一种检测杆状病毒DNA含量的方法与流程

一种检测杆状病毒dna含量的方法
技术领域
1.本发明属于dna检测领域，具体涉及一种检测杆状病毒dna含量的方法。


背景技术：

2.杆状病毒是具有囊膜、形态呈杆状，基因组为双链环状dna分子的大型病毒，基因组大约80-180kbp，编码大约90-180个开放阅读框，是已知昆虫病毒中的最大群类。杆状病毒是专一性感染节肢动物的病毒，主要以鳞翅目、双翅目和膜翅目的昆虫为宿主。
3.杆状病毒作为外源基因在昆虫细胞中表达的载体，成为研究细胞分子生物学的重要工具。杆状病毒表达系统已被认为是生产大量重组蛋白质最有效的方法之一。研究表明，杆状病毒表达系统更优于其他表达系统，具有操作简单、可塑性强、载体载量大、表达效率高、对蛋白翻译后修饰加工、安全性高、宿主专一性、成本低等优势。弥补了哺乳动物表达系统的表达速度慢、费用高、不能大规模生产，和酵母表达系统的不能表达糖基化保持活性的蛋白、表达效率低等劣势。
4.苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(acmnpv)是杆状病毒的模式种，是首个完成测序的杆状病毒，也是目前研究最多、最广泛的杆状病毒。来源于acmnpv的重组杆状病毒主要应用于bac-to-bac表达系统。bac-to-bac表达系统是一种快速、简便、高效产生重组acmnpv的技术，利用细菌转座子原理，在大肠杆菌(escherichia coli)内产生重组acmnpv，使重组基因在昆虫细胞中高效表达，对目的蛋白进行完善的翻译修饰，产生大量与天然产物高度相似的制品。该系统已在基因工程中得到广泛应用，已有数千种外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中得到有效高表达，国内外利用bac-to-bac表达系统生产的多种药物、疫苗、生物杀虫剂等生物制品已批准上市。此外，acmnpv在哺乳类动物启动子下，可在哺乳动物细胞内进行基因传递，可实现哺乳细胞生产重组蛋白，意味着acmnpv在生物制品生产中具有更广阔的使用价值。
5.研究发现，生物制品中重组杆状病毒或dna残留对人或动物具有潜在副作用，因此需要对生物制品中重组杆状病毒dna的含量进行检测。目前尚未见检测基于acmnpv的重组杆状病毒dna含量的方法。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种检测杆状病毒基因组dna的方法。
7.本发明提供了一种用于检测杆状病毒dna的引物对，所述引物采用genebank登录号为m25420.1的核苷酸序列设计特异性引物。
8.上述杆状病毒包括天然的杆状病毒和重组杆状病毒。
9.进一步地，所述引物对为seq id no.1～2所示的pcr引物对。
10.本发明还提供了一种用于检测杆状病毒dna的反应体系，所述反应体系为实时荧光定量pcr反应体系，包含上述的引物对。
11.进一步地，所述反应体系还包括taq酶和dna模板。
12.本发明还提供了一种用于检测杆状病毒dna的方法，所述方法为实时荧光定量pcr法，包括以下步骤：利用上述的引物对扩增待检样品的基因组dna序列。
13.进一步地，所述实时荧光定量pcr法使用上述的反应体系进行反应。
14.进一步地，所述实时荧光定量pcr的反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，40个循环。
15.进一步地，所述方法还包括以下步骤：荧光定量pcr检测已知浓度的杆状病毒dna标准品的荧光信号，绘制标准曲线；根据所获得的标准曲线，计算得到待检样品中杆状病毒dna的含量。
16.进一步地，所述待检样品为杆状病毒、杆状病毒载体、杆状病毒表达系统表达或生产的蛋白药物、重组疫苗或单克隆抗体。
17.进一步地，所述杆状病毒为苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒。
18.本发明还提供了一种用于检测杆状病毒dna的试剂盒，所述试剂盒包括taq酶、引物对、标准品、阴性质控品；所述引物对为采用genebank登录号为m25420.1的核苷酸序列设计的特异性引物；所述阴性质控品为无菌h2o。
19.进一步地，所述引物对为seq id no.1～2所示的pcr引物对。
20.与现有技术效果，本发明取得的有益效果如下：
21.1)本发明首次发现利用特定的引物序列(如seq id no.1～2所示)可以有效检测重组杆状病毒基因组dna，特别是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(acmnpv)dna。
22.2)本发明提供的检测重组杆状病毒dna的方法专属性好，gp64 f1/r1引物对对重组杆状病毒基因组扩增无杂峰，对sf9细胞和水均无扩增。
23.3)本发明提供的检测重组杆状病毒dna的方法线性良好，线性范围较大。标准曲线相关系数r2大于0.99，线性范围为20000pg/μl-0.2pg/μl。
24.4)本发明提供的检测重组杆状病毒dna的方法灵敏度高。本发明最低可稳定检出0.02pg/μl的重组杆状病毒基因组dna，最低可准确定量0.2pg/μl的重组杆状病毒基因组dna。
25.5)本发明提供的检测重组杆状病毒dna的方法准确度高，精密度良好，重复rsd＜10％，中间精密度rsd＜20％。。
26.由于本发明检测方法和试剂盒检测的对象是杆状病毒的特征序列：genebank登录号为m25420.1的核苷酸序列，因此，利用本发明的检测方法和试剂盒检测可以检测所有的杆状病毒。
27.本发明提供的检测重组杆状病毒dna的方法在检测生物制品中的重组杆状病毒dna含量时具有良好的应用前景。
28.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
29.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
30.图1：不同引物对的扩增曲线比较。a～c依次表示gp64 f1/r1、gp64 f2/r2、gp64 f3/r3三对引物对。
31.图2：gp64 f1/r1专属性测试结果。a为荧光信号随循环数增加的变化图，b为熔解曲线。
32.图3：测试测定重组杆状病毒dna含量的标准曲线。
具体实施方式
33.实施例1一种检测重组杆状病毒基因组dna的方法
34.一、方法
35.1.材料
36.1.1基因组材料
37.本实施例采用的杆状病毒基因组dna标准品来源于acmnpv的重组杆状病毒，经鉴定含有杆状病毒特征序列：genebank登录号为m25420.1的核苷酸序列。
38.1.2主要试剂和仪器
39.minibest viral rna/dna extraction kit ver.5.0(9766，takara)，takarapremix ex taqtmⅱ(tli rnaseh plus)(rr820q，takara)，常温离心机(legend micro17，thermo)，冷冻离心机(fresco17，thermo)，nanodrop2000紫外分光光度计(nd2000c，thermo fisher scientific)，pcr仪(roche)。
40.1.3引物
41.acmnpv重组杆状病毒中gp64基因的特异性引物。序列如下：
42.gp64 f1(seq id no.1)：5
′‑
acagtcgtcgctgtcactgc-3
′
，
43.gp64 r1(seq id no.2)：5
′‑
caggcgtatgcgtacaacgg-3
′
；
44.gp64 f2(seq id no.3)：5
′‑
cgatttgttgcacgtgtggt-3
′
，
45.gp64 r2(seq id no.4)：5
′‑
aagagctgatcgaccgttgg-3
′
；
46.gp64 f3(seq id no.5)：5
′‑
cgatttgttgcacgtgtggt-3
′
，
47.gp64 r3(seq id no.6)：5
′‑
aagagctgatcgaccgttgg-3
′
。
48.引物均由擎科生物科技有限公司合成。
49.1.4供试品
50.来源于acmnpv的重组杆状病毒表达系统表达得到的重组蛋白产品原液。
51.2.qpcr检测
52.2.1重组杆状病毒基因组dna模板准备
53.按照minibest viral rna/dnaextraction kit ver.5.0说明书步骤进行病毒裂解：取200μl重组杆状病毒毒种加入200μl的buffer vgb、20μl的proteinase k，充分混匀于56℃水浴温浴10分钟，向裂解液中加入200μl无水乙醇，充分吸打混匀。
54.之后按照minibest viral rna/dnaextraction kitver.5.0说明书步骤提取重组杆状病毒基因组。nanodrop2000紫外分光光度计测定提取的基因组dna含量，作为标准重组杆状病毒基因组dna。
55.已知浓度的标准重组杆状病毒基因组dna经无核酸酶h2o进行稀释，获得不同浓度
的稀释品。
56.2.2 qpcr
57.提取的供试品dna，或重组杆状病毒dna，或sf9昆虫细胞dna为模板，以h2o为阴性对照。按照real time pcr反应体系，进行real time pcr反应。real time pcr反应体系(20μl)：sybrpremix ex taq ii(2
×
)，10μl；pcr正向引物(10μm)，0.3μl；pcr反向引物(10μm)，0.3μl；模板dna，2μl；灭菌蒸馏水，7.4μl。pcr扩增标准程序：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，40个循环。溶解曲线：95℃10s，65℃60s，97℃1s。
58.2.3数据分析
59.程序运行完毕后，利用重组杆状病毒dna含量(log10)作为横坐标，对应的ct值作为纵坐标，绘制标准曲线，r2＞0.99。
60.将测定ct值带入标准曲线，计算重组杆状病毒dna含量。
61.3.方法学验证
62.3.1专属性
63.利用实时荧光定量pcr(试剂和参数同2.2)，扩增重组杆状病毒基因组dna(200pg/μl)，sf9昆虫细胞dna(200pg/μl)，同时等体积h2o为阴性对照，扩增曲线谱进行比较。
64.3.2线性与范围
65.20ng/μl的重组杆状病毒基因组dna，经10倍梯度稀释，重复测定3次。以读取的ct值为y轴，以基因组dna浓度log10值为x轴绘制标准曲线，获得标准方程，相关系数，分析检测方法的ct与基因组dna浓度线性关系，r2值≥99％。计算rsd，应≤20。并计算理论浓度与测定浓度相对偏差，应≤20％。
66.3.3准确度
67.2000pg/μl，200pg/μl，20pg/μl的重组杆状病毒基因组dna，进行实时荧光定量pcr检测，根据获得的标准曲线及相应样品ct值，计算dna含量。计算检测值的偏差，应≤20％。
68.3.4精密度
69.3.4.1重复精密度
70.取2组重组杆状病毒dna样品，相同实验人员独立进行6次试验，计算样品检测值的rsd。
71.3.4.2中间精密度
72.取2组重组杆状病毒dna样品，不同实验人员在不同时间分别进行3次试验，每个时间进行3次重复测定。
73.3.5定量限和检测限
74.0.2pg/μl，0.02pg/μl，0.002pg/μl的重组杆状病毒基因组dna，重组测定8次，计算rsd，分析定量限和检测限。
75.3.6供试品中重组杆状病毒dna含量测定
76.选取供试品，分别进行高(100000pg)、中(10000pg)、低(1000pg)含量的sf9细胞dna加标检测，重组测定3次，计算每加标样品的回收率和rsd。
77.二、结果
78.1.引物比较
79.通过比较发现，gp64 f2/r2，gp64 f3/r3的阴性对照组(h2o)有非特异性信号(图
1)，gp64 f1/r1引物对2000pg/μl模板(阳性对照)具有显著扩增，阴性对照组无显著扩增，整体实验效果最佳。
80.后续结果均为使用gp64 f1/r1引物对的结果。
81.2.专属性
82.分别对重组杆状病毒基因组dna(200pg/μl)，sf9细胞基因组dna(200pg/μl)，同时等体积h2o进行扩增，结果显示，重组杆状病毒基因组呈现明显扩增，无明显杂峰出现，且sf9细胞基因组dna和h2o均无扩增，专属性好(图2，a为荧光信号随循环数变化图，b为熔解曲线)。
83.3.线性与范围
84.对20000pg/μl-0.02pg/μl的重组杆状病毒基因组进行扩增，重复测定3次，绘制标准曲线，计算相对偏差和变异系数。结果表明，20000pg/μl-0.2pg/μldna标准曲线r2＝99.986％(图3)，且符合相对偏差和变异系数均≤20％的要求(表1)，因此本法线性范围为20000pg/μl-0.2pg/μl。
85.表1测定重组杆状病毒dna线性范围
[0086][0087]
4.准确度
[0088]
实时荧光定量pcr检测结果显示，检测多个浓度，2000pg/μl，200pg/μl，20pg/μl的重组杆状病毒基因组dna，检测值与理论值的偏差＜20％，rsd＜20％(表2)。
[0089]
表2准确度测定
[0090][0091]
5.精密度
[0092]
5.1重复精密度
[0093]
20000pg/μl，2000pg pg/μl的重组杆状病毒基因组dna作为模板，进行扩增，经6次重复检测，rsd均＜10％，表明重复精密度良好(表3)。
[0094]
表3重复精密度测定
[0095][0096]
5.2中间精密度
[0097]
在不同时间进行3次独立重复试验，rsd均＜30％，表明中间精密度良好(表4)。
[0098]
表4中间精密度测定
[0099][0100]
6.定量限和检测限
[0101]
对0.2pg/μl，0.02pg/μl，0.002pg/μl的重组杆状病毒基因组dna进行多次检测，计算显示0.2pg/μl样品rsd及偏差＜20％。0.02pg/μl样品rsd较大(21.41977％)，但8次重复测定全部检出。0.002pg/μl样品8次重复检测中有2次未检出(表5)。因此，定量限定为0.2pg/μl，检测限定为0.02pg/μl。
[0102]
表5检测限和定量限检测
[0103][0104]
7.供试品中重组杆状病毒dna含量测定
[0105]
选取供试品，分别进行高(100000pg)、中(10000pg)、低(1000pg)含量的重组杆状病毒dna加标检测，重组测定3次，分析每加标样品的回收率在50％-150％，rsd≤30％(表6)。
[0106]
表6生产样品高、中、低浓度加标回收率
[0107][0108]
综上，本发明的方法可以有效检测重组杆状病毒基因组dna，具有良好的专属性、较大的线性范围、较高的准确度、精密度、灵敏度。