一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法与流程

一种
β-烟酰胺单核苷酸的制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物催化领域，具体涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，尤其是生物催化制备方法。


背景技术：

2.β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononuclotide，β-nmn或nmn)是nad

(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，又称辅酶1)最直接的前体，nad

是参与细胞新陈代谢、氧化还原、蛋白质转录等上千种重要生理反应的重要活性物。由于nad 分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，其体内主要依赖于细胞的合成，而且合成量很低。但随着对nad

前体小分子物质β-nmn的研究发现，食用β-nmn可以有效提升体内nad

的含量升高，并显著抑制衰老引起的新陈代谢，使得β-nmn成为了“不老神药”，在功能性保健食品方面有着很大的开发潜力和市场前景。目前nmn在欧、美、日等发达国家已批准作为保健食品原料，并以nmn为主要成份开发出多种保健品，如美国herbalmax、基因港geneharbor nmn9000、日本mirai lab nmn3000胶囊、澳大利亚synext等。
[0003][0004]
生物酶法制备nmn的其中一条路线是以d-核糖和烟酰胺为起始原料，在核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶等的作用下，经过三步催化反应得到nmn。其中涉及到第三步反应为5-磷酸核糖-1-焦磷酸(prpp)在烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase，nampt)的催化下生成nmn的反应。us10519429中公开了genbank登录号为cp001743.1的野生型nampt酶的多个突变体较之野生型酶活提高1.2-6.9倍，其中酶活最高的突变体为e231q/d298a/d338e/d377e。但是底物浓度低，且nmn产率也并不高。因此仍然需要开发更高活性的nampt酶用于nmn的生产。


技术实现要素：

[0005]
本发明所要解决的技术问题是为克服现有的烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活不高、β-烟酰胺单核苷酸产率低等问题，提供了一种高效制备β-烟酰胺单核苷酸的方法。本发明的发明人通过筛选，意外发现了四种催化能力强的烟酰胺磷酸核糖转移酶，通过催化5-磷酸核糖-1-焦磷酸生产β-烟酰胺单核苷酸，其β-烟酰胺单核苷酸产率可以达到60％以上，催化底物浓度可达40g/l以上，催化效率高，能够用于工业化大生产。
[0006]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之一为：提供一种β-烟酰胺单核苷酸(nmn)的制备方法，其包括使用烟酰胺磷酸核糖转移酶，将5-磷酸核糖-1-焦磷酸和烟酰胺进行磷酸化反应制得所述β-烟酰胺单核苷酸；其中所述烟酰胺磷酸核糖转移酶为氨基酸序列如ncbi登录号为wp_058739098.1、wp_011954786.1、np_932427.1和/或wp_067153313.1所示的烟酰胺磷酸核糖转移酶。
[0007]
优选地，编码所述烟酰胺磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如seq id no:1-4所示。
[0008]
在优选的具体实施例中，所述5-磷酸核糖-1-焦磷酸的浓度为10g/l～100g/l，例如20g/l、40g/l。
[0009]
在更优选的具体实施例中，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶与5-磷酸核糖-1-焦磷酸的用量的质量比为1:40～1:2。
[0010]
在更优选的具体实施例中，其中，所述烟酰胺与5-磷酸核糖-1-焦磷酸的摩尔浓度比为10:1～0.5:1，例如1:1、2:1、4:1。
[0011]
在更优选的具体实施例中，所述焦磷酸酶与5-磷酸核糖-1-焦磷酸的用量的质量比为1:40～1:2，例如3:40。
[0012]
在优选的具体实施例中，所述磷酸化反应的ph为5.5-8.0，优选6.0～6.5；和/或，所述磷酸化反应的温度为25～40℃，优选30-35℃。
[0013]
在优选的具体实施例中，所述制备方法还包括使用焦磷酸酶，例如氨基酸序列如ncbi登录号为p19117.2、p00817、p37487、p38576、np_418647和/或p95765所示的焦磷酸酶。焦磷酸酶ppase为将焦磷酸水解成2分子的磷酸的酶。在本发明的nmn的制造方法中，通过在ppase的存在下，进行反应，从而能够极其有效率地促进反应的进行。
[0014]
优选地，编码所述焦磷酸酶的核苷酸序列如seq id no:5的核苷酸序列所示，或如ncbi登录号为nc_001134.8的第257112-257975位、nc_000964.3的第4168204-4169133位、nc_006461.1的第1840559-1841086位、nc_000913.3的第4449122-4449652位或nc_009785.1的第1709713-1710648位的核苷酸所示。
[0015]
在优选的具体实施例中，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶或所述焦磷酸酶的制备包括以下步骤：
[0016]
(1)将含有所述烟酰胺磷酸核糖转移酶或焦磷酸酶基因的工程菌培养至od600为0.5～1.0优选0.8，25℃诱导优选用终浓度为0.1mm的iptg诱导并培养12～24小时，优选16小时；
[0017]
(2)收集菌体并以1:(5～10)的重量体积比重悬至缓冲液，破碎后得到粗酶液；所述重量体积比为g:ml。
[0018]
优选地，所述粗酶液经纯化，例如用ni bestarosehp树脂纯化，和/或，所述缓冲液为50mm ph 7.5的tris-hcl或pbs缓冲液。
[0019]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之二为：提供一种酶组合物，其中，所述酶组合物包括：
[0020]
(1)氨基酸序列如ncbi登录号为wp_058739098.1、wp_011954786.1、np_932427.1和wp_067153313.1所示的烟酰胺核糖核苷激酶中的至少两种；
[0021]
(2)烟酰胺磷酸核糖转移酶和焦磷酸酶；其中，所述烟酰胺磷酸核糖转移酶为氨基酸序列如ncbi登录号为wp_058739098.1、wp_011954786.1、np_932427.1和/或wp_
067153313.1所示的烟酰胺磷酸核糖转移酶，所述焦磷酸酶为氨基酸序列如ncbi登录号为p19117.2、p00817、p37487、p38576、np_418647和/或p95765所示的焦磷酸酶；
[0022]
优选地，编码所述烟酰胺磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如seq id no:1-4所示；和/或，编码所述焦磷酸酶的核苷酸序列如seq id no:5的核苷酸序列所示，或如ncbi登录号为nc_001134.8的第257112-257975位、nc_000964.3的第4168204-4169133位、nc_006461.1的第1840559-1841086位、nc_000913.3的第4449122-4449652位或nc_009785.1的第1709713-1710648位的核苷酸序列所示。
[0023]
为解决上述技术问题，本发明的技术方案之三为：提供一种烟酰胺磷酸核糖转移酶或如上所述的酶组合物在制备nmn中的用途；其中所述烟酰胺磷酸核糖转移酶为ncbi登录号为wp_058739098.1、wp_011954786.1、np_932427.1和/或wp_067153313.1的烟酰胺磷酸核糖转移酶。
[0024]
优选地，编码所述烟酰胺磷酸核糖转移酶的核苷酸序列如seq id no:1-4的核苷酸序列所示。
[0025]
若无特别说明，本文所述的各反应物的浓度和比例均指该物质在反应总体系中的初始浓度和初始比例。
[0026]
本发明的积极进步效果为：
[0027]
本发明的烟酰胺磷酸核糖转移酶的酶活高，利用其制备β-烟酰胺单核苷酸具有工艺操作简单、适用于更高的底物浓度、转化率高、生产效率高的优点。底物prpp的浓度可以达到40g/l以上；nmn的产率可以达到30％以上，优选的技术方案中nmn的产量可以达到40％、50％甚至60％以上。
附图说明
[0028]
图1为烟酰胺磷酸核糖转移酶enz.08催化反应后β-烟酰胺单核苷酸的产率图谱；
[0029]
图2为产物β-烟酰胺单核苷酸对照品图谱；
[0030]
图3为原料烟酰胺对照品图谱。
具体实施方式
[0031]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0032]
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参考j.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
[0033]
pet28a和蛋白抽提试剂(bugbuster protein extraction reagent)购买自novagen公司；dpni酶购买自英潍捷基(上海)贸易有限公司；ndei酶、hindiii酶购买自thermo fisher公司，e.coli bl21(de3)感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。prrr采购于苏州麦轮生物科技有限公司；烟酰胺采购自于上海麦克林生化科技有限公司。
[0034]
具体实施例中涉及的离子对hplc检测方法：
[0035]
色谱柱：welch ultimate aq-c18(5μm，4.6*250mm)；缓冲液：0.05mol/l磷酸氢二
铵水溶液：10％四丁基氢氧化铵水溶液＝91：1(体积比)，磷酸调节ph至3.6；流动相：乙腈：缓冲液＝8：92(体积比)；流速：1.0ml/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：10μl；运行时间：40min；稀释液：超纯水。
[0036]
实施例1烟酰胺磷酸核糖转移酶的制备
[0037]
lb液体培养基组成：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
[0038]
tb液体培养基组成：蛋白胨10g/l，酵母粉18g/l，甘油4ml/l，kh2po42.31g/l、k2hpo4·
2h2o 16.43g/l，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
[0039]
烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)氨基酸信息见下表1。其中，enz.01为专利us10519429b2中突变体e231q/d298a/d338e/d377e(即序列46)，enz.02为专利us10519429 b2中突变体f180a(即序列3)，enz.03、enz.04、enz.05为scientific report，2018(8)，1～11中的nampt酶。由苏州金唯智生物科技有限公司(江苏省南京市江北新区研创园浦滨路211号)全基因合成，酶切位点ndei、hindiii，载体pet28a。合成的nampt基因转化至宿主e.coli bl21(de3)感受态细胞，得到含有nampt基因的工程菌株。
[0040]
表1烟酰胺磷酸核糖转移酶
[0041][0042]
将含有nampt基因的工程菌分别在平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml lb液体培养基中，37℃震荡培养4h。按1％(v/v)接种量转接至150ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜tb液体培养基中，37℃震荡培养至od600达到0.8左右时，加入iptg至其终浓度为0.1mm，25℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液4℃3000g离心20min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。
[0043]
将收集到的菌体取3g，重悬于30ml 50mm ph 7.5的tris-hcl缓冲液中，4℃高压均质破碎，得到nampt粗酶液，将均质后的粗酶液用ni bestarosehp(博格隆(上海)生物技术有限公司，产品编号aa0041)树脂纯化，用bradford试剂盒(采购自上海捷瑞生物工程有限公司)测定蛋白浓度，保存于-20℃冰箱待用。
[0044]
酶活测定方法：
[0045]
1ml反应体系中，在980μl(50mm ph7.5)tris-hcl缓冲液中，加入10mg底物prpp，7mg底物nam，0.4mg mgcl2·
6h2o，10μl nampt酶液，30℃摇床200rpm反应，反应体系具体参数见下表2。
[0046]
表2酶活检测反应体系
[0047][0048]
每10min连续取样，用ph 2.0左右的稀盐酸稀释10倍后，离子对hplc检测，根据产物nmn的标准曲线计算出nmn的浓度，计算酶活。
[0049]
酶活定义为：在ph7.5，30℃条件下，每分钟生成1μmol nmn所需的酶量为1个酶活力单位(1u)。
[0050]
我们将enz.03的比酶活记为100，其他nampt的相对比酶活如下表3。
[0051]
表3相对比酶活
[0052][0053]
实施例2焦磷酸酶的制备
[0054]
根据焦磷酸酶(ppase，ncbi登录:p19117.2)，基因(seq id no:5)全合成ppase基因，酶切位点ndei、hindiii，载体pet28a。合成的ppase基因转化至宿主e.coli bl21(de3)感受态细胞，得到含有ppase酶基因的工程菌株。
[0055]
将含有ppase基因的工程菌分别在平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml lb液体培养基中，37℃震荡培养4h。按1％(v/v)接种量转接至150ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜tb液体培养基中，37℃震荡培养至od600达到0.8左右时，降温至25℃，后加入iptg至其终浓度为0.1mm，诱导培养16h。培养结束后，将培养液于4℃3000g离心20min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。
[0056]
将收集到的菌体取3g，重悬于30ml 50mm ph 7.5的tris-hcl缓冲液中，4℃高压均质破碎，得到ppase粗酶液，将均质后的粗酶液用ni bestarosehp(博格隆(上海)生物技术有限公司，产品编号aa0041)树脂纯化，用bradford试剂盒(采购自上海捷瑞生物工程有限公司)测定蛋白浓度，保存于-20℃冰箱待用。蛋白浓度：15mg/ml。
[0057]
由于焦磷酸酶的作用是将焦磷酸水解成2分子的磷酸的酶，在本发明的nmn的制造方法中，在ppase的存在下进行反应，从而能够极其有效率地促进催化反应的进行。因此所述焦磷酸酶的核苷酸序列还可以如ncbi登录号为nc_001134.8的第257112-257975位、nc_000964.3的第4168204-4169133位、nc_006461.1的第1840559-1841086位、nc_000913.3的第4449122-4449652位或nc_009785.1的第1709713-1710648位核苷酸所示。对应地，焦磷酸酶的氨基酸序列如ncbi登录号为p19117.2、p00817、p37487、p38576、np_418647和/或
p95765所示。
[0058]
实施例3ph对酶催化反应的影响
[0059]
测定不同ph下nampt催化的反应转化率。分别在ph5.5、ph6.0、ph7.0和ph8.0，30℃反应，连续取样，监测反应进程。
[0060]
在反应体系中加入7ml纯水，加入200mg prpp、100mg烟酰胺、30℃水浴搅拌溶解，用4％氢氧化钠水溶液(质量体积比)调ph至大致范围，再用20％碳酸钠水溶液(质量体积比)微调ph，分别加入1ml nampt液体纯酶液和2ml的ppase纯酶液。30℃水浴，250rpm搅拌，连续反应，反应过程中离子对hplc测定nmn的生成，并计算nmn的产率。产率如下表4。
[0061]
表4ph值对酶反应的影响
[0062][0063][0064]
结果显示，ph 6.0～7.0之间，nmn产率最高，本发明选取ph6.0继续进行催化反应。
[0065]
实施例4温度对酶活的影响
[0066]
测定不同温度条件下nampt酶催化的nmn产率。分别在25℃、30℃、35℃和40℃，连续取样，监测反应进程。
[0067]
在反应体系中加入7ml纯水，加入200mg prpp、100mg烟酰胺、水浴搅拌溶解，用4％氢氧化钠水溶液(质量体积比)调ph至大致范围，再用20％碳酸钠水溶液(质量体积比)微调ph至6.0，分别加入1ml nampt液体纯酶液和2ml的ppase纯酶液。温度控制不同条件，250rpm，连续反应，反应过程中离子对hplc测定nmn的生成，并计算nmn的产率。产率如下表5。
[0068]
表5温度对酶反应的影响
[0069][0070]
结果显示：25℃～40℃下，反应都能有效地进行，当在30℃～35℃下反应时，能获得更高的产率。
[0071]
实施例5烟酰胺的量对反应的影响
[0072]
在反应体系中加入7ml纯水，加入200mg prpp、不同量的烟酰胺、水浴搅拌溶解，用4％氢氧化钠水溶液(质量体积比)调ph至大致范围，再用20％碳酸钠水溶液(质量体积比)微调ph至6.0，分别加入1ml(enz.08)液体纯酶液和2ml的ppase纯酶液。35℃下，250rpm中连续反应，反应过程中离子对hplc测定nmn的生成，并计算nmn的产率。产率如下表6。
[0073]
表6烟酰胺的量对反应的影响
[0074][0075]
结果显示，当烟酰胺的摩尔量为prpp摩尔量的0.5、1、2、4倍时，反应都能有效地进行，当达到2～4倍时，能获得更高的产率。
[0076]
实施例6nmn的制备
[0077]
在反应体系中加入4ml纯水，加入400mg prpp、392mg的烟酰胺、水浴搅拌溶解，用4％氢氧化钠水溶液(质量体积比)调ph至大致范围，再用20％碳酸钠水溶液(质量体积比)微调ph至6.0，分别加入2ml(enz.08)液体纯酶液和4ml的ppase纯酶液。35℃下，250rpm中连续反应，反应过程中离子对hplc测定nmn的生成，并计算nmn的产率。产率为62.3％。产率图谱见图1，图2为产物nmn对照品图谱；图3为原料烟酰胺对照品图谱；
[0078]
产率公式为：产率＝nmn的生成量/prpp的初始量*100％
[0079]
而相同条件下，采用enz.01、enz.02催化反应，nmn的产率都在20％以下。