一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法与流程

一种
β-烟酰胺单核苷酸的制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物催化领域，具体涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法。


背景技术：

2.β-烟酰胺单核苷酸(β-nicotinamide mononuclotide，β-nmn或nmn)是nad

(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，又称辅酶1)最直接的前体，nad

是参与细胞新陈代谢、氧化还原、蛋白质转录等上千种重要生理反应的重要活性物。由于nad

分子量过大，无法通过口服摄取至细胞内，其体内主要依赖于细胞的合成，而且合成量很低。但随着对nad

前体小分子物质β-nmn的研究发现，食用β-nmn可以有效提升体内nad

的含量，并显著抑制机体衰老，使得β-nmn成为了“不老神药”，在功能性保健食品方面有着很大的开发潜力和市场前景。目前nmn在欧、美、日等发达国家已批准作为保健食品原料，并以nmn为主要成份开发出多种保健品，如美国herbalmax、基因港geneharbor nmn9000、日本mirai lab nmn3000胶囊、澳大利亚synext等。
[0003][0004]
生物酶法制备nmn的一条路线是以d-核糖和烟酰胺为起始原料，在核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶等的作用下，经过三步催化反应得到nmn。该条路线中间产物较多，后续分离纯化较困难，因而总体收率偏低，导致生产成本高。
[0005]
生物酶法制备nmn的另一条路线是以d-5-磷酸核糖和烟酰胺为原料，在atp存在下，在磷酸核糖焦磷酸合成酶(prpps)和烟酰胺磷酸核糖转移酶(nampt)的催化下，制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，如cn2018109407295公开了这种方法，底物的转化率可达86.9％-89.8％。又如wo2018/023206公开了以烟酰胺和5'-磷酸核糖基-1'-焦磷酸(prpp)为原料，烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体(f180a)的催化作用下制备nmn，底物烟酰胺转化率可达66％。
[0006]
另一条路线是以烟酰胺核糖(nr)为起始原料，在烟酰胺核糖核苷激酶(nicotinamide ribonucleoside kinase，nrk)和atp的作用下，一步反应得到nmn，收率高，产品纯度高。其中专利cn2016112456194，以烟酰胺核糖(nr)为底物，在atp等磷酸供体存在下，在来自酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的烟酰胺核糖激酶的催化下反应24h生成β-烟酰胺单核苷酸，高效液相色谱检测烟酰胺核糖转化率为90％以上，纯化后β-烟酰胺单核苷酸纯度大于95％，但是底物烟酰胺浓度仅为18mm。专利cn2019107231777公开了一种
来源于马克斯克鲁维酵母的烟酰胺核糖核苷激酶nrk及其突变体(d45e/d58q/r161k/y164w)基因，并提供该酶体外异源表达体系的构建方法和酶突变体的构建方法，以及该酶及其突变体作为生物催化剂用于催化nr制备烟酰胺单核苷酸的方法。反应20h后hplc检测底物nr转化率》80％，纯化后得到β-烟酰胺单核苷酸纯度大于98％，底物烟酰胺浓度最高为50g/l，但随着其底物浓度从10g/l增加至50g/l，转化率从》90％降低至》80％。
[0007]
但是现有技术中，这些方法的转化率，以及底物投料浓度都还有待提高；并且反应时间过长，不利于大规模生产应用。


技术实现要素：

[0008]
本发明所要解决的技术问题是，针对现有以烟酰胺核糖为起始原料生产β-烟酰胺单核苷酸的方法中，无法做到提高底物烟酰胺核糖浓度的同时保持较高的底物转化率，并且所需的反应时间过长，均不利于提高β-烟酰胺单核苷酸的生产效率和应用于大规模生产，发明人经过诸多实验意外发现了几个烟酰胺核糖核苷激酶能够在提高底物烟酰胺核糖浓度的同时保持较高的底物转化率，并且所需的催化时间大幅缩短；故提供一种在提高底物浓度同时保持较高的底物转化率，并且所需的催化时间大幅缩短的β-烟酰胺单核苷酸的制备方法。
[0009]
为解决上述问题，本发明提供的技术方案之一是：一种β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其包括使用烟酰胺核糖核苷激酶和磷酸供体，将烟酰胺核糖和/或烟酰胺核糖氯化物进行磷酸化反应，得到所述β-烟酰胺单核苷酸，所述烟酰胺核糖核苷激酶为氨基酸序列如ncbi登录号xp_013025941.1、xp_013017940.1、xp_023459718.1、tvy65083.1、kaf4999805.1、xp_024756901.1、xp_018180784.1和/或pmb71451.1所示的烟酰胺核糖核苷激酶。优选地，编码所述烟酰胺核糖核苷激酶的核苷酸序列为如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和/或seq id no:8所示的核苷酸序列。
[0010]
较佳地，所述烟酰胺核糖和/或烟酰胺核糖氯化物的浓度为5g/l～150g/l；优选地，所述烟酰胺核糖氯化物的浓度为100g/l。
[0011]
较佳地，所述的磷酸供体为atp或atp钠盐；所述磷酸供体与所述烟酰胺核糖和/或烟酰胺核糖氯化物的质量比为1:1000～3:1。为使烟酰胺核糖氯化物充分转化，在本发明一较佳实施例中，所述磷酸供体atp钠盐与烟酰胺核糖氯化物的质量比为5:2。
[0012]
发明人发现，底物过多时反应效率降低；而使用过量的烟酰胺核糖核苷激酶会导致酶的浪费，故：
[0013]
较佳地，所述烟酰胺核糖核苷激酶与所述烟酰胺核糖和/或烟酰胺核糖氯化物的质量比为1:2000～1:60。优选地，所述烟酰胺核糖核苷激酶与所述烟酰胺核糖氯化物的质量比为1:350。
[0014]
较佳地，所述磷酸化反应温度为20～40℃，优选25℃。所述磷酸化反应ph值为6～8，优选7.0。
[0015]
由于atp等磷酸供体的成本较高，为节省成本并进一步提高反应效率，较佳地，所述制备方法还包括磷酸供体再生的步骤：利用磷酸转移酶和磷酸原料将失去磷酸基团的磷酸供体产物进行磷酸化为磷酸供体。在此情况下，所述磷酸供体例如atp与烟酰胺核糖氯化
物的质量比优选为1:10。
[0016]
优选地，所述磷酸转移酶为乙酸激酶；当磷酸供体为atp或atp钠盐时，所述失去磷酸基团的磷酸供体产物为adp或adp钠盐。
[0017]
根据本发明，所述磷酸原料优选磷酸化合物。所述磷酸化合物可选择乙酰磷酸盐，包括乙酰磷酸二钠、乙酰磷酸二钾和/或乙酰磷酸二铵。
[0018]
根据本发明，为保证反应充分，磷酸供体最好比底物过量；故所述磷酸原料与所述烟酰胺核糖和/或烟酰胺核糖氯化物的摩尔比为至少1:1。
[0019]
较佳地，所述烟酰胺核糖核苷激酶或所述磷酸转移酶的制备包括以下步骤：
[0020]
(1)将含有所述烟酰胺核糖核苷激酶或所述磷酸转移酶的工程菌培养至od600为0.5～1.0，25℃诱导优选用终浓度为0.1mm的iptg诱导并培养12-24小时；在本发明一较佳实施例中，所述工程菌为e.coli bl21(de3)，所述工程菌培养至od600为0.8，所述培养的时间为16小时；
[0021]
(2)收集菌体并以1:5～1:10的重量体积比重悬至缓冲液，破碎后得到粗酶液，所述重量体积比的单位为g/ml；优选地，所述粗酶液经纯化，例如用ni bestarosehp树脂纯化，和/或，所述缓冲液为50mm ph 7.5的磷酸钠或tris-hcl缓冲液。
[0022]
较佳地，所述乙酸激酶的氨基酸序列如ncbi登录号aac75356.1所示；更佳地，编码所述乙酸激酶的核苷酸序列为seq id no:9所示的核苷酸序列。
[0023]
优选地，所述乙酸激酶与所述乙酰磷酸盐的质量比为1:300～1:20；在本发明一较佳实施例中，当磷酸原料选择乙酰磷酸二钠盐时，所述乙酸激酶和乙酰磷酸二钠盐的质量比为1:86。
[0024]
较佳地，磷酸供体再生的步骤的反应温度为20～40℃，优选温度为25℃；
[0025]
和/或，磷酸供体再生的步骤的反应ph值为6～8，优选反应ph为7.0。
[0026]
为解决上述问题，本发明提供的技术方案之二是：本发明的上述烟酰胺核糖核苷激酶在制备β-烟酰胺单核苷酸中作为催化剂的应用。
[0027]
为解决上述问题，本发明提供的技术方案之三是：一种酶组合物，所述酶组合物包括：
[0028]
1)本发明的上述烟酰胺核糖核苷激酶中的至少两种；
[0029]
或者2)所述酶组合物包括本发明的上述烟酰胺核糖核苷激酶和本发明的上述磷酸转移酶。
[0030]
若无特别说明，本文所述的各反应物的浓度和比例均指该物质在反应总体系中的初始浓度和初始比例。
[0031]
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0032]
本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0033]
本发明的积极进步效果在于：在底物烟酰胺核糖浓度高达100g/l时保持底物转化率不低于95％，并将反应时间从现有技术的20h以上大幅缩短至不超过6h；在增加磷酸供体再生的步骤后，在底物烟酰胺核糖浓度为100g/l的情况下6h催化后底物转化率依旧不低于95％，此时磷酸供体用量减少，生产成本大幅降低。
附图说明
[0034]
图1为ncbi登录号为xp_023459718.1的烟酰胺核糖核苷激酶催化制备nmn的图谱；
[0035]
图2为反应初始反应液图谱；
[0036]
图3为底物nrc对照品图谱；
[0037]
图4为产物nmn对照品图谱；
[0038]
图5为烟酰胺对照品图谱；
[0039]
图6为adp对照品图谱；
[0040]
图7为amp对照品图谱。
具体实施方式
[0041]
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0042]
本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，基因克隆操作具体可参考j.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。
[0043]
pet28a和蛋白抽提试剂(bugbuster protein extraction reagent)购买自novagen公司；dpni酶购买自英潍捷基(上海)贸易有限公司；ndei酶、hindiii酶购买自thermo fisher公司，e.colibl21(de3)感受态细胞购买自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。烟酰胺核糖氯化物(nrc)(采购于苏州麦轮生物科技有限公司)。
[0044]
具体实施例中涉及的离子对hplc检测方法：
[0045]
色谱柱：welch ultimate aq-c18(5μm，4.6*250mm)；缓冲液：0.05mol/l磷酸氢二铵水溶液：10％四丁基氢氧化铵水溶液＝91：1(体积比)，磷酸调节ph至3.6；流动相：乙腈：缓冲液＝8：92(体积比)；流速：1.0ml/min；检测波长：254nm；柱温：30℃；进样量：10μl；运行时间：40min；稀释液：超纯水。
[0046]
实施例1 nr激酶的制备
[0047]
lb液体培养基组成：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
[0048]
tb液体培养基组成：蛋白胨10g/l，酵母粉18g/l，甘油4ml/l，kh2po4 2.31g/l、k2hpo4
·
2h2o 16.43g/l，用去离子水溶解后定容，121℃灭菌20min，待用。
[0049]
nr激酶氨基酸、核苷酸序列信息见下表1。苏州金唯智生物科技有限公司(江苏省南京市江北新区研创园浦滨路211号)全基因合成nr激酶(enz.01～enz.20)基因，酶切位点ndei、hindiii，载体pet28a。合成的nr激酶基因转化至宿主e.coli bl21(de3)感受态细胞，得到含有nr激酶基因的工程菌株。
[0050]
表1 nr激酶信息表
[0051]
[0052][0053]
[0054]
将含有nr激酶基因的工程菌分别在平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml lb液体培养基中，37℃震荡培养4h。按1v/v％接种量转接至150ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜tb液体培养基中，37℃震荡培养至od600达到0.8左右时，加入iptg至其终浓度为0.1mm，25℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液4500rpm离心20min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。
[0055]
将收集到的菌体取10g，重悬于50ml 0.1m ph7.5磷酸钠缓冲液中，高压均质破碎，得到nr激酶粗酶液，将均质后的粗酶液用ni bestarosehp(博格隆(上海)生物技术有限公司，产品编号aa0041)树脂纯化，用bradford试剂盒(采购自上海捷瑞生物工程有限公司)测定蛋白浓度，保存于-20℃冰箱待用。
[0056]
酶活测定方法：
[0057]
1ml反应体系中，加入29.2mg底物nrc(100mm)，57mg atp二钠盐(100mm)，1.9mg mgcl2·
6h2o(20mm)，20μl nr激酶酶液，980μl 20mm ph7.5的磷酸缓冲液，30℃摇床200rpm反应，反应体系具体参数见下表2。
[0058]
表2反应条件
[0059][0060]
反应每15min连续取样100μl，共取样4次，用ph 2.0左右的稀盐酸稀释10倍后，离子对hplc检测，根据产物nmn的标准曲线计算出nmn的浓度，计算出酶活，结果如下表3。
[0061]
酶活定义为：在ph7.5，30℃条件下，每分钟生成1μmol nmn所需的酶量为1个酶活力单位(1u)。
[0062]
表3液体酶酶活
[0063][0064][0065]
实施例2 nr激酶制备nmn
[0066]
在反应体系中加入57ml纯水，加入0.30g六水氯化镁、15g三磷酸腺苷二钠盐、25℃水浴搅拌溶解，用4％氢氧化钠水溶液调ph到8.2左右，加入6.0g底物烟酰胺核糖氯化物(nrc)溶解后用20％碳酸钠水溶液微调ph7.2-7.5，分别加入3ml实施例1中的液体酶。在25℃水浴锅，ph6.5-7.0，150rpm中反应6h，反应过程中离子对hplc测定底物转化率，结果见表
4。
[0067]
转化率计算公式：
[0068]
转化率＝转化的nrc量/起始的nrc量
×
100％
[0069]
其中enz.06转化率的检测图谱见图1。反应初始反应液图谱见图2，图谱底物nrc对照品图谱见图3，产物nmn对照品图谱见图4，烟酰胺对照品图谱见图5，adp对照品图谱见图6，amp对照品图谱见图7。
[0070]
表4液体酶催化制备nmn
[0071][0072]
[0073]
结果显示，enz.02，enz.03，enz.06，enz.07，enz.10，enz.14，enz.16，enz.18的催化效率很高，反应6h后转化率可以达到95％以上。
[0074]
实施例3乙酸激酶的制备
[0075]
根据乙酸激酶(ncbi登录号:aac75356.1，核苷酸序列如seq id no:9)基因全合成乙酸激酶基因，酶切位点ndei、hindiii，载体pet28a。合成的乙酸激酶基因转化至宿主e.coli bl21(de3)感受态细胞，得到含有乙酸激酶基因的工程菌株。
[0076]
将含有乙酸激酶基因的工程菌分别在平皿划线活化后，挑单菌落接种至含50μg/ml卡那霉素的5ml lb液体培养基中，37℃震荡培养4h。按1v/v％接种量转接至150ml同样含50μg/ml卡那霉素的新鲜tb液体培养基中，37℃震荡培养至od600达到0.8左右时，加入iptg至其终浓度为0.1mm，25℃诱导培养16h。培养结束后，将培养液4500rpm离心20min，弃上清液，收集菌体，置于-20℃超低温冰箱中保存，待用。
[0077]
取10g乙酸激酶重悬于50ml0.1m ph7.5磷酸钠缓冲液，高压均质破碎，得到乙酸激酶粗酶液，将均质后的粗酶液用ni bestarosehp(博格隆(上海)生物技术有限公司，产品编号aa0041)树脂纯化，用bradford试剂盒(采购自上海捷瑞生物工程有限公司)测定蛋白浓度，保存于-20℃冰箱待用。
[0078]
乙酸激酶液体酶酶活测定方法：
[0079]
在反应容器中，加入4.0g二磷酸腺苷(adp)，1.38g乙酰磷酸二铵盐，0.19g无水氯化镁，再加入10ml 0.2m ph7.5的磷酸钠缓冲液和70ml纯水，磁力搅拌溶解，用20％(g/ml)na2co3水溶液调节ph至7.5，定容至100ml底物溶液。取底物溶液19.5ml于反应容器中，置于30℃摇床中150rpm保温10min，加入0.5ml稀释后的乙酸激酶，于30℃，150rpm摇床中反应。反应10min后取反应液加入2m盐酸摇匀淬灭反应，离子对hplc方法检测生成的三磷酸腺苷(atp)，根据标准曲线计算atp浓度，并计算出液体酶酶活为10048u/ml，蛋白浓度15mg/ml。
[0080]
实施例4atp再生制备nmn
[0081]
在反应体系中加入54ml纯水，0.30g六水氯化镁、0.6g三磷酸腺苷二钠盐(atp二钠盐)、3.86g乙酰磷酸二钠，25℃水浴搅拌溶解，用4％(g/ml)氢氧化钠水溶液调ph到8.2左右，加入6.0g底物烟酰胺核糖氯化物(nrc)溶解后用20％(g/ml)碳酸钠水溶液微调ph7.2-7.5，分别加入3ml乙酸激酶和3mlnr激酶液体酶。在25℃水浴锅，ph6.5～7.0，150rpm中反应6h，反应过程中离子对hplc测定底物转化率，结果见表5。
[0082]
表5
[0083]
[0084][0085]
通过上述实验可见，利用本发明的方法可在不超过6h内，将浓度100g/l的底物烟酰胺核糖氯化物进行95％以上的转化。
[0086]
在增加atp再生步骤后，同样可以达到在在不超过6h内，将浓度100g/l的底物烟酰胺核糖氯化物进行95％以上的转化，但此时atp的用量由15g大幅减少到0.6g，大幅降低了生产成本。