三尖杉酯碱类N-oxide衍生物及其制备方法和用途与流程

三尖杉酯碱类n-oxide衍生物及其制备方法和用途
技术领域
1.本发明属医药技术领域，具体涉及一种篦子三尖杉中三尖杉酯碱类n-oxide衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途，尤其是在制备治疗肺癌、白血病或骨髓瘤等肿瘤疾病药物中的用途。


背景技术：

2.目前已知，恶性肿瘤严重威胁人类的健康和生命，已成为全球最主要的死亡原因之一。我国的恶性肿瘤发病现状则尤为严峻，近年来一直呈上升趋势。据国家癌症中心公布的最新数据显示，我国癌症每年的新发病例约为380.4万例，其中肺癌的发病率及死亡率均居首位(siegel et al.,cacancer j clin 2017,67,7-30)。而现阶段针对恶性肿瘤疾病的治疗方案仍以化学治疗、放射治疗为主，医疗实践显示上述治疗措施副作用大、复发率高，且易产生耐药性，临床疗效不理想。因此，研制开发具有高效低毒的抗肿瘤药物是医药学界积极攻关并迫切希望取得突破的重大课题。中药以其独特的药性理论和确切的临床疗效越来越受到医药工作者的重视。同时，来源于中药的天然产物往往具有结构复杂性和多样性的特点，是创新药物研发的重要来源。因此，从中药活性成分中开发研制新型的抗肿瘤药物具有广阔的研究前景(newman and cragg,jnat prod 2020,83,770-803)。
3.篦子三尖杉(cephalotaxus oliverimast.)为三尖杉科(cephalotaxaceae)三尖杉属的珍稀濒危植物，零星生长于海拔300-1800米范围内的原生及次生性常绿阔叶林中，在我国的川、渝、粤、桂、赣、湘、鄂、黔、滇等省均有分布。由于篦子三尖杉的遗传多样性水平较低、自身增殖能力有限，加之人工采伐和生态环境破坏等原因，导致其自然数量急剧减少，已被中国植物红皮书定为渐危种，并于1999年被列为国家二级保护植物(fu et al.,china plant red data book:rare and endangered plants,science press:beijing,1992,pp 26)。三尖杉属曾隶属于紫杉科，但后来基于其特殊的植物形态、组织解剖、地理分布等特征，尤其是该属植物化学成分的独特性，使得该属随之被上升为独立的科(三尖杉科，仅下辖三尖杉属1属)(aldelkafi et al.,nat prod rep 2012,29,845-869)。三尖杉属植物的种子具有消积、润肺和驱虫等作用，在我国传统应用中具有治疗蛔虫病、钩虫病、食积等症的功效。同时，研究表明三尖杉属植物富含生物碱和双黄酮类成分，其中生物碱类为其主要活性成分。20世纪60年代初，paudler等首次从三尖杉和日本粗榧植物中分离得到生物碱成分(paudler et al.,j org chem 1963,28,2194-2197)，但直至1969年powell等通过x射线单晶衍射才确定了它们的结构，并发现其中的三尖杉酯碱类化合物对小鼠p388、l-1210白血病细胞具有明显的抑制活性(powell et al.,tetrahedron lett 1969,46,4081-4084；mikolajczak et al.,tetrahedron 1972,28,1995-2001)。自此三尖杉碱类独特的五元稠环结构及显著的药理活性便引起了世界各国研究学者的关注，研究结果层出不穷且不断深入。我国于20世纪70年代初在全国范围内成立了三尖杉研究协作组，对分布在我国境内的三尖杉属植物进行资源普查和化学成分研究，并率先将其中的三尖杉酯碱(harringtonine)和高三尖杉酯碱(homoharringtonine)开发成抗癌药物，现已被列为世界
36种常用抗癌药物，临床上用于治疗慢性粒细胞性白血病(cml)和急性非淋巴细胞性白血病(anll)(mei et al.,chinese herb med 2006,452-458)。美国fda于2012年10月批准了高三尖杉酯碱(hht,synribo)用于治疗慢性粒细胞白血病(cml)，适用于对两种或多种酪氨酸激酶抑制剂(tkis)有耐药性和/或耐受性的慢性期或加速期cml成人患者(kantarjian et al.,lymph myelom leuk 2013,13,530
–
533)。
4.然而，目前针对我国特有植物篦子三尖杉的化学成分研究鲜有报道。本技术的发明人，基于现有技术现状，为寻找新型的抗肿瘤药物先导化合物及进一步探索、拓展三尖杉酯碱类成分的临床应用范围(不局限于白血病)，拟对篦子三尖杉中的具有n-oxide官能团的新颖生物碱成分及其抗肿瘤活性展开研究。


技术实现要素：

5.本发明目的是提供一种篦子三尖杉中三尖杉酯碱类n-oxide衍生物及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的用途，尤其是在制备治疗肺癌、白血病和骨髓瘤等肿瘤疾病药物中的用途。
6.本发明从我国特有珍稀濒危药用植物篦子三尖杉中提取分离到三尖杉酯碱类n-oxide衍生物，经体外抗肿瘤活性测试表明，该类生物碱成分在多种被测人肿瘤细胞株均上均具有显著的细胞毒活性，可用于制备抗肿瘤药物或该类药物的先导化合物。
7.本发明所述的三尖杉酯碱类n-oxide衍生物(cephaloverinesa-d,1-4)，以三尖杉酯碱母核中的氮原子形成n-oxide形式(氮氧化物，n
→
o)为主要结构特征，其具有如下结构式，且cephaloverines a-d为首次报道的天然的三尖杉酯碱类(cephalotaxine ester-type)n-oxide衍生物。
8.本发明提出的三尖杉酯碱类n-oxide衍生物，所述三尖杉酯碱类n-oxide衍生物的结构式如下中任一种(cephaloverinesa-d,(1)-(4)：
[0009][0010]
本发明提出的三尖杉酯碱类n-oxide衍生物的制备方法，具体步骤如下：
[0011]
以篦子三尖杉枝叶为原料，将其粉碎后，采用95％乙醇室温下浸渍提取，提取液减压浓缩后，悬浮于适量3％酒石酸水溶液中，以等体积的乙酸乙酯萃取3-5次，萃取后的酒石酸水溶液经na2co3调节ph值至10，后采用氯仿萃取得到氯仿提取物(即为总生物碱部位)；所得氯仿提取物经mci树脂、聚酰胺树脂、sephadex lh-20凝胶柱层析及反相半制备hplc色谱
分离，制备得到化合物cephaloverines a-d。
[0012]
本发明提出的三尖杉酯碱类n-oxide衍生物在制备肿瘤疾病药物中的用途。
[0013]
本发明中，所述的肿瘤疾病是肺癌、白血病或骨髓瘤中任一种。
[0014]
本发明中，所述的三尖杉酯碱类n-oxide衍生物单独用于或者联合用于制备治疗肿瘤疾病的药物。
[0015]
本发明中，所述的三尖杉酯碱类n-oxide衍生物与药学上可接受的载体或赋形剂结合，制成口服或者非口服剂型。
[0016]
本发明所述的化合物可通过从篦子三尖杉枝叶中分离纯化得到；也可经本领域技术人员熟知的化学方法合成获得。
[0017]
本发明对所得的三尖杉酯碱类n-oxide衍生物(cephaloverines a-d)进行了体外抗细胞毒活性测试，结果表明，该类化合物对多种被测人肿瘤细胞株(人非小细胞肺癌a549、人大细胞肺癌nci-h460、人早幼粒急性白血病hl60、人浆细胞白血病nci-h929和人骨髓瘤细胞rpmi-8226)的增殖均具有显著的抑制活性，因此可用于制备抗肿瘤药物，尤其是在制备治疗肺癌、白血病和骨髓瘤等肿瘤疾病药物或作为该类药物的先导化合物。
[0018]
本发明的有益效果在于：
[0019]
所述目标化合物(cephaloverinesa-d,1-4)为首次发现的具有n-oxide形式的天然三尖杉酯碱类(cephalotaxine ester-type)成分，其化学结构新颖，迄今尚未发现有任何文献报道；且cephaloverinesa-d为三尖杉属生物碱(cephalotaxus alkaloids)中首次报道的具有显著抗肿瘤活性的n-oxide衍生物。此外，本发明首次在人浆细胞白血病(nci-h929)细胞株上对三尖杉酯碱类成分的抗肿瘤活性进行了评价。该类化合物(cephaloverines a-d)对5种被测人肿瘤细胞均表现出显著的细胞毒活性，在日趋严峻的肿瘤疾病(如肺癌)的治疗上具有可观的应用前景。
具体实施方式
[0020]
下面结合实施例对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施中所作的任何变动都将落在权利要求书的范围内。
[0021]
下述实施例中，比旋光测试通过jasco p-1020旋光仪完成；紫外和红外光谱数据分别通过shimadzu uv-2550紫外光谱仪和nicolet avatar 360型红外光谱仪获得；nmr用brukeravance ii 400型和600型核磁仪测定；ms由agilent 1100series lc/msd g1946d型仪测定，hr-ms由ab sciex tripletof 5600型仪测定；sephadex lh-20凝胶为瑞士ge healthcare bio-sciences公司生产，mci gel chp 20p(75-150μm)为日本三菱公司生产，聚酰胺树脂(30-60目)为台州市路桥四甲生化公司生产；半制备hplc为waters e2695，配备2998pda和2424蒸发光散射双检测器以及sunfire ods(5μm,250
×
10mm)半制备柱；所有试剂均为上海国药集团化学试剂有限公司生产。
[0022]
实施例1：制备天然三尖杉酯碱类n-oxide衍生物(cephaloverinesa-d,1-4)
[0023]
篦子三尖杉干燥枝叶(9.0kg)充分粉碎后经95％乙醇室温提取4次，合并提取液，减压浓缩得到总浸膏700g。总浸膏经3％的酒石酸水溶液分散后使用乙酸乙酯萃取(4次)，所得的乙酸乙酯层为非生物碱部分，剩余水层经na2co3调节ph至10后用氯仿萃取，浓缩后的
4"),30.4(c-11),19.7(c-7)；esims m/z 548[m h]

,1095[2m h]

；hresims m/z 548.2486[m h]

(calcd for c
28h38
no
11
,548.2490)；
[0026]
cephaloverine c(3):无色胶状物；[α]
d20
–
68(c 0.10,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)291(3.50)nm；ir(film)ν
max
:3384,2970,2922,2850,1753,1649,1594and 1488cm-1
；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ6.74(1h,s,h-17),6.51(1h,s,h-14),5.90(1h,br s,h-18),5.82(1h,br s,h-18),5.78(1h,d,j＝9.6hz,h-3),5.31(1h,s,h-1),4.03(1h,d,j＝9.6hz,h-4),3.79(1h,m,h-8b),3.76(1h,m,h-8a),3.70(1h,m,h-10a),3.67(3h,s,ome-19),3.66(1h,m,h-10b),3.31(1h,m,h-11b),2.56(1h,dd,j＝14.0,6.5hz,h-11a),2.45(1h,m,h-6a),1.98(1h,m,h-6b),1.91(1h,m,h-7a),1.74(1h,d,j＝16.2hz,h-3'),1.72(1h,m,h-7b),1.45(1h,d,j＝16.2hz,h-3'),1.35(1h,m,h-1"),1.34(1h,m,h-2"),1.30(1h,m,h-1"),1.08(1h,m,h-2"),0.99(3h,s,ome-5"),0.95(3h,s,ome-4")；
13
c nmr(100mhz,dmso-d6):δ172.8(c-1'),170.9(c-4'),162.0(c-2),145.5(c-16),145.3(c-15),130.6(c-12),128.6(c-13),111.3(c-14),109.1(c-17),100.5(c-18),99.4(c-1),86.5(c-5),74.4(c-2'),71.6(c-3),68.3(c-3"),67.5(c-8),60.7(c-10),57.8(c-19),50.7(c-4),43.0(c-3'),38.0(c-6),36.7(c-2"),33.5(c-1"),29.9(c-5"),28.5(c-4"),27.2(c-11),17.3(c-7)；esims m/z 534[m h]

；hresims m/z534.2329[m h]

(calcdfor c
27h36
no
10
,534.2334)；
[0027]
cephaloverine d(4):无色胶状物；[α]
d20
–
45(c 0.10,meoh)；uv(meoh)λ
max
(logε)291(3.48)nm；ir(film)ν
max
:3386,2970,2924,2853,1731,1649,1500and 1488cm-1
；1h nmr(600mhz,dmso-d6):δ6.74(1h,s,h-17),6.57(1h,s,h-14),5.89(1h,br s,h-18),5.84(1h,d,j＝9.6hz,h-3),5.80(1h,br s,h-18),5.34(1h,s,h-1),4.10(1h,d,j＝9.6hz,h-4),3.95(1h,m,h-8b),3.89(1h,m,h-8a),3.84(1h,m,h-10a),3.80(1h,m,h-10b),3.70(3h,s,ome-19),3.38(1h,m,h-11b),2.85(1h,s,h-3'),2.62(1h,dd,j＝14.0,6.5hz,h-11a),2.51(1h,m,h-6a),2.07(1h,m,h-6b),2.04(1h,m,h-7a),2.01(1h,m,h-7b),1.45(1h,ddd,j＝12.4,12.0,6.0hz,h-1"),1.33(1h,m,h-1"),1.32(1h,m,h-2"),1.11(1h,m,h-2"),1.01(3h,s,ome-5"),0.97(3h,s,ome-4")；
13
c nmr(150mhz,dmso-d6):δ173.3(c-4'),171.9(c-1'),162.6(c-2),145.7(c-16),145.4(c-15),130.4(c-12),128.1(c-13),111.6(c-14),109.4(c-17),100.5(c-18),98.9(c-1),87.2(c-5),79.2(c-2'),73.6(c-3'),71.7(c-3),68.4(c-3"),67.6(c-8),60.6(c-10),57.9(c-19),50.6(c-4),37.7(c-6),36.7(c-2"),29.2(c-1"),29.8(c-5"),28.7(c-4"),27.2(c-11),17.4(c-7)；esims m/z 550[m h]

；hresims m/z 550.2253[m h]

(calcd for c
27h36
no
11
,550.2283)。
[0028]
实施例2：测定三尖杉酯碱类n-oxide衍生物对肿瘤细胞增殖的抑制作用
[0029]
实验材料及方法：人非小细胞肺癌a549、人大细胞肺癌nci-h460、人早幼粒急性白血病hl60、人浆细胞白血病nci-h929和人骨髓瘤细胞rpmi-8226均购自atcc。所有细胞均采用含10％的胎牛血清(fbs)，100units/ml青霉素及100units/ml的链霉素(invitrogen)的rpmi-1640培养基(thermo fisher scientific)进行培养。所有细胞均保存于37℃,5％co2条件下培养。细胞存活率采用标准的mtt法进行测试：细胞以5000cells/well为最终密度在96孔板上培养12h后，按预定的各浓度梯度(10-2-102μm)进行加样，为排除光毒作用影响，整个操作过程应避免强光照并于暗黑的培养箱内培养。harringtonine为阳性对照。48小时后，细胞用新鲜的培养基(无fbs)清洗，然后加入mtt溶液(5mg/ml)继续孵化4小时，弃去悬
浮物后加入100μl的dmso(sigma-aldrich)，用酶标仪(flx 800,bio-tek instruments,inc.usa)检测570nm下每个孔的吸收值，ic
50
值则通过sigmaplot10.0软件计算曲线中细胞的存活率比log浓度所得，测试结果如表1所示。
[0030]
表1.cephaloverinesa-d(1-4)的细胞毒活性
[0031][0032]
a ic
50 value of each tested compound was defined as the concentration that caused 50％inhibition of cell growth.the results are averages of six independentexperiments.bpositive control.。
[0033]
抗肿瘤活性测试结果表明，化合物cephaloverinesa-d(1-4)对5株被测人肿瘤细胞(人非小细胞肺癌a549、人大细胞肺癌nci-h460、人早幼粒急性白血病hl60、人浆细胞白血病nci-h929和人骨髓瘤细胞rpmi-8226)的生长均具有显著的抑制活性(表1)，ic
50
值的主要范围为0.45-9.34μm，表明本发明所述化合物可用于制备治疗肺癌、白血病或骨髓瘤等肿瘤疾病的药物或是作为该类药物的先导化合物。