稳定过表达MIF的Lewis细胞株及其应用的制作方法

稳定过表达mif的lewis细胞株及其应用
技术领域
1.本发明涉及医学分子生物学技术领域，具体涉及一种稳定过表达mif的lewis细胞株及其应用。


背景技术：

2.肺腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，在诊断时多数患者已处于中晚期，五年生存率非常低。临床上肺腺癌治疗多以手术、化疗和放疗为主，近年来虽已取得显著进展，但是，目前仍然存在生存率低和副作用强等缺陷。
3.巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，mif)是一种多功能性细胞因子，主要来源于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、t细胞、b细胞和树突细胞等多种免疫细胞以及血管被批细胞，其作用主要表现为对巨噬细胞迁移的抑制和增强局部炎性反应。此外，mif参与机体的多项生理和病理功能调节，不仅能诱导肿瘤细胞的分化，更是参与机体的免疫调节，成为一种炎症与肿瘤的关键连接蛋白，在多种肿瘤中表达，影响着肿瘤细胞的增值、凋亡和侵袭。研究表明，mif在胃癌、宫颈癌、肝癌等组织中高表达，并参与构成肿瘤微环境，促进巨噬细胞的转化；参与肿瘤血管的生成，促进肿瘤细胞的侵润和转移。近来，研究显示mif是肺癌的发生发展的异常因子之一，mif有望成为肺癌的治疗靶点，然而，目前相关研究实验中，多采用mif激活剂或抑制剂，特异性差，与其他细胞靶点有交叉作用反应，影响实验结果准确性。
4.因此，为了深入探索肺腺癌的发生机制，寻找肺腺癌新的潜在治疗靶点，为患者临床治疗奠定坚实的基础，对肺腺癌细胞进行基因改造是十分必要的。


技术实现要素：

5.鉴于mif过表达可以介导肺腺癌中肿瘤的发生发展，本发明要解决的技术问题是提供一种稳定过表达mif的lewis细胞株及其应用。
6.为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
7.筛选一种稳定过表达mif的lewis细胞株，其保藏编号为：cctcc no：c202195。
8.优选的，其基因组中含mif基因表达载体。
9.进一步的，所述表达载体为phs-avc-ly018。
10.另提供一种用嘌呤霉素筛选所述稳定过表达mif的lewis细胞株的方法，所述嘌呤霉素的浓度为0.2-0.3μg/ml。
11.优选的，所述嘌呤霉素的浓度为0.25μg/ml。
12.另提供一种荷mif / lewis肺癌小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：
13.(1)选取4-5周龄，雄性c57bl/6小鼠；
14.(2)取所述稳定过表达mif的lewis细胞株制备细胞悬液；
15.(3)在所述c57bl/6小鼠皮下注射细胞悬液；
16.(4)接瘤成功后，常规饲养于spf级饲养室，即成。
17.优选的，在所述步骤(2)中，所述细胞悬液的细胞终浓度为1.5-2.5
×
106个/ml。
18.优选的，在所述步骤(3)中，所述皮下注射的位置为右侧胸部靠近腋中线处。所述皮下注射的注射量为150-250ul/只。
19.将所述的稳定过表达mif的lewis细胞株或所述的荷mif / lewis肺癌小鼠模型的构建方法在肺腺癌动物实验或临床试验中应用。
20.本发明所述的稳定过表达mif的lewis细胞株，即小鼠肺腺癌lewis-mif细胞已于2021年7月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为cctcc，地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山(八一路299号)武汉大学中国典型培养物保藏中心，该小鼠肺腺癌lewis-mif细胞在保藏中心的保藏编号为cctcc no：c202195。
21.与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：
22.1.本发明首次筛选出稳定过表达mif的lewis细胞株和动物模型，通过建立mif基因过表达细胞模型和动物模型，使模型靶点更加精准，对其他基因靶点无明显影响，且较现有抑制剂、激活剂相比精确度高。
23.2.本发明制备出的稳定过表达mif的lewis细胞株和动物模型，可作为基础的试验材料或模型细胞株，用于进一步的动物实验乃至临床试验，可用于探索肺腺癌的发生机制，寻找肺腺癌新的治疗靶点，为患者靶向治疗开辟新道路。
附图说明
24.图1为原始质粒骨架的载体图谱；
25.图2为过表达慢病毒质粒phs-avc-ly018的载体图谱；
26.图3为过表达慢病毒质粒phs-avc-ly018的酶切电泳图；
27.图4为过表达慢病毒质粒载体phs-avc-ly018的转染细胞的荧光拍照；
28.图5为对照质粒phs-bvc-lw345的转染细胞的荧光拍照；
29.图6为转染细胞的wb检测电泳图。
具体实施方式
30.下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
31.以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。以下实施例中所涉及的小鼠肺腺癌lewis肺癌细胞购自国家细胞资源中心。
32.以下实施例中所涉及的主要试剂和耗材如表1所示：
33.表1主要试剂和耗材
[0034][0035][0036]
以下实施例中所涉及得主要仪器与来源如表2所示：
[0037]
表2主要仪器和来源
[0038][0039]
实施例一：构建表达慢病毒质粒载体phs-avc-ly018
[0040]
(1)构建过表达慢病毒质粒载体
[0041]
根据鼠mif基因(ncbi reference sequence:nm_010798.3)构建过表达慢病毒质粒载体，原始质粒骨架如图1所示。
[0042]
构建过表达慢病毒质粒载体phs-avc-ly018，如图2所示，其载体元件为plv-hef1a-mneongreen-p2a-puro-wpre-cmv-mif cds(mouse，nm_010798)-3xflag。构建过表达慢病毒质粒载体的空载对照质粒phs-bvc-lw345，其载体元件为plv-hef1a-mneongreen-p2a-puro-wpre-cmv-mcs-3xflag。
[0043]
(2)转化大肠杆菌感受态细胞
[0044]
将合成的过表达慢病毒质粒载体phs-avc-ly018和空载对照质粒phs-bvc-lw345各取5μl转化至100μl大肠杆菌e.coli感受态，42℃金属浴，热激1min,冰上迅速预冷2min，在超净工作台中，加入600μl无抗培养基，37℃摇床振荡培养1h，取适量菌液涂布在含有抗生素amp的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h，菌落pcr后鉴定阳性克隆。挑选3-4个阳性克隆单菌落摇菌，加入相应抗性培养基摇菌过夜(8ml lb液体培养基)，然后参照质粒抽提试剂盒进行质粒抽提，得过表达慢病毒质粒载体phs-avc-ly018和空载对照质粒phs-bvc-lw345。
[0045]
(3)质粒酶切鉴定
[0046]
使用限制性内切酶对phs-avc-ly018质粒进行了酶切鉴定，结果如图3所示，泳道1为过表达慢病毒质粒载体phs-avc-ly018，泳道2为pvuii酶切后的过表达慢病毒质粒载体phs-avc-ly018，m为1kb dna marker。
[0047]
(4)目的基因的测序鉴定
[0048]
对phs-avc-ly018质粒得目的基因进行pcr测序，引物序列为gtaagtcattggtcttaaag，对pcr产物测序，得靶序列为：
[0049]5’‑
atgcctatgttcatcgtgaacaccaatgttccccgcgcctccgtgccagaggggtttctgtcggagctcacccagcagctggcgcaggccaccggcaagcccgcacagtacatcgcagtgcacgtggtcccggaccagctcatgacttttagcggcacgaacgatccctgcgccctctgcagcctgcacagcatcggcaagatcggtggtgcccagaaccgcaactacagtaagctgctgtgtggcctgctgtccgatcgcctgcacatcagcccggaccgggtctacatcaactattacgacatgaacgctgccaacgtgggctggaacggttccaccttcgct-3’[0050]
测序结果与目标序列完全一致，至此，获得构建正确的质粒。
[0051]
实施例二：包装慢病毒
[0052]
(1)准备lewis肺癌细胞
[0053]
将3～5
×
106个lewis肺癌细胞传代接种至100mm细胞培养皿中，置于37℃，5％co2的培养箱中，培养16h～24h。传代过程中需要将细胞充分消化为单细胞悬液，以获得较好的包装效果。
[0054]
(2)慢病毒包装系统转染
[0055]
将慢病毒包装试剂盒中的包装质粒混合物(package plasmid mix)、过表达慢病毒质粒载体phs-avc-ly018和空载对照质粒phs-bvc-lw345使用ddh2o稀释为终浓度1.0μg/μl的质粒溶液；取1支1.5ml离心管(标记为a管)分别加入300μl opti-mem培养基及40μl epfecttm transfection reagent，混匀后室温静置5min。然后取1支1.5ml离心管(标记为b管)，加入2.5μl终浓度为1.0μg/μl的慢病毒表达质粒溶液及7.5μl package plasmid mix，充分混匀；将a管中溶液加入b管中，充分混匀，室温静置15～30min；将b管中的混合溶液逐滴均匀加入接种lewis肺癌细胞的培养皿中，轻微水平震荡培养皿以混匀，将培养皿置于37℃，5％co2培养6h，将培养基更换为37℃水浴预热的新鲜完全培养基。
[0056]
病毒感染48h后，荧光显微镜观察转染细胞的gfp表达，包含过表达慢病毒质粒载体phs-avc-ly018的转染细胞如图4所示，图中a为荧光视野下的转染细胞(560nm激发波长)，b为明视场下的转染细胞。包含空载对照质粒phs-bvc-lw345的转染细胞如图5所示，图中a为荧光视野下的转染细胞(560nm激发波长)，b为明视场下的转染细胞。
[0057]
(3)慢病毒收集及浓缩
[0058]
转染48h后，分别收集含有慢病毒的上清液，向培养皿中补充10～15ml新鲜的完全培养基；继续培养24h，进行第二次病毒上清液收集；将两次收集的病毒上清液混合，0.45μm滤器过滤，过滤后的病毒液可以进行浓缩或直接感染目的细胞；按照病毒上清液：浓缩试剂＝5:1比例进行混合，4℃放置2h或过夜；将混合液按照4℃，4000g离心30min，可见管底有米白色沉淀；小心移去上清，切勿碰触沉淀物，加入适量体积无血清培养基或pbs溶液，用微量移液器轻轻吹打重悬沉淀物；将病毒浓缩液分装，保存于-80℃，即取即用，切忌反复冻融。分别得包装有过表达慢病毒质粒载体phs-avc-ly018和空载对照质粒phs-bvc-lw345的慢病毒。
[0059]
实施例三：病毒质量检测
[0060]
检测实施例二所得慢病毒的质量，慢病毒的质量控制要点包括物理状态检测、无菌检测及病毒滴度检测。
[0061]
(1)物理指标检测
[0062]
颜色判定，通过肉眼判定，慢病毒保存液呈澄清液体状。
[0063]
粘稠度判定，用20-200μl规格移液器缓慢吸取50μl慢病毒保存液体，无明显粘稠感或吸液滞后现象。
[0064]
(2)无菌检测
[0065]
将慢病毒接种lewis肺癌细胞验证，正常培养24h后镜检，无任何细菌及真菌污染情况，同时参照空细胞组，细胞间隙无明显颗粒存在，培养基澄清透明。
[0066]
(3)病毒滴度测定
[0067]
将生长状态良好的lewis肺癌细胞消化计数后，按照105细胞/孔接种至12孔培养板中，每种病毒接种3个孔，置于37℃，5％co2培养16～24h；取20μl浓缩后的慢病毒液，稀释10倍后，分别取100/50/25μl，加入接种有lewis肺癌细胞的12孔板中，并添加终浓度为8μg/ml的促感染试剂polybrene，将培养液混匀后，置于37℃，5％co2培养48～72h；提取上述感染慢病毒的lewis肺癌细胞的基因组dna，稀释已知拷贝数的dna标准品(104～109copies/μl)，与上述基因组同时进行qrt-pcr检测，qrt-pcr实验的扩增/检测对象为慢病毒载体上的wpre序列(wpre序列可以随目的基因整合入细胞基因组)，根据qrt-pcr的实验数据进行整理换算，即可获得慢病毒液的滴度。
[0068]
感染慢病毒的lewis肺癌细胞中病毒滴度测定结果如表3所示：
[0069]
表3病毒滴度测定结果
[0070][0071]
实施例四：筛选稳定过表达mif的lewis细胞株
[0072]
(1)细胞复苏、传代及冻存
[0073]
复苏：将lewis细胞，置37℃水浴中振摇使细胞快速融化；细胞冻存液加入5-10ml无血清dmem高糖培养基，1,000rpm离心5min后吸弃上清；用新鲜的完全培养液悬浮细胞后，
传至培养瓶中培养，待细胞长满后传代。
[0074]
传代：细胞长至单层后倾去培养液；用温的1
×
pbs洗3次(加pbs时应沿培养皿侧壁缓缓加入)；加入适量胰酶，转动培养皿，0.25％胰酶37℃消化1-2min；显微镜下观察，细胞间的胞间连丝蛋白被消化脱落，细胞呈类圆形，加入含血清培养基终止消化(切不可消化过度)；将细胞吹落，收集进10ml离心管，800转，5min离心，弃上清，用新的含血清培养基重悬细胞；按1：3传代培养。
[0075]
冻存：经消化、终止、离心后收集的细胞沉淀，用适量冻存液悬起，1ml/管分装入冻存管；培养基为70％完全培养基 20％fbs 10％dmso，放入细胞冻存盒中于-80℃静置过夜，然后迅速移入液氮中长期保存。
[0076]
(2)筛选lewis细胞对puromycin耐药浓度
[0077]
制备lewis细胞悬液，血球计数板计数；对细胞进行铺板，30000个cell/24孔，共12个24孔，37℃，co2培养箱培养过夜；当细胞汇合度达到30-40％时，配置如下浓度的puro：0ug/ml；0.5ug/ml；1ug/ml；1.5ug/ml；2ug/ml；2.5ug/ml；3ug/ml；3.5ug/ml；4ug/ml；4.5ug/ml；5ug/ml；5.5ug/ml。每个24孔加入1ml上述各浓度的嘌呤霉素(puromycin)，37
°
co2培养箱培养3天左右，培养基为89.5％1640培养基 9.5fbs％ 1％双抗(ps)，全部细胞死亡的最低浓度作为该细胞对puromycin的最佳耐药浓度。
[0078]
lewis细胞到3天0-2μg/ml的puromycin浓度细胞有不同孔数细胞存活，2.5-5.5μg/ml的puromycin浓度的细胞部分死亡。lewis细胞选择2.5μg/ml的puromycin浓度为最佳耐受浓度。
[0079]
(3)慢病毒感染moi值预实验
[0080]
1)设置moi梯度
[0081]
按照不加病毒0、10、20、50和100来设置moi梯度，不加病毒组用来判定细胞状态；
[0082]
2)细胞铺板
[0083]
将lewis细胞细胞配成细胞悬液按固定细胞个数铺至孔板。24孔板，没孔3
×
104个细胞；
[0084]
3)慢病毒感染
[0085]
细胞铺板10-12h后感染病毒，病毒加入量＝(细胞数
×
moi值/病毒原液滴度)
×
103，加入终浓度为8μg/ml的ploybrene，12-24小时后更换新鲜培养基。
[0086]
4)确定合适的moi值
[0087]
提前将培养基置于37℃预热，弃去含病毒的旧培养基，重新吸取预热好的新鲜完全培养基，加入24孔板中，置于37℃培养箱继续培养；病毒感染72h后荧光显微镜拍照观察细胞感染效率，确定合适的moi值。
[0088]
moi值＝病毒数/细胞数。
[0089]
计算实施例二所得分别包装有过表达慢病毒质粒载体phs-avc-ly018和空载对照质粒phs-bvc-lw345的慢病毒的mio值如表4所示：
[0090]
表4病毒mio测定
[0091][0092]
以高效、低moi值、对细胞低毒性为最佳感染条件，lewis细胞选择moi 100后续实验。
[0093]
(3)筛选稳定过表达mif的lewis细胞株
[0094]
制备lewis细胞悬液，使用细胞计数板计数；将细胞进行铺板，30000个cell/24孔，共14个24孔，37℃，co2培养箱培养过夜；当细胞汇合度达到50％时，从-80℃冰箱取出实施例二所得分别包装有过表达慢病毒质粒载体phs-avc-ly018和空载对照质粒phs-bvc-lw345的慢病毒于冰上融化；细胞使用无双抗无血清dmem高糖培养基洗三遍，然后使用无双抗无血清dmem高糖培养基以1:50分别稀释包装有过表达慢病毒质粒载体phs-avc-ly018和空载对照质粒phs-bvc-lw345的慢病毒，选择的合适moi值为100，每个24孔分别加入各稀释度的病毒500ul，每个病毒重复两孔，于37℃co2培养箱培养过夜后换完全培养基；换液48h后于荧光显微镜下观察细胞形态，配置10％fbs 1640 双抗 puro培养基，以2.5μg/ml的puromycin浓度对细胞进行药筛，2-3天跟换新鲜的上述培养基；(整个病毒操作过程严格遵照慢病毒操作手册)。细胞药筛后进行扩培，直至10cm dish长满，在荧光显微镜下观察细胞，荧光表达良好，收细胞沉淀用于wb检测mif的表达，以β-tubulin作为内参。
[0095]
结果如图6所示：
[0096]
泳道1为未转染慢病毒的空白lewis细胞，泳道2为包装空载对照质粒phs-bvc-lw345的慢病毒转染的lewis细胞，泳道3为包装过表达慢病毒质粒载体phs-avc-ly018的慢病毒的lewis细胞。内参β-tubulin检测显示检测结果为正常阳性结果。泳道3中检测到20kd处特异的阳性条带，即为超表达的mif蛋白。
[0097]
至此，筛选得稳定过表达mif的lewis细胞株和含空载对照质粒phs-bvc-lw345的lewis细胞株。将稳定过表达mif的lewis细胞株命名为小鼠肺腺癌lewis-mif细胞，于2021年7月29日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为cctcc，地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山(八一路299号)武汉大学中国典型培养物保藏中心，该小鼠肺腺癌lewis-mif细胞在保藏中心的保藏编号为cctcc no：c202195。
[0098]
实施例五：建立荷lewis小鼠模型与荷mif / lewis肺癌小鼠模型
[0099]
选取4-5周龄，雄性c57bl/6小鼠70只，取实施例四制备的稳定过表达mif的lewis细胞株和含空载对照质粒phs-bvc-lw345的lewis细胞株，分别制备细胞悬液，细胞终浓度为2.0
×
106个/ml；用1ml注射器吸取细胞悬液，在c57bl/6小鼠右侧胸部靠近腋中线，皮下注射细胞悬液200ul/只。接瘤成功后，常规饲养于spf级饲养室。
[0100]
综上所述，本发明首次筛选出稳定过表达mif的lewis细胞株和动物模型，通过建立mif基因过表达细胞模型和动物模型，可作为基础的试验材料或模型细胞株，用于进一步的动物实验乃至临床试验，可用于探索肺腺癌的发生机制，寻找肺腺癌新的治疗靶点，为患者靶向治疗开辟新道路。
[0101]
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人
员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。