接至多肽的核酸；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则启动子或增强子
可操作地连接至该序列；或若核糖体结合位点经安置以促进转译，则核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，“可操作地连接”意指连接的核酸序列为连续的，并且在分泌前导子的情况下，为连续的且处于阅读阶段中。然而，增强子未必为连续的。连接通过在方便的限制位点处连结来实现。若此类位点不存在，则根据常规作法使用合成寡核苷酸衔接子或连接子。
[0360]
对于抗体，轻链和重链可在相同或不同表达载体中克隆。编码免疫球蛋白链的核酸区段可操作地连接至表达载体中的控制序列，从而确保免疫球蛋白多肽的表达。
[0361]
可通过熟知方法将含有多核苷酸序列(例如可变重链和/或可变轻链编码序列以及任选存在的表达控制序列)的载体转移至宿主细胞中，这些熟知方法视细胞宿主的类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理、电穿孔、脂质体转染、生物弹射击或基于病毒的转染可用于其他细胞宿主。(通常参见sambrook等人,molecular cloning:alaboratory manual(cold spring harbor press,第2版,1989)。用于将哺乳动物细胞转型的其他方法包括使用聚凝胺、原生质体融合、脂质体、电穿孔和微量注射。对于转基因动物的产生，可将转基因显微注射至受精的卵母细胞中，或可并入胚胎干细胞的基因组中，并且将此类细胞的核转移至去核的卵母细胞中。
[0362]
载体
[0363]
术语“载体”包括表达载体和转型载体以及穿梭载体。
[0364]
术语“表达载体”意指能够体内或体外表达的构建体。
[0365]
术语“转型载体”意指能够自一个实体转移至可属于该物种或可属于不同物种的另一实体的构建体。若构建体能够自一个物种转移至另一物种(诸如自大肠杆菌(escherichia coli)质粒至细菌，诸如芽孢杆菌属(bacillus)的细菌)，则转型载体有时称为“穿梭载体”。其甚至可能为能够自大肠杆菌质粒转移至土壤杆菌属(agrobacterium)转移至植物的构建体。
[0366]
载体可转型至如下文所描述适合于提供多肽的表达的宿主细胞中。各种载体为公共可获得的。载体可例如呈质粒、粘粒、病毒粒子或噬菌体形式。适当的核酸序列可通过多种程序插入载体中。一般而言，使用本技术领域中已知的技术将dna插入适当的限制性内切核酸酶位点。含有这些组分中的一者或多者的适合的载体的构建采用熟练技工已知的标准连结技术。
[0367]
载体可为例如质粒、病毒或噬菌体载体，其具备复制起点、任选存在的用于该多核苷酸的表达的启动子以及任选存在的启动子的调控子。载体可含有本技术领域中熟知的一个或多个可选标记基因。
[0368]
这些表达载体典型地在宿主有机体中作为游离基因组或作为宿主染色体dna的组成部分复制。
[0369]
宿主细胞
[0370]
宿主细胞可为例如细菌、酵母或其他真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞。
[0371]
已经基因操纵的转基因多细胞宿主有机体可用于产生多肽。有机体可为例如转基因哺乳动物有机体(例如转基因山羊或小鼠系)。
[0372]
适合的原核生物包括但不限于真细菌，诸如革兰氏阴性(gram-negative)或格兰
氏阳性有机体，例如肠杆菌科(enterobacteriaceae)，诸如大肠杆菌。各种大肠杆菌株为公共可获得的，诸如大肠杆菌k12株mm294(atcc 31,446)；大肠杆菌x1776(atcc 31,537)；大肠杆菌株w3110(atcc 27,325)和k5 772(atcc 53,635)。其他适合的原核宿主细胞包括肠杆菌科，诸如埃希氏杆菌属(escherichia)(例如大肠杆菌)、肠杆菌属(enterobacter)、欧文氏菌属(erwinia)、克雷伯氏杆菌属(klebsiella)、变形杆菌属(proteus)、沙门氏菌属(salmonella)(例如鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium))、沙雷氏菌属(serratia)(例如粘质沙雷氏菌(serratia marcescans))和志贺氏菌属(shigella)，以及芽孢杆菌属(bacilli)(诸如枯草芽孢杆菌(b.subtilis)和地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)(例如地衣芽孢杆菌41p))、假单胞菌属(pseudomonas)(诸如铜绿假单胞菌(p.aeruginosa))以及链霉菌属(streptomyces)。这些实例为说明性而非限制性的。株w3110为一种特别优选宿主或母体宿主，因为其为用于重组多核苷酸产物发酵的常见宿主株。优选地，宿主细胞分泌最小量的蛋白水解酶。例如，可对株w3110进行修饰以实现对宿主而言为内源性的编码多肽的基因的基因突变，此类宿主的实例包括大肠杆菌w3110株1a2，其具有完整基因型tona；大肠杆菌w3110株9e4，其具有完整基因型tona ptr3；大肠杆菌w3110株27c7(atcc 55,244)，其具有完整基因型tona ptr3phoa e15(argf-lac)169degp ompt kan'；大肠杆菌w3110株37d6，其具有完整基因型tona ptr3 phoa e15(argf-lac)169degp ompt rbs7ilvg kan'；大肠杆菌w3110株40b4，其为具有非卡那霉素抗性degp缺失突变之株37d6；以及具有突变体周质蛋白酶的大肠杆菌株。可替代地，体外克隆方法(例如pcr或其他核酸聚合酶反应)为适合的。
[0373]
在这些原核宿主中，人们可制备表达载体，其将典型地含有与宿主细胞兼容的表达控制序列(例如复制起点)。此外，将存在任何数目的多种熟知启动子，诸如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子将典型地任选与操纵子序列一起控制表达，并且具有核糖体结合位点序列和类似序列，用于起始和完成转录和转译。
[0374]
可使用真核微生物来进行表达。诸如丝状真菌或酵母的真核微生物为适合用于多肽编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)为常用的低等真核宿主微生物。其他包括粟酒裂殖酵母(schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(kluyveromyces)宿主，诸如乳酸克鲁维酵母(k.lactis)(mw98-8c、cbs683、cbs4574)、脆壁克鲁维酵母(k.fragilis)(atcc 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(k.bulgaricus)(atcc 16,045)、威克克鲁维酵母(k.wickeramii)(atcc24,178)、瓦尔提克鲁维酵母(k.waltii)(atcc 56,500)、果蝇克鲁维酵母(k.drosophilarum)(atcc 36,906)、耐热克鲁维酵母(k.thermotolerans)和马克斯克鲁维酵母(k.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(ep 402,226)；巴斯德毕赤氏酵母(pichia pastoris)；念珠菌属(candida)；里氏木霉菌(trichoderma reesia)；红面包霉菌(neurospora crassa)；许旺酵母属(schwanniomyces)，诸如西方许旺酵母(schwanniomyces occidentalis)；以及丝状真菌，诸如红霉菌属(neurospora)、青霉属(penicillium)、弯颈霉属(tolypocladium)和曲菌属宿主，诸如小巢状曲菌(a.nidulans)和黑曲菌(a.niger)。甲醇酵母在本文中为适合的并且包括但不限于能够基于甲醇生长的酵母，其选自由以下组成的属：汉逊酵母属(hansenula)、念珠菌属、克勒克酵母属(kloeckera)、毕赤酵母属(pichia)、糖酵母属(saccharomyces)、球拟酵母属(torulopsis)和红酵母属(rhodotorula)。糖酵母属为优选
的酵母宿主，并且适合的载体按需要具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列以及诸如此类。典型启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖解酶。可诱导酵母启动子尤其包括来自乙醇脱氢酶、异细胞色素c以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
[0375]
除微生物之外，哺乳动物组织细胞培养还可用于表达和产生如本文所描述的多肽并且在一些情况下为优选的(参见winnacker,from genes to clones vch publishers,n.y.,n.y.(1987)。对于一些实施例，真核细胞可为优选的，因为本技术领域中已开发许多能够分泌异源多肽(例如完整免疫球蛋白)的适合的宿主细胞系，并且包括cho细胞系、各种cos细胞系、hela细胞，优选为骨髓瘤细胞系，或转型的b细胞或杂交瘤。在一些实施例中，哺乳动物宿主细胞为cho细胞。
[0376]
在一些实施例中，宿主细胞为脊椎动物宿主细胞。可用哺乳动物宿主细胞系的实例为由sv40转型的猴肾脏cv1系(cos-7，atcc crl1651)；人胚胎肾系(经亚克隆用于在悬浮液培养物中生长的293或293细胞)；幼仓鼠肾脏细胞(bhk，atcc ccl 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-dhfr(cho或cho-dp-12系)；小鼠足细胞；猴肾脏细胞(cv1 atcc ccl 70)；非洲绿猴肾脏细胞(vero-76，atcc crl-1587)；人子宫颈癌细胞(hela，atcc ccl 2)；犬肾脏细胞(mdck，atcc ccl34)；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(brl 3a，atcc crl 1442)；人肺细胞(w138，atcc ccl 75)；人肝细胞(hep g2，hb 8065)；小鼠乳房肿瘤(mmt 060562，atcc ccl51)；tri细胞；mrc 5细胞；fs4细胞；以及人肝细胞瘤系(hep g2)。
[0377]
调配物和制备调配物的方法
[0378]
本文还提供包含通过本文所描述的方法纯化的多肽(例如抗体)的调配物及制备调配物的方法。例如，经纯化的多肽可与药用载剂组合。
[0379]
在一些实施例中，可通过将具有所需程度的纯度的多肽与任选选用的药用载剂、赋形剂或稳定剂(remington's pharmaceutical sciences第16版,osol,a.编(1980))混合以冻干调配物或水溶液形式制备多肽调配物以便储存。
[0380]
如本文所用的“载剂”包括药用载剂、赋形剂或稳定剂，这些药用载剂、赋形剂或稳定剂对暴露于所采用剂量和浓度的此类物质的细胞或哺乳动物无毒。生理学上可接受的载剂常常为水性ph缓冲溶液。
[0381]
可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苯甲基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯啶酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖，诸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐相对离子，诸如钠；金属络合物(例如zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如tween
tm
、pluronics
tm
或聚乙二醇(peg)。
[0382]
在一些实施例中，多肽调配物中的多肽维持功能活性。
[0383]
要用于体内施用的调配物必须为无菌的。此容易凭借通过无菌过滤膜过滤来实现。
[0384]
本文中的调配物也可含有超过一种为所治疗的特定适应症所必需的活性化合物，优选为具有互补活性并且不会不利地彼此影响的那些活性化合物。例如，除一多肽之外，可能需要在一种调配物中包括另一多肽(例如抗体)。可替代地或另外地，组合物可进一步包含化学治疗剂、细胞毒性剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂和/或心脏保护剂。此类分子适当地以对预期目标有效的量组合存在。
[0385]
制品
[0386]
通过本文所描述的方法纯化的多肽和/或包含通过本文所描述的方法纯化的多肽的调配物可含于制品内。制品可包含含有多肽和/或多肽调配物的容器。优选地，制品包含：(a)包含在容器内的包含本文所描述的多肽和/或多肽调配物的组合物的容器；以及(b)具有关于向个体施用调配物的说明书的包装插页。
[0387]
制品包含容器和容器上或与容器缔合的标签或包装插页。适合的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可由诸如玻璃或塑料的多种材料形成。容器容纳或含有调配物并且可具有无菌存取埠(例如容器可为静脉内溶液袋或具有皮下注射针头可刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的至少一种活性剂为多肽。标签或包装插页以关于给药量和提供多肽和任何其他药物的间隔的特定指导指示组合物在个体中的使用。制品可进一步包括由商业和使用者观点来看所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。在一些实施例中，容器为注射器。在一些实施例中，注射器进一步包含在注射装置内。在一些实施例中，注射装置为自动注射器。
[0388]“包装插页”用于指照例包括于治疗剂产品的商业包装中的说明书，其含有关于涉及此类治疗剂产品的使用的适应症、用法、剂量、施用、禁忌、要与包装的产品组合的其他治疗剂产品和/或警告的信息。
[0389]
示例性实施例
[0390]
本发明提供以下示例性实施例。
[0391]
实施例1.一种用于清洁离子交换层析材料以供再使用的方法，其中该层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：
[0392]
a)使再生缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该再生缓冲液包含乙酸钠(naoac)；
[0393]
b)使消毒缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及
[0394]
c)将该离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中该储存缓冲液包含约0.1n naoh。
[0395]
实施例2.根据实施例1所述的方法，其中该再生缓冲液包含约50至约600mm naoac。
[0396]
实施例3.根据实施例1或2所述的方法，其中该再生缓冲液包含约350mm naoac。
[0397]
实施例4.根据实施例1至3中任一项所述的方法，其中该再生缓冲液的ph为约ph 4.0至11。
[0398]
实施例5.根据实施例1至4中任一项所述的方法，其中该再生缓冲液的ph为约ph 8.3。
[0399]
实施例6.根据实施例1至5中任一项所述的方法，其中使约3至约12倍材料体积的
再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0400]
实施例7.根据实施例1至6中任一项所述的方法，其中使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0401]
实施例8.根据实施例1至7中任一项所述的方法，其中使约2至约12倍材料体积的消毒缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0402]
实施例9.根据实施例1至8中任一项所述的方法，其中使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过使再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0403]
实施例10.根据实施例1至9中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料储存于约1至5倍材料体积的储存缓冲液中。
[0404]
实施例11.根据实施例1至10中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中。
[0405]
实施例12.一种用于清洁离子交换层析材料以供再使用的方法，其中该层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：
[0406]
a)使再生缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该再生缓冲液包含乙酸钠；
[0407]
b)使酸洗液穿过该离子交换层析材料，
[0408]
c)使消毒缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该消毒缓冲液包含约0.5n naoh和约1m nacl；以及
[0409]
d)将该离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中该储存缓冲液包含约0.1n naoh。
[0410]
实施例13.根据实施例12所述的方法，其中该再生缓冲液和第二再生缓冲液包含约25至约600mm naoac。
[0411]
实施例14.根据实施例12或13所述的方法，其中该再生缓冲液包含约350mm naoac。
[0412]
实施例15.根据实施例12或13所述的方法，其中该再生缓冲液包含约40mm naoac。
[0413]
实施例16.根据实施例12至15中任一项所述的方法，其中该再生缓冲液的ph为约ph 2.0至7.0。
[0414]
实施例17.根据实施例12至16中任一项所述的方法，其中该再生缓冲液的ph为约ph 4.0。
[0415]
实施例18.根据实施例12至17中任一项所述的方法，其中使约3至约12倍材料体积的再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0416]
实施例19.根据实施例12至18中任一项所述的方法，其中使约7倍材料体积的再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0417]
实施例20.根据实施例12至19中任一项所述的方法，其中该酸洗液为约167m naoac和约0.3m磷酸。
[0418]
实施例21.根据实施例12至20中任一项所述的方法，其中使约1至约5倍材料体积的该酸洗液穿过该离子交换层析材料。
[0419]
实施例22.根据实施例12至21中任一项所述的方法，其中使约3倍材料体积的该酸洗液穿过该离子交换层析材料。
[0420]
实施例23.根据实施例12至22中任一项所述的方法，其中使约2至约12倍材料体积
的消毒缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0421]
实施例24.根据实施例12至23中任一项所述的方法，其中使约4倍材料体积的消毒缓冲液穿过使再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0422]
实施例25.根据实施例12至24中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料储存于约1至5倍材料体积的储存缓冲液中。
[0423]
实施例26.根据实施例12至25中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料储存于约3倍材料体积的储存缓冲液中。
[0424]
实施例27.一种用于清洁离子交换层析材料以供再使用的方法，其中该层析材料以过载模式用于多肽的纯化中，该方法包括以下步骤：
[0425]
a)使再生缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该再生缓冲液包含tris和乙酸钠；
[0426]
b)使消毒缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及
[0427]
c)将该离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中该储存缓冲液包含约0.1n naoh。
[0428]
实施例28.根据实施例27所述的方法，其中该再生缓冲液包含约25至约75mm tris和约50至约100mm naoac。
[0429]
实施例29.根据实施例27或28所述的方法，其中该再生缓冲液包含约50mm tris和约85mm naoac。
[0430]
实施例30.根据实施例27至29中任一项所述的方法，其中该再生缓冲液的ph为约ph 7至9。
[0431]
实施例31.根据实施例27至30中任一项所述的方法，其中该再生缓冲液的ph为约ph 8.0。
[0432]
实施例32.根据实施例27至31中任一项所述的方法，其中使约3至约12倍材料体积的再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0433]
实施例33.根据实施例27至32中任一项所述的方法，其中使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0434]
实施例34.根据实施例27至33中任一项所述的方法，其中使约2至约12倍材料体积的消毒缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0435]
实施例35.根据实施例27至34中任一项所述的方法，其中使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过使再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0436]
实施例36.根据实施例27至35中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料储存于约1至5倍材料体积的储存缓冲液中。
[0437]
实施例37.根据实施例27至36中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中。
[0438]
实施例38.一种使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化该多肽的方法，其中该离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：
[0439]
a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；
[0440]
b)将该组合物加载于该离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；
[0441]
c)收集包含该多肽的级分；
[0442]
d)用平衡缓冲液洗涤该离子交换层析材料；
[0443]
e)使再生缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该再生缓冲液包含乙酸钠；
[0444]
f)使消毒缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及
[0445]
g)将该离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中该储存缓冲液包含约0.1n naoh。
[0446]
实施例39.一种使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化该多肽的方法，其中该离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：
[0447]
a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；
[0448]
b)将该组合物加载于该离子交换层析材料上，其中加载密度≥20g/l；
[0449]
c)收集包含该多肽的级分；
[0450]
d)用平衡缓冲液洗涤该离子交换层析材料；
[0451]
e)使再生缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该再生缓冲液包含乙酸钠；
[0452]
f)使消毒缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及
[0453]
g)将该离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中该储存缓冲液包含约0.1n naoh。
[0454]
实施例40.根据实施例39所述的方法，其中该加载密度≥70g/l。
[0455]
实施例41.一种使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化该多肽的方法，其中该离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：
[0456]
a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；
[0457]
b)将该组合物加载于该离子交换层析材料上，其中加载密度超过该离子交换层析对该多肽的动态结合容量；
[0458]
c)收集包含该多肽的级分；
[0459]
d)用平衡缓冲液洗涤该离子交换层析材料；
[0460]
e)使再生缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该再生缓冲液包含乙酸钠；
[0461]
f)使消毒缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及
[0462]
g)将该离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中该储存缓冲液包含约0.1n naoh。
[0463]
实施例42.根据实施例41所述的方法，其中该加载密度为该离子交换层析材料对该多肽的动态结合容量的至少约2倍。
[0464]
实施例43.根据实施例42所述的方法，其中该加载密度为该离子交换层析材料对该多肽的动态结合容量的约2倍至约100倍。
[0465]
实施例44.根据实施例42所述的方法，其中该加载密度为该离子交换层析材料对该多肽的动态结合容量的约10倍。
[0466]
实施例45.根据实施例38至44中任一项所述的方法，其中该平衡缓冲液包含约20mm至约60mm乙酸钠。
[0467]
实施例46.根据实施例38至45中任一项所述的方法，其中该平衡缓冲液包含约40mm乙酸钠。
[0468]
实施例47.根据实施例38至46中任一项所述的方法，其中该平衡缓冲液的ph为约ph 5.0至约ph 6.0。
[0469]
实施例48.根据实施例38至47中任一项所述的方法，其中该平衡缓冲液的ph为约ph 5.5。
[0470]
实施例49.根据实施例38至48中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料用约3至7倍材料体积的平衡缓冲液洗涤。
[0471]
实施例50.根据实施例38至49中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料用约5倍材料体积的平衡缓冲液洗涤。
[0472]
实施例51.根据实施例38至50中任一项所述的方法，其中该再生缓冲液包含约50至约600mm naoac。
[0473]
实施例52.根据实施例38至51中任一项所述的方法，其中该再生缓冲液包含约350mm naoac。
[0474]
实施例53.根据实施例38至52中任一项所述的方法，其中该再生缓冲液的ph为约ph 4.0至11。
[0475]
实施例54.根据实施例38至53中任一项所述的方法，其中该再生缓冲液的ph为约ph 8.3。
[0476]
实施例55.根据实施例38至54中任一项所述的方法，其中使约3至约12倍材料体积的再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0477]
实施例56.根据实施例38至55中任一项所述的方法，其中使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0478]
实施例57.根据实施例38至56中任一项所述的方法，其中使约2至约12倍材料体积的消毒缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0479]
实施例58.根据实施例38至57中任一项所述的方法，其中使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过使再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0480]
实施例59.根据实施例38至58中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料储存于约1至5倍材料体积的储存缓冲液中。
[0481]
实施例60.根据实施例38至59中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中。
[0482]
实施例61.一种使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化该多肽的方法，其中该离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：
[0483]
a)用平衡缓冲液平衡离子交换层析材料；
[0484]
b)将该组合物加载于该离子交换层析材料上，其中加载密度超过该离子交换层析对该多肽的动态结合容量；
[0485]
c)收集包含该多肽的级分；
[0486]
d)用平衡缓冲液洗涤该离子交换层析材料；
[0487]
e)使再生缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该再生缓冲液包含乙酸钠；
[0488]
f)使酸洗液穿过该离子交换层析材料，
[0489]
g)使消毒缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该消毒缓冲液包含约0.5n naoh和约1m nacl；以及
[0490]
h)将该离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中该储存缓冲液包含约0.1n naoh。
[0491]
实施例62.根据实施例61所述的方法，其中该加载密度≤约1000g/l。
[0492]
实施例63.根据实施例61或62所述的方法，其中该加载密度≥约20g/l。
[0493]
实施例64.根据实施例61至63中任一项所述的方法，其中该加载密度≥约70g/l。
[0494]
实施例65.根据实施例67所述的方法，其中该加载密度为该离子交换层析材料对该多肽的动态结合容量的至少约2倍。
[0495]
实施例66.根据实施例61所述的方法，其中该加载密度为该离子交换层析材料对该多肽的动态结合容量的约2倍至约100倍。
[0496]
实施例67.根据实施例61所述的方法，其中该加载密度为该离子交换层析材料对该多肽的动态结合容量的约10倍。
[0497]
实施例68.根据实施例61至67中任一项所述的方法，其中该平衡缓冲液包含约50mm至约100mm naoac和约25mm至约75mm tris。
[0498]
实施例69.根据实施例61至68中任一项所述的方法，其中该平衡缓冲液包含约85mm乙酸钠和约50mm tris。
[0499]
实施例70.根据实施例61至69中任一项所述的方法，其中该平衡缓冲液的ph为约ph 6.0至约ph 10.0。
[0500]
实施例71.根据实施例61至70中任一项所述的方法，其中该平衡缓冲液的ph为约ph 8.0。
[0501]
实施例72.根据实施例61至71中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料用约5至约15倍材料体积的平衡缓冲液洗涤。
[0502]
实施例73.根据实施例61至72中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料用约10倍材料体积的平衡缓冲液洗涤。
[0503]
实施例74.根据实施例61至73中任一项所述的方法，其中该再生缓冲液包含约25至约600mm naoac。
[0504]
实施例75.根据实施例61至74中任一项所述的方法，其中该再生缓冲液包含约350mm naoac。
[0505]
实施例76.根据实施例61至74中任一项所述的方法，其中该再生缓冲液包含约40mm naoac。
[0506]
实施例77.根据实施例61至76中任一项所述的方法，其中该平衡缓冲液的ph为约ph 2.0至7.0。
[0507]
实施例78.根据实施例61至77中任一项所述的方法，其中该平衡缓冲液的ph为约ph 4.0。
[0508]
实施例79.根据实施例61至78中任一项所述的方法，其中使约3至约12倍材料体积的该再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0509]
实施例80.根据实施例61至79中任一项所述的方法，其中使约7倍材料体积的该再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0510]
实施例81.根据实施例61至80中任一项所述的方法，其中该酸洗液为约167m naoac和约0.3m磷酸。
[0511]
实施例82.根据实施例61至81中任一项所述的方法，其中使约1至约5倍材料体积的该酸洗液穿过该离子交换层析材料。
[0512]
实施例83.根据实施例61至82中任一项所述的方法，其中使约3倍材料体积的该酸洗液穿过该离子交换层析材料。
[0513]
实施例84.根据实施例61至83中任一项所述的方法，其中使约2至约12倍材料体积的消毒缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0514]
实施例85.根据实施例61至84中任一项所述的方法，其中使约4倍材料体积的消毒缓冲液穿过使再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0515]
实施例86.根据实施例61至85中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料储存于约1至5倍材料体积的储存缓冲液中。
[0516]
实施例87.根据实施例61至86中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料储存于约3倍材料体积的储存缓冲液中。
[0517]
实施例88.一种使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化该多肽的方法，其中该离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：
[0518]
a)用平衡缓冲液平衡该离子交换层析材料；
[0519]
b)将该组合物加载于该离子交换层析材料上，其中加载密度≤约1000g/l；
[0520]
c)收集包含该多肽的级分；
[0521]
d)用平衡缓冲液洗涤该离子交换层析材料；
[0522]
e)使再生缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该再生缓冲液包含tris和乙酸钠；
[0523]
f)使消毒缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及
[0524]
g)将该离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中该储存缓冲液包含约0.1n naoh。
[0525]
实施例89.一种使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化该多肽的方法，其中该离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：
[0526]
a)用平衡缓冲液平衡该离子交换层析材料；
[0527]
b)将该组合物加载于该离子交换层析材料上，其中加载密度≥20g/l；
[0528]
c)收集包含该多肽的级分；
[0529]
d)用平衡缓冲液洗涤该离子交换层析材料；
[0530]
e)使再生缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该再生缓冲液包含tris和乙酸钠；
[0531]
f)使消毒缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及
[0532]
g)将该离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中该储存缓冲液包含约0.1n naoh。
[0533]
实施例90.根据实施例89所述的方法，其中该加载密度≥70g/l。
[0534]
实施例91.一种使用离子交换层析材料自包含多肽和杂质的组合物中纯化该多肽的方法，其中该离子交换层析材料适合再使用，该方法包括以下步骤：
[0535]
a)用平衡缓冲液平衡该离子交换层析材料；
[0536]
b)将该组合物加载于该离子交换层析材料上，其中加载密度超过该离子交换层析对该多肽的动态结合容量；
[0537]
c)收集包含该多肽的级分；
[0538]
d)用平衡缓冲液洗涤该离子交换层析材料；
[0539]
e)使再生缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该再生缓冲液包含tris和乙酸钠；
[0540]
f)使消毒缓冲液穿过该离子交换层析材料，其中该消毒缓冲液包含约0.5n naoh；以及
[0541]
g)将该离子交换层析材料储存于储存缓冲液中，其中该储存缓冲液包含约0.1n naoh。
[0542]
实施例92.根据实施例91所述的方法，其中该加载密度为该离子交换层析材料对该多肽的动态结合容量的至少约2倍。
[0543]
实施例93.根据实施例91所述的方法，其中该加载密度为该离子交换层析材料对该多肽的动态结合容量的约2倍至约100倍。
[0544]
实施例94.根据实施例91所述的方法，其中该加载密度为该离子交换层析材料对该多肽的动态结合容量的约10倍。
[0545]
实施例95.根据实施例94所述的方法，其中该平衡缓冲液包含约20mm至约60mm乙酸钠。
[0546]
实施例96.根据实施例88至95中任一项所述的方法，其中该平衡缓冲液包含约40mm乙酸钠。
[0547]
实施例97.根据实施例88至96中任一项所述的方法，其中该平衡缓冲液的ph为约ph 5.0至约ph 6.0。
[0548]
实施例98.根据实施例88至97中任一项所述的方法，其中该平衡缓冲液的ph为约ph 5.5。
[0549]
实施例99.根据实施例88至98中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料用约3至7倍材料体积的平衡缓冲液洗涤。
[0550]
实施例100.根据实施例88至99中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料用约5倍材料体积的平衡缓冲液洗涤。
[0551]
实施例101.根据实施例88至100中任一项所述的方法，其中该再生缓冲液包含约25至约75mm tris和约50至约100mm naoac。
[0552]
实施例102.根据实施例88至101中任一项所述的方法，其中该再生缓冲液包含约50mm tris和约85mm naoac。
[0553]
实施例103.根据实施例88至102中任一项所述的方法，其中该平衡缓冲液的ph为约ph 7至9。
[0554]
实施例104.根据实施例88至103中任一项所述的方法，其中该平衡缓冲液的ph为约ph 8.0。
[0555]
实施例105.根据实施例88至104中任一项所述的方法，其中使约3至约12倍材料体积的再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0556]
实施例106.根据实施例88至105中任一项所述的方法，其中使约10倍材料体积的再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0557]
实施例107.根据实施例88至106中任一项所述的方法，其中使约2至约12倍材料体积的消毒缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0558]
实施例108.根据实施例88至107中任一项所述的方法，其中使约10倍材料体积的消毒缓冲液穿过使再生缓冲液穿过该离子交换层析材料。
[0559]
实施例109.根据实施例88至108中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料储存于约1至5倍材料体积的储存缓冲液中。
[0560]
实施例110.根据实施例88至109中任一项所述的方法，其中将该离子交换层析材料储存于约4倍材料体积的储存缓冲液中。
[0561]
实施例111.根据实施例1至110中任一项所述的方法，其中该离子交换层析材料在层析柱中。
[0562]
实施例112.根据实施例1至111中任一项所述的方法，其中该离子交换层析材料为阳离子交换层析材料。
[0563]
实施例113.根据实施例1至112中任一项所述的方法，其中该离子交换层析材料包含连接至支持物基质的磺丙基部分。
[0564]
实施例114.根据实施例113所述的方法，其中该支持物基质包含交联聚(苯乙烯二乙烯基苯)。
[0565]
实施例115.根据实施例1至114中任一项所述的方法，其中该离子交换层析材料为poros
tm hs50材料。
[0566]
实施例116.根据实施例1至115中任一项所述的方法，其中该离子交换层析材料为混合模式阳离子交换材料。
[0567]
实施例117.根据实施例116所述的方法，其中该混合模式阳离子交换材料为capto mmc
tm
、capto mmc
tm impres、nuvia
tm cprime
tm 或toyopearl mx trp-650m。
[0568]
实施例118.根据实施例1至111中任一项所述的方法，其中该离子交换层析材料为阴离子交换层析材料。
[0569]
实施例119.根据实施例1至111或实施例118中任一项所述的方法，其中该离子交换层析材料包含连接至支持物基质的伯胺、仲胺、叔胺或季铵离子官能团、聚胺官能团或二乙氨基乙基官能团。
[0570]
实施例120.根据实施例1至111、实施例118或119中任一项所述的方法，其中该离子交换层析材料为混合模式阴离子交换材料。
[0571]
实施例121.根据实施例120所述的方法，其中该混合模式阴离子交换材料为capto adhere
tm 或capto adhere
tm impres。
[0572]
实施例122.根据实施例1至121中任一项所述的方法，其中该离子交换层析材料用于大规模制备该多肽。
[0573]
实施例123.根据实施例1至122中任一项所述的方法，其中该多肽为抗体、免疫粘附素、含fc蛋白质、或免疫缀合物。
[0574]
实施例124.根据实施例123所述的方法，其中该多肽为抗体。
[0575]
实施例125.根据实施例124所述的方法，其中该抗体为单克隆抗体。
[0576]
实施例126.根据实施例125所述的方法，其中该单克隆抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[0577]
实施例127.根据实施例125或126所述的方法，其中该单克隆抗体为igg单克隆抗体。
[0578]
实施例128.根据实施例124至127中任一项所述的方法，其中该抗体为抗原结合片段。
[0579]
实施例129.根据实施例128所述的方法，其中该抗原结合片段为fab片段、fab'片段、f(ab’)2片段、scfv、二scfv、双scfv、串联(二、三)-scfv、fv、sdab、三功能抗体、bite、双体抗体或三体抗体。
[0580]
实施例130.根据实施例124至129中任一项所述的方法，其中该抗体为双特异性抗体。
[0581]
实施例131.根据实施例124至127中任一项所述的方法，其中该抗体选自由以下项组成的组：抗cd20抗体、抗cd40抗体、抗her2抗体、抗il6抗体、抗ige抗体、抗il13抗体、抗flu a抗体、抗tigit抗体、抗pd-l1抗体、抗vegf-a抗体、抗vegf-a/ang2抗体、抗cd79b抗体、抗st2抗体、抗因子d抗体、抗因子ix抗体、抗因子x抗体、抗aβ抗体、抗tau抗体、抗cea抗体、抗cea/cd3抗体、抗cd20/cd3抗体、抗fcrh5/cd3抗体、抗her2/cd3抗体、抗fgfr1/klb抗体、fap-4-1bbl融合蛋白和fap-il2v融合蛋白。
[0582]
实施例132.根据实施例124至127中任一项所述的方法，其中该抗体选自由以下项组成的组：奥瑞珠单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、托珠单抗、法立昔单抗、泊洛妥珠单抗、甘特珠单抗、赛必妥单抗、克瑞珠单抗、莫苏尼妥珠单抗、替瑞利尤单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗、阿特珠单抗、奥滨尤妥珠单抗、兰帕珠单抗、来金珠单抗、奥马珠单抗、兰尼单抗、艾美赛珠单抗、塞鲁单抗、普拉辛珠单抗、ro6874281和ro7122290。
[0583]
实施例133.根据实施例124至132中任一项所述的方法，其中在穿过该离子交换层析材料之前将该多肽使用亲和层析材料纯化，其中该离子交换层析材料为阳离子交换层析材料。
[0584]
实施例134.根据实施例133所述的方法，其中该亲和材料选自由以下项组成的组：蛋白质a层析、蛋白质g层析、蛋白质a/g层析、蛋白质l层析、fcxl层析、蛋白质xl层析、κ层析和κxl层析。
[0585]
实施例135.根据实施例134所述的方法，其中该蛋白质a亲和材料为mabselect材料、mabselect sure
tm
材料或mabselect sure
tm lx材料。
[0586]
实施例136.根据实施例1至135中任一项所述的方法，其中使该等缓冲液以约15至20倍材料体积/小时穿过该离子交换层析材料。
[0587]
实施例137.根据实施例1至136中任一项所述的方法，其中使该再生缓冲液以约10倍材料体积/小时穿过该离子交换层析材料。
[0588]
实施例138.根据实施例1至137中任一项所述的方法，其中该多肽在宿主细胞中产生。
[0589]
实施例139.根据实施例138所述的方法，其中该宿主细胞为中国仓鼠卵巢(cho)细
胞。
[0590]
实施例140.根据实施例1至139中任一项所述的方法，其中该杂质包含igg片段、宿主细胞蛋白质或宿主细胞核酸中的一者或多者。
[0591]
实施例141.根据实施例140所述的方法，其中该多肽在cho细胞中产生并且该杂质包含cho宿主细胞蛋白质(chop)和/或cho核酸。
[0592]
本说明书中公开的所有特征可以任何组合进行组合。本说明书中公开的各特征可由服务于相同、等效或类似目的的替代特征代替。因此，除非另外明确陈述，否则所公开的各特征仅为一系列通用的等效或类似特征的实例。
[0593]
本发明的其他细节通过以下非限制性实例来说明。本说明书中所有参考文献的公开内容明确地以引用的方式并入本文中。
[0594]
实例
[0595]
以下实例意欲单纯地示例本发明并且因此不应视为以任何方式限制本发明。以下实例和详细阐述作为说明而非限制来提供。
[0596]
实例1.阳离子交换过载再生洗涤步骤的开展
[0597]
开展再生步骤以减少过载阳离子交换层析材料在消毒期间的结垢并且使层析运行之间的杂质遗留减至最少。
[0598]
材料和方法
[0599]
进料
[0600]
使用cho细胞系使用自400l中试工厂运行得到的经调节的抗体mabselect sure
tm
(mss)汇集物进行本研究。经由连续(密封)离心，随后深度过滤和最终的灭菌级(0.2μm)过滤收获400l细胞培养制备物。
[0601]
缓冲液
[0602]
将表2中所列的缓冲液用于本发明的poros
tm 50hs(ol)层析制程中。
[0603]
表2.poros
tm 50hs(ol)层析缓冲液
[0604]
[0605]
设备
[0606]
使用ge healthcareavant 150和0.66cm直径柱进行所有实验室规模层析开展工作。
[0607]
纯化方法
[0608]
以下列入表内的方法为用于poros
tm 50hs(过载模式)和capto
tm adhere步骤的方法。已在任何可能之处提供非规模依赖性参数。
[0609]
阳离子交换过载(ol)层析(poros
tm 50hs)
[0610]
以过载模式操作poros
tm 50hs层析，其中进料在ph 5.5下加载，随后用相同平衡缓冲液进行加载后洗涤。由于过载模式需要高加载密度来补偿产率损失，故需要较高ph和电导率再生步骤用乙酸钠来洗掉任何所结合的蛋白质杂质，然后消毒并且在存在氢氧化钠的情况下储存。当利用过载模式时，在超过mab的动态结合容量的最佳结合容量下加载poros
tm 50hs树脂。此产生蛋白质相关杂质(例如vhmws和hmws)和制程相关杂质(例如chop)从而竞争结合于树脂，同时使得mab穿透；因此，接着以过载汇集物形式收集穿透物。增加的加载密度使得回收产率增加。
[0611]
poros
tm 50hs层析目标参数、阶段信息和运行条件描述于表3中。图2显示代表性poros过载层析图。
[0612]
表3.poros
tm 50hs层析制程、阶段信息和运行条件
[0613][0614]
分析方法
[0615]
产物蛋白质浓度
[0616]
通过使用具有石英比色皿的agilent 8453分光光度计在280 nm和320nm下测定mab浓度。将样品用纯化水(pw)稀释以达到280 nm下0.1至1.0 au之间的吸光度。使用以下等式来计算蛋白质浓度：
[0617][0618]
用于大小变体的尺寸排阻层析(sec)
[0619]
使用tsk g3000swxl(7.8 x 300 mm)分析型hplc柱(tosohbioscience)通过尺寸排阻层析(sec-hplc)来测定极高分子量物质(vhmws)、高分子量物质(hmws)、总聚集物(vhmws hmws)、单体和片段的相对比率。运行条件列于下表4中。柱在表中所列的运行缓冲液中在0.5ml/min下运行30分钟，并且在280nm下监测。自动样品室设定为5℃，范围为2-8℃；然而，柱室设定为环境温度。样品以纯形式注射，目标质量加载量为25-50μg。用于此分析的hplc系统为agilent1100/1200。
[0620]
表4.sec运行条件
[0621][0622]
分析型操作测定
[0623]
在制程开展和运行分析期间进行以下测定：
[0624]
cho dna，通过taqman pcr
[0625]
遗留，通过毛细管区带电泳/激光诱导荧光(cze-lif)
[0626]
内毒素，通过动力学分析来检测革兰氏阴性细菌内毒素。
[0627]
再生洗涤步骤开展
[0628]
mab1 poros
tm 50hs(ol)柱再生步骤和遗留研究
[0629]
cex过载层析操作包括再生步骤以有效地自poros
tm 50hs树脂去除任何所结合的杂质，特别是聚集物。评估两种再生缓冲液以有效去除杂质：350mm乙酸钠，ph 8.3；以及50mm tris、85mm乙酸钠，ph 8.0。
[0630]
在再生缓冲液评估期间，两次cex过载运行加载高至1000g/l
树脂
并且并有两个再生阶段(各缓冲液持续5cv)；然而，每次运行，再生缓冲液的序列均有改变。以下为使用所测试的再生缓冲液序列的两种评估运行：
[0631]
评估运行a：
[0632]
再生阶段1：50mm tris，85mm naoac，ph 8.0
[0633]
再生阶段2：350mm naoac，ph 8.3
[0634]
评估运行b：
[0635]
再生阶段1：350mm naoac，ph 8.3
[0636]
再生阶段2：50mm tris，85mm naoac，ph 8.0
[0637]
分析典型输出(kpi、杂质清除率和产物质量)；并且两次运行获得类似效能。然而，除那些输出外，收集第一再生阶段期间的柱流出物并且在sec上分析以评估聚集物自柱的去除，其通过图3(第一再生阶段柱流出物的sec层析图的迭加图)概述。图3表明使用350mm naoac ph 8.3缓冲液的阶段具有更高水平的vhmws，表明其已自柱去除更多聚集物，并且因此为更佳的再生洗涤缓冲液。使用任一再生缓冲液均未观测到柱结垢。
[0638]
当分析评估运行层析图(图4，评估运行a的层析图，以及图5，评估运行b的层析图)时，在使用350mm naoac ph 8.3再生缓冲液之后在再生阶段2中未观测到od峰，表明在使用该350mm naoac ph 8.3再生缓冲液之后柱中不存在残余蛋白质。使用任一再生缓冲液在制程期间均未观测到压力尖峰。通过分析型观测分析未观测到残余蛋白质遗留(表5)。
[0639]
表5.蛋白质遗留结果
[0640][0641]
mab2 poros
tm 50hs(ol)柱再生步骤和遗留研究
[0642]
优化cex柱再生步骤以自poros
tm 50hs树脂有效去除杂质并且防止运行间遗留和消毒阶段期间的树脂结垢。测试两种再生缓冲液：50mm tris、85mm乙酸钠，ph 8.0和350mm乙酸钠，ph 8.3。在再生缓冲液评估期间，两次cex过载运行加载高至800g/l
树脂
并且并有两个再生阶段(各缓冲液持续5cv)；然而，每次运行，再生缓冲液的序列均有改变。
[0643]
以下为使用所测试的再生缓冲液序列的两种评估运行：
[0644]
评估运行a：
[0645]
再生阶段1：50mm tris，85mm naoac，ph 8.0
[0646]
再生阶段2：350mm naoac，ph 8.3
[0647]
评估运行b：
[0648]
再生阶段1：350mm naoac，ph 8.3
[0649]
再生阶段2：50mm tris，85mm naoac，ph 8.0
[0650]
当分析评估运行层析图(图6，评估运行a的层析图，以及图7，评估运行b的层析图)时，在使用350mm naoac ph 8.3再生缓冲液之后在再生阶段2中未观测到od峰，表明在使用该350mm naoac ph 8.3再生缓冲液之后柱中不存在残余蛋白质。使用任一再生缓冲液在制程期间均未观测到压力尖峰。
[0651]
为验证清洁程序，使用各再生缓冲液进行一次产物接触运行。在产物接触运行之后使用表6中详述的程序进行模拟运行(在不存在加载阶段的情况下进行的运行)。为进行
模拟运行，使两种再生缓冲液与先前蛋白质接触运行交替以评估蛋白质遗留。以下为用于评估的运行序列的概述：
[0652]
1.)蛋白质接触运行，使用50mm tris、85mm naoac，ph 8.0再生阶段
[0653]
2.)模拟运行，使用350mm naoac，ph 8.3再生阶段
[0654]
3.)蛋白质接触运行，使用350mm naoac，ph 8.3再生阶段
[0655]
4.)模拟运行，使用50mm tris、85mm naoac，ph 8.0再生阶段
[0656]
表6.poros
tm 50hs模拟运行清洁程序
[0657][0658][0659]
*收集针对所测试的两种再生缓冲液的模拟汇集物并且提交以进行y:99(总蛋白)和y:77(cho dna)分析。
[0660]
对两种蛋白质接触运行和模拟运行的再生阶段进行收集并且在sec上运行(图8a和8b)。收集模拟汇集物并且进行cho dna(y:77)和总蛋白(y:99)分析。
[0661]
对于两种再生缓冲液，表7中所列的结果显示相当的效能；在柱上进行产物接触运行之后cho dna和总蛋白降至≤loq。用于蛋白质接触和模拟运行的再生溶液的sec分析表明在蛋白质接触运行期间与50mm tris、85mm naoac，ph 8.0相比350mm naoac，ph 8.3能够更有效地洗脱所结合的蛋白质。当使用50mm tris、85mm naoac，ph 8.0时，如当在后续模拟运行中使用350mm naoac，ph 8.3时通过额外蛋白质洗脱所指示，蛋白质接触运行仍留下结合于柱的蛋白质(图8a和8b)。
[0662]
表7.poros
tm 50hs模拟运行“遗留”清洁结果
[0663][0664]
*在样品收集30-min内将遗留(y99)样品用0.1％ps20处理并且在分析之前储存在≤-70℃下。
[0665]
结论
[0666]
对于mab2和mab1，350mm naoac ph 8.3和50mm tris、85mm naoac，ph 8.0再生有
效减轻了poros
tm 50hs树脂结垢。使用任一缓冲液在消毒阶段期间均观测到极小的压力增加。相较于50mm tris naoac ph8.0缓冲液，选择350mm naoac再生缓冲液作为用于cex过载层析的平台再生缓冲液。
[0667]
实例2多模式阴离子交换过载再生洗涤步骤的开展
[0668]
开展再生步骤以减少过载多模式阴离子交换层析材料在消毒期间的结垢并且使层析运行之间的杂质遗留减至最少。
[0669]
材料和方法
[0670]
进料
[0671]
使用cho细胞系使用自400l中试工厂运行得到的经调节的抗体mabselect sure
tm (mss)汇集物进行本研究。经由连续(密封)离心，随后深度过滤和最终的灭菌级(0.2μm)过滤收获400l细胞培养制备物。
[0672]
过载(ol)层析(capto
tm adhere)
[0673]
在“过载”操作期间，在产物与杂质均展现强结合(log k
p
＞2.0)的条件下直至开始发生蛋白质穿透的点加载柱。当与产物蛋白质相比杂质结合更强(亦即杂质log k
p
＞mab log k
p
)时可实现最佳效能，使得产物蛋白质将经历由杂质代替。此产生在穿透后产物富集并且杂质空乏的洗脱物。
[0674]
对于capto
tm adhere过载层析研究，在ph 8.0、高log k
p
(结合条件)下加载进料，如图9中所示。加载阶段之后为用平衡缓冲液进行加载后洗涤。制程条件描述于表8和9中。所测试的再生缓冲液列于表10中。
[0675]
所有实验室规模层析开展工作均使用ge healthcareavant 150和omnifit 0.66cm直径柱进行。
[0676]
表8.capto
tm adhere层析制程、阶段信息和运行条件
[0677]
树脂capto
tm adhere模式过载加载密度300g/l加载经调节的mabselect sure汇集物，ph 8.0流速150cm/h柱床高度20cm汇集准则0.5
–
0.5od
[0678]
表9
[0679]
[0680][0681]
表10.capto
tm adhere再生洗涤缓冲液
[0682]
再生洗涤缓冲液ph电导率(ms/cm)350mm乙酸钠8.3
±
0.120.0
±
340mm乙酸钠4.0
±
0.11.0
±
1.040mm乙酸钠5.0
±
0.12.6
±
1.0350mm乙酸钠4.0
±
0.16.6
±
5350mm乙酸钠5.0
±
0.118.0
±5[0683]
分析方法
[0684]
产物蛋白质浓度
[0685]
通过使用solovpe在278nm下测定mab浓度。使用以下等式来计算蛋白质浓度：
[0686]
蛋白质浓度＝(a280-a320)/(消光系数*路径长度)
×
稀释系数
[0687][0688]
再生洗涤步骤开展
[0689]
mab3 capto
tm adhere(ol)柱再生研究综述
[0690]
过载层析操作包括再生步骤以有效去除任何所结合的杂质。所评估的再生缓冲液描述于表10中。对于再生缓冲液评估，将柱加载至300g/l树脂并且并入两个再生阶段。每次运行，再生缓冲液的序列均有改变。所测试的再生缓冲液的序列概括于表11中并且在下文进行详述。
[0691]
表11：用于再生洗涤阶段的缓冲液的序列.数字指示使用再生缓冲液的顺序。
[0692][0693]
*使用5cv阶段持续时间替代7cv
[0694]
评估运行a：
[0695]
再生阶段1：350mm乙酸钠，ph 8.3
[0696]
再生阶段2：40mm乙酸钠，ph 4.0
[0697]
评估运行b：
[0698]
再生阶段1：40mm乙酸钠，ph 4.0
[0699]
再生阶段2：350mm乙酸钠，ph 4.0
[0700]
评估运行c：
[0701]
再生阶段1：40mm乙酸钠，ph 5.0
[0702]
再生阶段2：350mm乙酸钠，ph 5.0
[0703]
评估运行d：
[0704]
再生阶段1：350mm乙酸钠，ph 4.0
[0705]
再生阶段2：40mm乙酸钠，ph 4.0
[0706]
评估运行e：
[0707]
再生阶段1：350mm乙酸钠，ph 5.0
[0708]
再生阶段2：40mm乙酸钠，ph 5.0
[0709]
结果
[0710]
比较阶段间的质量平衡(蛋白质回收％)和压力概况以确定再生缓冲液的有效性。再生缓冲液阶段中较高的回收％指示较有效的再生缓冲液。表12显示每次运行的阶段间质量平衡的概述。以下概述关键实验比较。
[0711]
表12：质量平衡概述(蛋白质回收％)
[0712][0713]
评估运行a：
[0714]
350mm naoac ph 8.3缓冲液得到效果最差的再生洗涤。少量蛋白质洗脱，而如阶段中的较高回收％所示后续再生缓冲液(40mm naoac，ph 4.0)更有效。在第二再生阶段之后极少蛋白质保留在柱中。如图10a中所示，未观测到柱结垢(无压力尖峰)。
[0715]
评估运行b相较于运行d：40mm相较于350mm naoac ph 4.0
[0716]
40mm和350mm naoac ph 4.0缓冲液具有等效有效性。两种再生洗涤缓冲液用于第一再生洗涤阶段具有类似蛋白质回收率。在第一再生阶段之后极少蛋白质保留在柱中。如图10b和图10d中所示，未观测到柱结垢(无压力尖峰)。
[0717]
评估运行c相较于运行e：40mm naoac相较于350mm naoac ph 5.0
[0718]
与350mm naoac ph 5.0相比，40mm naoac ph 5.0缓冲液在将蛋白质从柱上洗脱掉方面具有改良的有效性。当350mm naoac ph 5.0用于再生洗涤1(运行e)时在再生洗涤2期间更多残余蛋白质洗脱。在再生洗涤2中观测到增加的uv信号(图4.5)。如图10c和图10e中所示，未观测到柱结垢(无压力尖峰)。
[0719]
评估运行b相较于运行c：ph 4.0相较于ph 5.0
[0720]
ph 4.0与5.0在汇集阶段之后充分洗脱剩余的所结合的蛋白质；然而，ph 4.0再生缓冲液对洗脱所结合的蛋白质比ph 5.0更有效。如比较层析图(图10b-10e)所示，使用ph 4.0条件在再生后阶段2中存在较少的残余蛋白质洗脱。
[0721]
结论
[0722]
较低ph作为capto
tm adhere再生缓冲液更有效。与350mm naoac ph 8.3相比，40mm和350mm ph 4.0和5.0为更有效的capto adhere再生洗涤缓冲液。在此评估中，40mm和350mm naoac ph 4.0再生缓冲液为最有效的再生缓冲液。此与显示对于mab3，在较低ph下蛋白质与树脂的结合减少并且在较高ph下结合增加(亦即蛋白质洗脱有效性降低)的结合等温线数据相匹配(图9)。在消毒阶段期间观测到极小的压力增加。将来的再生缓冲液研究有可能扩大在消毒阶段之前用于将蛋白质从柱洗脱掉的再生洗涤缓冲液的数目。