一种C-kit和PDGFR突变检测试剂盒的制作方法

一种c-kit和pdgfr突变检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及基因突变检测技术领域，具体为一种c-kit和pdgfr突变检测试剂盒。


背景技术：

2.c-kit基因位于人染色体4q12-13，属于原癌基因，其产物是受体酪氨酸激酶ⅲ型，c-kit是酪氨酸激酶受体蛋白家族的重要成员之一，其作为干细胞因子的受体，可以通过一系列信号通路参与造血干细胞增殖分化的调控。近年来研究发现，c-kit基因存在突变，特别是激活性突变与急性白血病中的发病、治疗和预后等密切相关。
3.胃肠道间质瘤(gist)是消化道最常见的间叶源性肿瘤。绝大部分的gist 均表达c-kit基因编码的kit蛋白(cd117)。在分子层面上，大部分的gist 均存在c-kit基因突变，从而导致kit蛋白的活化不需要配体scf参与就能刺激肿瘤细胞的持续增殖和抗凋亡信号的失控。
4.gist中c-kit基因突变率约为90％，且突变形式多样。其中位于11号外显子lys550-val560区段的变异最为常见(约占70-80％)，位于9号外显子 ala502-tyr503区段的6碱基重复突变约占5-10％。临床研究表明gist中c-kit 基因的突变情况与格列卫分子靶向治疗的疗效相关：存在11号外显子突变患者的疗效最好，存在9号外显子突变的患者疗效次之，而野生型gist的疗效最差。另外，对于9号外显子突变的患者，提高用药剂量可显著提高疗效。检测c-kit基因突变对于指导gist患者的合理用药，具有重要的参考价值。
5.pdgfrα为原癌基因，编码血小板源生长因子受体α，在器官发育、伤口愈合及肿瘤发展等方面起重要作用；其在胃肠道间质瘤(gist)中有较大表达概率，常作为gist诊断的指标物质；在突变的类型中，gist中最常见的单发pdgfra的突变是点突变d842v(62.6％)，导致第842位天门冬氨酸为缬氨酸所取代；最常见的移码突变是缺失突变dimh842-845和imhd843-846，而这两种突变在蛋白表达上相同，占所有pdgfra突变的14.9％。
6.肿瘤基因突变的常见检测方法包括arms-pcr法、sanger测序法、二代测序法、数字pcr法等。amrs-pcr法和数字pcr只能针对已知突变进行检测，检测通量非常有限。sanger测序法是突变检测的金标准，但灵敏度只能达到 5％～20％。二代测序技术在检测通量和灵敏度方面均具有较大的优势，但检测方法繁琐，需要昂贵的仪器设备，且检测周期也较长。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种c-kit和pdgfr突变检测试剂盒，以解决上述背景技术中提出的问题。
8.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种c-kit和pdgfr突变检测试剂盒，包括pcr反应液、pcr反应条a、pcr反应条b和石蜡油；所述 pcr反应液放置于1.5ml可立螺帽离心管内，pcr反应液组分包括taq酶、 dntps、mg2 和buffer；所述pcr反应条a和pcr反应条b放置于pcr八联管内，pcr反应条a和pcr反应条b包括引物、探针和石蜡；所述石蜡油同样放置于1.5ml可立螺帽离心管内。
9.本发明该提供了一种c-kit和pdgfr突变检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
10.s1：配制mix1：将170μl的pcr反应液与适量样本dna及无核酶水混合，得到总体积为340μl的测试液，进行测试；
11.s2：取pcr反应条a和pcr反应条b各一条，按离心机孔位a至h的顺序，依次加入20μl的mix1，每孔滴入一滴石蜡油；
12.s3：盖紧pcr管盖，瞬时离心10秒，上机进行检测。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本试剂盒可定性检测样本中 c-kit和pdgfrα基因可能存在的绝大多数突变类型，检测通量高，理论上只要pna blocker结合的序列中存在突变，即可检出；灵敏度可达到5％；操作简单，检测时间短，检测成本低。既解决了常规arms-pcr方法通量低的问题，又具有较高检测灵敏度，检测成本、检测周期也远低于二代测序。
附图说明
14.图1为kit 9外显子突变阳性检测结果；
15.图2为kit/pdgfra基因突变检测结果；
16.图3为kit基因11外显子点突变(c.1669t》g；p.w557g)检测结果；
17.图4为kit基因13外显子点突变(c.1945a》g；p.k642e)检测结果：
18.图5为kit基因17外显子点突变(c.2447a》t；p.d816v)检测结果：
19.图6为pdgfra基因12外显子点突变(c.1682t》a；p.v561d)检测结果：
20.图7为pdgfra基因14外显子点突变(c.1977c》g；p.n659k)检测结果：
21.图8为pdgfra基因18外显子点突变(c.2525a》t；p.d842v)检测结果。
具体实施方式
22.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
23.本发明提供一种c-kit和pdgfr突变检测试剂盒，包括pcr反应液、pcr 反应条a、pcr反应条b和石蜡油；所述pcr反应液放置于1.5ml可立螺帽离心管内，pcr反应液组分包括taq酶、dntps、mg2 和buffer；所述pcr反应条a和pcr反应条b放置于pcr八联管内，pcr反应条a和pcr反应条b包括引物、探针和石蜡；所述石蜡油同样放置于1.5ml可立螺帽离心管内。
24.本发明该提供了一种c-kit和pdgfr突变检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
25.s1：配制mix1：将170μl的pcr反应液与适量样本dna及无核酶水混合，得到总体积为340μl的测试液，进行测试；
26.s2：取pcr反应条a和pcr反应条b各一条，按离心机孔位a至h的顺序，依次加入20μl的mix1，每孔滴入一滴石蜡油；
27.s3：盖紧pcr管盖，瞬时离心10秒，上机进行检测。
28.实施例1：
29.kit基因外显子9突变检测的检测方法包括以下步骤：
30.s1：配制mix1：将170μl的pcr反应液与适量样本dna及无核酶水混合，得到总体积为340μl的测试液，进行测试；
31.s2：取pcr反应条a和pcr反应条b各一条，按离心机孔位a至h的顺序，依次加入20μl的mix1，每孔滴入一滴石蜡油；
32.s3：盖紧pcr管盖，瞬时离心10秒，上机进行检测。
33.pcr反应条a和pcr反应条b的孔位信息如下表：
34.[0035][0036]
注：1a孔检测kit基因非突变区域(外控)，代表dna总量；突变检测孔ct值与外控ct值的差值与基因突变比例有关，δct值越小，突变比例越高。δct值高于阈值时视为阴性结果(无突变或突变比例低于试剂盒检测限)。
[0037]
结果判定表如下：
[0038]
[0039][0040]
结果分析：反应结束后自动保存结果，对扩增曲线进行分析。根据分析后图像调节baseline的start值、end值以(用户可根据实际情况自行调整， start值可以在3～15、end值可设在5～20)，threshold值(rn)推荐设定荧光信号脱离本底拐点处，点击analyze进行分析，然后到plate窗口下记录每个反应的ct值并计算δct值。依据δct值按照下表进行检测结果判定，无ct值的视为阴性。
[0041]
本方法与sanger测序法相比：
[0042]
本试剂盒与sanger测序法的临床比对试验：使用本试剂盒和sanger测序法同时对10份胃肠道间质瘤组织dna进行检测，其中5份样本sanger测序结果为kit基因9外显子插入突变。检测结果数据如下：
[0043]
[0044]
[0045][0046]
kit 9外显子突变阳性检测结果，样本2021001，如图1所示，δ ct＝ct(2a)-ct(1a)＝3.4，按照表6判断结果，由于δct《12，检测结果为阳性。
[0047]
kit/pdgfra基因突变检测结果为阴性，样本2021006，如图2所示。
[0048]
实施例2：
[0049]
kit基因外显子11突变检测：使用本试剂盒和sanger测序法同时对14 份胃肠道间质瘤组织dna进行检测，其中8份样本sanger测序结果为kit基因11外显子突变。检测结果数据如下：
[0050]
[0051]
[0052][0053]
注：阳性孔位的δct值取1b-1h中的最小值。
[0054]
kit基因11外显子点突变(c.1669t》g；p.w557g)检测结果为阳性，样本2021011，如图3所示。
[0055]
实施例3：
[0056]
kit基因外显子13/14突变检测：使用本试剂盒和sanger测序法同时对18份胃肠道间质瘤组织dna进行检测，其中7份样本sanger测序结果为kit 基因13/14外显子突变。检测结果数据如下：
[0057]
[0058]
[0059][0060][0061]
kit基因13外显子点突变(c.1945a》g；p.k642e)检测结果为阳性，样本2021025，如图4所示。
[0062]
实施例4：
[0063]
kit基因外显子17突变检测：使用本试剂盒和sanger测序法同时对8份胃肠道间质
瘤组织dna进行检测，其中3份样本sanger测序结果为kit基因 17外显子突变。检测结果数据如下：
[0064]
[0065][0066]
kit基因17外显子点突变(c.2447a》t；p.d816v)检测结果为阳性，样本2021043，如图5所示。
[0067]
实施例5：
[0068]
pdgfra基因外显子12突变检测：使用本试剂盒和sanger测序法同时对 9份胃肠道间质瘤组织dna进行检测，其中4份样本sanger测序结果为pdgfra 基因12外显子突变。检测结果数据如下：
[0069]
[0070][0071]
[0072]
pdgfra基因12外显子点突变(c.1682t》a；p.v561d)检测结果为阳性，样本2021051，如图6所示。
[0073]
实施例6：
[0074]
pdgfra基因外显子14突变检测：使用本试剂盒和sanger测序法同时对 8份胃肠道间质瘤组织dna进行检测，其中3份样本sanger测序结果为pdgfra 基因14外显子突变。检测结果数据如下：
[0075]
[0076][0077]
pdgfra基因14外显子点突变(c.1977c》g；p.n659k)检测结果为阳性，样本2021060，如图7所示。
[0078]
实施例7：
[0079]
pdgfra基因外显子18突变检测：使用本试剂盒和sanger测序法同时对 9份胃肠道间质瘤组织dna进行检测，其中4份样本sanger测序结果为pdgfra 基因18外显子突变。检测结果数据如下：
[0080]
[0081]
[0082][0083]
pdgfra基因18外显子点突变(c.2525a》t；p.d842v)检测结果为阳性，样本2021068，如图8所示。
[0084]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。