抗Flu-A的抗体及其制备方法和检测试剂盒与流程

抗flu-a的抗体及其制备方法和检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗flu-a的抗体及其制备方法和检测试剂盒。


背景技术：

2.流行性感冒病毒(influenza virus，flu)，简称流感病毒，是正粘病毒科的代表种，包括人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒、禽流感病毒等，其中人流感病毒根据其核蛋白的抗原性可分为甲(a)、乙(b)、丙(c)三型，是流行性感冒的病原体。流感病毒可引起人、禽、猪、马、蝙蝠等多种动物感染和发病。其中可感染人主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒，主要引起上呼吸道的感染，也可引起儿童与成年人的下呼吸道感染，主要为肺炎，婴幼儿的重症流感常伴有支气管、高热。
3.甲型流感病毒(influenza a，flu-a)于1933年分离成功，其抗原易发生变异，可以进一步分为h1n1、h3n2、h5n1、h7n9等亚型(h代表流感病毒的血凝素、n代表流感病毒的神经氨酸酶)，多次引起世界性大流行，每年均有一个高峰。甲型流感病毒感染发病程度与个人免疫相关，典型症状以畏寒、持续高热、头痛为主，同时伴有喉痛、咳嗽、鼻塞，一般会有浑身酸痛、乏力等全身症状。文献报道流行期阳性检出率为20～40％，而在非流行季节的阳性率为2-20％。甲型流感病毒的持续性流行会给人们的健康、生活及社会公共防疫系统带来极大的干扰和压力，它已经成为流行病学的主要研究对象之一。
4.目前市场上针对甲型流感病毒的检测方法主要有荧光pcr法、免疫法、病毒分离培养鉴定。荧光pcr法是在pcr扩增过程中，通过荧光信号，对pcr进程进行实时检测，定性或定量检测目的，该方法是病原检测的金标准；免疫法是通过抗原抗体发出特异性结合来检测目的蛋白；病毒分离培养常用的方法有鸡胚接种、动物接种、组织(细胞)培养等，再对产生的结果进行观察分析。荧光pcr法虽有较好的灵敏度和特异性，其检测窗口期较短，为疫病的早诊断、早治疗、降低死亡率及控制疫情争取时间，可作为诊断的金标准。但该法对检测人员要求较高，需要经过专业的技能培训，诊断检测需在具备资质的专业实验室使用专业的仪器设备才能进行，因此该法并不适用于临床或流行病监测一线的快速诊断。病毒分离培养鉴定检测耗时较长，环境要求高，操作者的感染风险大，培养效果差，在临床诊断和流行病监测等方面的应用非常有限。免疫法检测试剂针对的是样品中的抗原或者抗体，检测速度较快，准确性较好，同时对实验室与操作人员要求较低，普遍适用于医院检验科、疾控系统实验室等基层筛查，对甲型流感的初始检测、在医院及社区中成功控制爆发和指导治疗具有非常重要的作用。
5.目前市场上针对甲型流感的免疫诊断试剂产品主要有酶联免疫吸附法(elisa法)、胶体金免疫层析法，如广州万孚的甲型流感病毒抗原检测试剂(胶体金法)、r&d的甲型流感elisa试剂盒等。以上各种诊断试剂产品中，均需要针对甲型流感病毒的特异性抗体，目前市场上针对甲型流感病毒的特异性抗体在特异性及灵敏度均存在一定的缺陷。
6.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种抗flu-a的抗体及其制备方法和检测试剂盒，本发明提供的抗flu-a的抗体对甲型流感病毒(flu-a)抗原的亲和力较好，使用该抗体检测甲型流感病毒具有较好的灵敏度和特异性，为甲型流感病毒的检测提供新的抗体选择。
8.本发明是这样实现的：
9.一方面，本发明提供一种抗flu-a的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段具有如下互补决定区：
10.cdr-vh1：g-x1-s-f-x2-g-y-y-x3-h；其中：x1是y或f；x2是t或s；x3是l、v或i；
11.cdr-vh2：r-x1-n-p-y-x2-g-x3-t-x4-y-n-q-d-f-k-g；其中：x1是l、v或i；x2是n或d；x3是s或g；x4是s或t；
12.cdr-vh3：a-r-x1-s-s-x2-d-a-m；其中：x1是f或y；x2是l、v或i；
13.cdr-vl1：t-x1-s-s-s-v-x2-s-s-y-x3-h；其中：x1是a或g；x2是i、v或l；x3是i、v或l；
14.cdr-vl2：s-x1-s-x2-x3-a-s；其中：x1是t或s；x2是q、n或k；x3是i或l；
15.cdr-vl3：x1-q-x2-h-r-s-p；其中：x1是h或q；x2是w、f或y。
16.本发明提供的抗flu-a的抗体或其功能性片段，具有上述互补决定区结构，上述互补决定区结构可使抗体或其功能性片段能够特异性结合甲型流感病毒抗原，对甲型流感病毒抗原具有较好的亲和力，用该抗体或其功能性片段检测甲型流感病毒，具有较好的特异性和灵敏度。
17.在可选的实施方式中，
18.cdr-vh1中，x2是t；
19.cdr-vh2中，x3是s；
20.cdr-vh3中，x1是f；
21.cdr-vl1中，x1是a；
22.cdr-vl2中，x1是t；
23.cdr-vl3中，x1是h。
24.在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x1是y。
25.在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x1是f。
26.在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x3是l。
27.在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x3是v。
28.在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x3是i。
29.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x1是l。
30.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x1是v。
31.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x1是i。
32.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x2是n。
33.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x2是d。
34.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x4是s。
35.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x4是t。
36.在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x2是l。
37.在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x2是v。
38.在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x2是i。
39.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x2是i。
40.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x2是v。
41.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x2是l。
42.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x3是l。
43.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x3是v。
44.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x3是i。
45.在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x2是q。
46.在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x2是n。
47.在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x2是k。
48.在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x3是i。
49.在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x3是l。
50.在可选的实施方式中，cdr-vl3中，x2是w。
51.在可选的实施方式中，cdr-vl3中，x2是y。
52.在可选的实施方式中，cdr-vl3中，x2是f。
53.在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区选自如下突变组合1-48中的任意一种：
54.[0055][0056]
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段与甲型流感病毒以kd≤8.74
×
10-8
mol/l的亲和力结合，优选的，kd≤8.44
×
10-9
mol/l。
[0057]
在可选的实施方式中，kd≤8
×
10-8
mol/l、kd≤7
×
10-8
mol/l、kd≤6
×
10-8
mol/l、kd≤5
×
10-8
mol/l、kd≤4
×
10-8
mol/l、kd≤3
×
10-8
mol/l、kd≤2
×
10-8
mol/l、kd≤1
×
10-8
mol/l、kd≤9
×
10-9
mol/l、kd≤8
×
10-9
mol/l、kd≤7
×
10-9
mol/l、kd≤6
×
10-9
mol/l、kd≤5
×
10-9
mol/l、kd≤4
×
10-9
mol/l、kd≤3
×
10-9
mol/l、或kd≤2
×
10-9
mol/l。
[0058]
在可选的实施方式中，2.67
×
10-9
mol/l≤kd≤8.44
×
10-9
mol/l。
[0059]
kd的检测参考本发明实施例中的方法进行。
[0060]
在可选的实施方式中，
[0061]
cdr-vh1中，x2是s；
[0062]
cdr-vh2中，x3是g；
[0063]
cdr-vh3中，x1是y；
[0064]
cdr-vl1中，x1是g；
[0065]
cdr-vl2中，x1是s；
[0066]
cdr-vl3中，x1是q。
[0067]
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区选自如下突变组合49-55中的任意一种：
[0068][0069]
在可选的实施方式中，所述抗体包括序列依次如seq id no:1-4所示的轻链骨架区fr1-l、fr2-l、fr3-l及fr4-l，和/或，序列依次如seq id no:5-8所示的重链骨架区fr1-h、fr2-h、fr3-h及fr4-h。
[0070]
通常情况下，重链可变区(vh)和轻链的可变区(vl)可由以下编号的cdr与fr按如下组合排列连接获得：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。
[0071]
需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的抗体或其功能性片段的各骨架区氨基酸序列可以与上述对应骨架区(seq id no:1、2、3、4、5、6、7或8)可以具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
[0072]
在可选的实施方式中，所述抗体还包含恒定区。
[0073]
在可选的实施方式中，所述恒定区选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige和igd中的任意一者的恒定区。
[0074]
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
[0075]
在可选的实施方式中，所述恒定区来源于小鼠。
[0076]
在可选的实施方式中，所述恒定区的轻链恒定区序列如seq id no:9所示，所述恒定区的重链恒定区序列如seq id no:10所示。
[0077]
在可选的实施方式中，所述功能性片段选自所述抗体的vhh、f(ab’)2、fab’、fab、fv和scfv中的任意一种。
[0078]
上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
[0079]
上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如applied biosystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
[0080]
另一方面，本发明提供一种检测flu-a的试剂或试剂盒，其包括如上任一项所述的抗体或其功能性片段。
[0081]
在可选的实施方式中，上述试剂或试剂盒中所述抗体或其功能性片段标记有可被检测的标记物。
[0082]
可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性
例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
[0083]
在可选的实施方式中，所述可被检测的标记物包括但不限于荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。
[0084]
在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。
[0085]
在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(fitc)羟基光素(fam)、四氯光素(tet)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(rbitc)、四甲基罗丹明(tamra)、罗丹明b(tritc)等或其类似物)、cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于cy2、cy3、cy3b、cy3.5、cy5、cy5.5、cy3等或其类似物)、alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于alexafluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(pe)、藻蓝蛋白(pc)、别藻蓝蛋白(apc)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(precp)等)。
[0086]
在可选的实施方式中，所述催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
[0087]
在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于
212
bi、
131
i、
111
in、
90
y、
186
re、
211
at、
125
i、
188
re、
153
sm、
213
bi、
32
p、
94
mtc、
99
mtc、
203
pb、
67
ga、
68
ga、
43
sc、
47
sc、
110
min、
97
ru、
62
cu、
64
cu、
67
cu、
68
cu、
86
y、
88
y、
121
sn、
161
tb、
166
ho、
105
rh、
177
lu、
172
lu和
18
f。
[0088]
在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
[0089]
在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
[0090]
在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
[0091]
在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
[0092]
另一方面，本发明提供一种编码上述抗体或其功能性片段的核酸分子。
[0093]
另一方面，本发明提供含有上述核酸分子的载体。
[0094]
另一方面，本发明提供含有上述载体的重组细胞。
[0095]
另一方面，本发明提供一种制备抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养如上所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述抗体或其功能性片段。
[0096]
在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、杂交瘤细胞)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
附图说明
[0097]
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0098]
图1为实施例1的抗flu-a抗体的还原性sds-page的结果。
具体实施方式
[0099]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0100]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
[0101]
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》，第二版(sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)》(m.j.gait编，1984)；《动物细胞培养(animal cell culture)》(r.i.freshney编，1987)；《酶学方法(methods in enzymology)》(学术出版社有限公司(academic press，inc.)；《实验免疫学手册(handbook of experimental immunology)》(d.m.weir和c.c.blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(gene transfer vectors for mammalian cells)》(j.m.miller和m.p.calos编，1987)；《当代分子生物学方法(current protocols in molecular biology)》(f.m.ausubel等人编，1987)；《pcr:聚合酶链反应(pcr:the polymerase chain reaction)》(mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(current protocols in immunology)》(j.e.coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
[0102]
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0103]
实施例1
[0104]
1重组质粒的构建
[0105]
(1)抗体基因制备
[0106]
从分泌抗流感a抗原抗体的杂交瘤细胞株中提取mrna，通过rt-pcr方法获得dna产物，该产物用rtaq dna聚合酶进行加a反应后插入到pmd-18t载体中，转化到dh5α感受态细胞中，长出菌落后分别取heavy chain及light chain基因克隆各4个克隆送基因测序公司进行测序。
[0107]
(2)抗体可变区基因的序列分析
[0108]
将上述测序得到的基因序列放在imgt抗体数据库中进行分析，并利用vnti11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中light chain扩增出的基因片段中，vl基因序列为327bp，属于vkii基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；heavy chain引物对扩增出的基因片段中，vh基因序列为354bp，属于vh1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
[0109]
(3)重组抗体表达质粒的构建
[0110]
pcdna
tm 3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入hindiii、bamhi、ecori等多克隆酶切位点，并命名为pcdna3.4a表达载体，后续简称3.4a表达载体；根据上述pmd-18t中抗体可变区基因测序结果，设计该抗体的vl和vh基因特异性引物，两端分别带有hindiii、ecori酶切位点和保护碱基，通过pcr扩增方法扩出0.73kb的light chain基因片段和1.42kb的heavy chain基因片段。
[0111]
heavy chain和light chain基因片段分别采用hindiii/ecori双酶切，3.4a载体采用hindiii/ecori双酶切，将片段和载体纯化回收后heavy chain基因和light chain基因分别连接3.4a表达载体中，分别得到heavy chain和light chain的重组表达质粒。
[0112]
2稳定细胞株筛选
[0113]
(1)重组抗体表达质粒瞬时转染cho细胞，确定表达质粒活性
[0114]
质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节cho细胞1.43
×
107cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。
[0115]
包被液(主要成分nahco3)稀释流感a抗原至3μg/ml，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成份na2hpo4 nacl)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％bsa 80％pbs)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μl/孔，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠igg-hrp，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液a液(50μl/孔，含柠檬酸 醋酸钠 乙酰苯胺 过氧化脲)，加入显色液b液(50μl/孔，含柠檬酸 edta
·
2na tmb 浓hcl)，10min；加入终止液(50μl/孔，含edta
·
2na 浓h2so4)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读od值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应od仍大于1.0，未加细胞上清孔反应od小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对流感a抗原有活性。
[0116]
(2)重组抗体表达质粒线性化
[0117]
准备下述试剂：buffer 50μl、dna 100μg/管、puvⅰ酶10μl、无菌水补至500μl，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3m醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。
[0118]
(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株
[0119]
质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节cho细胞1.43
×
107cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/l msx 96孔加压培养约25天。
[0120]
显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5
×
106cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3
×
106cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转tpp保种传代。
[0121]
3重组抗体生产
[0122]
(1)细胞扩培
[0123]
细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。
[0124]
(2)摇瓶生产及纯化
[0125]
摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，hyclonetm cell boosttm feed 7a每天流加初始培养体积的3％，feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/l。第13天收样。用proteina亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体进行还原性sds-page，电泳图如下图1所示，在还原性sds-page后显示两条带，1条mr为50kd(重链，seq id no:14)，另一条mr为28kd(轻链，seq id no:13)。
[0126]
实施例2
[0127]
抗体的性能检测
[0128]
(1)实施例1抗体及其突变体的活性检测
[0129]
分析实施例1的抗体(wt)序列，其重链可变区如seq id no:12所示，其中，重链可变区上的各互补决定区的氨基酸序列如下：
[0130]
cdr-vh1：g-f(x1)-s-f-s(x2)-g-y-y-l(x3)-h；
[0131]
cdr-vh2：r-i(x1)-n-p-y-n(x2)-g-g(x3)-t-t(x4)-y-n-q-d-f-k-g；
[0132]
cdr-vh3：a-r-y(x1)-s-s-v(x2)-d-a-m；
[0133]
其轻链可变区如seq id no:11所示，其中，轻链可变区上的各互补决定区的氨基酸序列如下：
[0134]
cdr1-vl：t-g(x1)-s-s-s-v-l(x2)-s-s-y-l(x3)-h；
[0135]
cdr-vl2：s-s(x1)-s-n(x2)-l(x3)-a-s；
[0136]
cdr-vl3：q(x1)-q-w(x2)-h-r-s-p。
[0137]
在实施例1的抗flu-a抗体(wt)基础上，在互补决定区中对于抗体活性有关的位点进行突变，其中，x1、x2、x3、x4均为突变位点。见下表1。
[0138]
表1与抗体活性有关的突变位点
[0139][0140]
对表1中的抗体结合活性检测：
[0141]
包被液(主要成分nahco3)稀释羊抗鼠igg 1μg/ml进行微孔板包被，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成份na2hpo4 nacl)清洗2次，拍干；加入封闭液(20％bsa 80％pbs)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的表1中纯化抗体，100μl/孔，37℃，60min；甩掉板内液体，拍干，加入20％鼠阴性血封闭，每孔120μl，37℃，1h；甩掉板内液体，拍干，加入稀释的流感a抗原，每孔100μl，37℃，40min；洗涤液清洗5次，拍干；加入标记hrp的流感a配对单克隆抗体(获自菲鹏生物股份有限公司)，每孔100μl，37℃，30min；加入显色液a液(50μl/孔)，加入显色液b液(50μl/孔)，10min；加入终止液，50μl/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读od值。
[0142]
结果见下表2。
[0143]
表2 wt抗体及其突变体的活性数据
[0144]
抗体浓度(ng/ml)500025001250625312.50wt1.7321.3880.9460.7540.5350.060突变11.8301.4801.2710.9730.7340.050突变21.8491.4041.2420.9460.7330.066突变31.7551.3741.1530.9670.7420.054突变41.8161.3611.1470.9090.6190.063突变50.7420.3540.1360.051
--
[0145]
从表2中数据可以看出，wt，以及突变1-突变4对流感a抗原具有更强的结合活性，其中，突变1的结合活性更优。
[0146]
(2)抗体及其突变体的亲和力检测
[0147]
(a)在突变1的基础上，对其他位点进行突变，各突变的序列见下表3。
[0148]
表3与抗体亲和力有关的突变位点
[0149]
[0150][0151]
亲和力分析
[0152]
利用amc传感器，纯化出来的抗体用pbst稀释到10μg/ml，流感a抗原用pbst(主要成分na2hpo4 nacl tw-20)进行梯度稀释：20μg/ml、6.66μg/ml、2.22μg/ml、0.74μg/ml、0.24μg/ml、0.082μg/ml、0.027μg/ml、0.0091μg/ml；
[0153]
运行流程：缓冲液1(pbst)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(pbst)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mm ph 1.69gly溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据。结果见下表4。kd表示平衡解离常数即亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率。
[0154]
表4亲和力检测数据
[0155]
[0156]
[0157][0158]
从表4中数据可以看出，突变1抗体及其系列突变体对流感a抗原都具有较高的亲和力，表明在突变1的基础上，按表3中突变方式进行突变，可以得到对流感a抗原具有较高亲和力的抗体。
[0159]
(b)在wt的基础上，对其他位点进行突变，并检测各突变体的亲和力，各突变的序列见下表5，对应的亲和力数据见表6。
[0160]
表5以wt为骨架进行的突变
[0161][0162]
表6 wt抗体及其突变体的亲和力检测结果
[0163] kd(m)wt4.05e-08wt13.52e-08wt28.74e-08wt33.28e-08wt47.91e-08wt55.80e-08wt65.15e-08
[0164]
从表6数据可以看出，wt及其突变体对流感a抗原都也具有不错的亲和力。
[0165]
(3)裸抗稳定性考核
[0166]
将上述抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明上述抗体稳定。下表7突变1抗体为考核21天的酶免活性检测od结果。
[0167]
表7
[0168]
抗体浓度(ng/ml)500062504℃，21天样品1.9290.9740.054-80℃，21天样品1.9020.9890.06137℃，21天样品1.9620.9760.047
[0169]
实施例3
[0170]
抗体在胶体金检测上的应用
[0171]
1胶体金检测试纸的制备
[0172]
(1)硝酸纤维素膜的制备
[0173]
包被缓冲液的配制：含6％甲醇、0.01m ph7.2pbs缓冲液为包被缓冲液，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期一周。1000ml 6％甲醇的0.01m ph 7.2pbs缓冲液配方：nacl 8g、kcl 0.2g、na2hpo4·
12h2o 2.9g、kh2po
4 0.2g、甲醇60ml，双蒸去离子水定容至1000ml。
[0174]
硝酸纤维素膜的制备：用包被缓冲液分别将表3及表5中的纯化抗体稀释到1～5mg/ml，调整机器，划线为t线，即为检测线，t线靠近金标垫端，距金标垫端约5mm；用包被缓冲液将羊抗鼠igg抗体稀释到1～5mg/ml，调整机器，划线为c线，即为控制线，c线靠近吸收垫，距吸收垫约3mm。两线距离5～8mm，均匀。37℃烘干，封装备用。
[0175]
(2)胶体金、金标记单克隆抗体的制备
[0176]
(a)溶液的配制
[0177]
①
氯金酸的配制：用双蒸去离子水溶解氯金酸，配成1％溶液，置4℃备用，有效期四个月。1000ml 1％氯金酸溶液配方：10g氯金酸：双蒸去离子水定容至1000ml。
[0178]
②
柠檬酸三钠的配制：用双蒸去离子水溶解柠檬酸钠，配成1％溶液，0.22μm膜滤过，置4度备用，有效期容至1000ml。
[0179]
③
0.1m碳酸钾的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml0.1m碳酸钾溶液配方：13.8g碳酸钾；双蒸去离子水定容至1000ml。
[0180]
④
2％peg-20000的配制：用双蒸去离子水配制，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml 2％peg-20000溶液配方：20g peg-20000；双蒸去离子水定容至1000ml。
[0181]
⑤
标记洗涤保存液的配制：2％牛血清白蛋白(bsa)，0.05％叠氮钠(nan3)，0.01m ph7.2 pbs溶液，0.22μ膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml标记洗涤保存液配方：20g bsa，0.5g nan3、0.01m ph7.2 pbs溶液定容至1000ml。
[0182]
(b)胶体金的制备。
[0183]
用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％，置电炉煮沸，按每100ml 0.01％氯金酸加入2ml 1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一周。
[0184]
(c)胶体金标记抗体的制备。
[0185]
用0.1m碳酸钾调胶体金的ph值至8.2，按8～10μg抗体/ml胶体金分别加入另一株可配对的流感a标记抗体(获自菲鹏生物股份有限公司)，磁力搅拌器混匀30min，搅拌下加入bsa至终浓度为1％静置1小时。13000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的标记洗涤保存液将沉淀重悬，置4℃备用，有效期一周。
[0186]
(3)金标垫的制备
[0187]
(a)封闭液的配制。
[0188]
含2％bsa、0.1％tritonx-100、0.05％nan3、0.01m ph7.2 pbs溶液，0.22μm膜滤过，置4℃备用，有效期四个月。1000ml封闭液配方：20g bsa，0.5g nan3、1ml tritonx-100、0.01m ph7.2 pbs溶液定容至1000ml。
[0189]
(b)金标垫的制备
[0190]
将金标垫浸泡于封闭液中30min后，于37℃烘干。然后将制备好的金标记抗体均匀的铺在金标垫上，每毫升溶液铺20平方厘米，冷冻干燥，封装，置4℃备用。
[0191]
(4)试纸条样品垫的制备
[0192]
(a)封闭液的配制。
[0193]
含2％bsa、0.1％trtionx-100、0.05％nan3、0.01m ph7.2 pbs溶液，0.22μm膜滤过，置4度备用，有效期四个月。1000ml封闭液配方：20g bsa，0.5g nan3、1ml trtionx-100、0.01m ph7.2 pbs溶液定容至1000ml。
[0194]
(b)样品垫的制备。
[0195]
将样品垫浸泡于封闭液中30min后，于37℃烘干，封装，置4℃备用。
[0196]
(5)检测试纸的组装
[0197]
将吸收垫(购自millipore公司)、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫设置在不吸水的支撑薄片上，切成3mm宽的小条。每十小条一包，加入干燥剂，真空封装，得到检测甲型流感病毒的胶体金检测试纸。
[0198]
2抗体在胶体金检测中的应用
[0199]
利用上述组装好的检测试纸条检测被检材料中是否含有流感a病毒抗原，从而确定前述实施例中所得抗体对流感a病毒抗原检测的作用性。利用双抗体夹心法来检测被检材料中的是否含有流感a病毒抗原。检测时，流感a病毒抗原先和胶体金标记的流感a抗体结合形成流感a抗原-胶体金标记-流感a抗体复合物，由于毛细管作用，流感a抗原-胶体金标记流感a抗体复合物沿硝酸纤维素膜向前泳动，到达检测线时，流感a抗原-胶体金标记-流感a抗体复合物会与实施例所得流感a抗体结合，形成流感a抗体-流感a抗原-胶体金标记-流感a抗体的复合物，从而富集在检测线上，形成红色沉淀线。未结合检测线上流感a抗体的流感a抗原-胶体金标记-流感a抗体复合物则通过检测线，被羊抗鼠igg抗体捕获，富集在质控线上，形成红色沉淀线。当检测线与质控线同时有红色沉淀线时判为阳性结果。若样品中不含有流感a病毒抗原，未结合流感a病毒抗原的胶体金标记的流感a抗体到达检测线时，不会形成流感a抗体-流感a抗原-胶体金标记-流感a抗体的复合物，未结合流感a抗原的胶体金标记的流感a抗体复合物通过检测线，仅富集在质控线上形成红色沉淀线，此时判为阴性结果。
[0200]
部分抗体的结果见下表8。
[0201]
表8
[0202][0203]
备注：金标显色以c加数字组成，c后面的数字越小表示显色越强，活性越高；c后面的数字越高表示显色越弱，活性越低；数字后带“ ”比不带显色略强0.5-1c，数字后带
“-”
比不带显色略低0.5-1c。b表示没活性。
[0204]
由上表结果可知，用本发明实施例提供的抗体在金标平台进行双抗体夹心法检测，都具有很好的活性。
[0205]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。