一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体的制作方法

1.本发明涉及分子生物学和免疫学技术领域，具体涉及一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体。


背景技术：

2.痘苗病毒(vaccinia virus)属于痘病毒科正粘病毒属，曾被用作预防天花感染的疫苗而在世界范围内得到广泛应用，使得天花成为第一个被人类完全灭绝的恶性传染病(riva，g.et al.，1979.a milestone in the history of mankind.eradication of smallpox.mmw munch med wochenschr，121(50)，1669-70)。近二十年来，随着基因工程技术的快速发展，痘苗病毒被用于研究设计基因表达载体，或用于重组活病毒疫苗的研究(moss，b.1996.genetically engineeredpoxviruses for recombinant gene expression，vaccination，and safety.procnatl acad sci usa 93(21)，11341-8；paoletti，e.et al.，1996.applications ofpox virus vectors to vaccination：an update.proc natl acad sci usa 93(21)，11349-53)。已有多种重组痘苗病毒疫苗可以成功地表达狂犬病毒、日本脑炎病毒等病毒的抗原并用于动物传染病的防治(kieny，m.p.et al.，1984.expressionof rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus.nature312(5990)，163-6；konishi，e.et al.，1992.a highly attenuated hostrange-restricted vaccinia virus strain，nyvac，encoding the prm，e，and ns1genes of japanese encephalitis virus prevents jev viremia in swine.virology190(1)，454-8)。人用重组活病毒疫苗也取得许多重要进展，已有包括麻疹、ebv、hav、hbv、hpv、hiv及狂犬病毒等进行了初步的人体免疫观察(郭斐等，2001，非复制重组痘苗病毒天坛株c-k缺失区表达载体的构建及重组病毒生物学性状的研究。病毒学报17(1)，24-28；mcmichael，a.et al.，2002.the quest for anaids vaccine：is the cd8 t-cell approach feasible？nat rev immunol 2(4)，283-91；moss，b.1996.genetically engineered poxviruses for recombinantgene expression，vaccination，and safety.proc natl acad sci usa 93(21)，11341-8；zhu，j.h.et at.，1996.immunogenicity and relative attenuation ofdifferent vaccinia-rabies virus recombinants.arch virol 141(6)，1055-65)。
3.痘苗病毒天坛株是中国特有的痘苗病毒毒株，曾作为预防天花传染的疫苗株在中国大量人群中长期使用过，具有相对毒力较弱、使用安全的特点，是研制适用于中国应用的基因工程病毒载体和重组活疫苗的理想毒株。中国痘苗病毒天坛株的全基因组测序于1997年完成，它为研究和阐明痘苗病毒天坛株独特的生物学特性及进行基因工程改造提供了重要的背景资料(金奇等，1997，痘苗病毒天坛株全基因组结构特点的分析。中国科学(c辑)27(6)，562-567)。
4.随着分子生物学的发展，一些病毒由于具备较好的安全性，较强的免疫原性，以及
便于基因操作的特点，作为重组病毒载体得到了广泛的研究和开发。目前主要应用于疫苗和基因治疗等医学领域。痘病毒载体自身较大，其基因组在180k左右，能容纳较大的外源基因片段，因而可作为优良的病毒载体，用于介导靶蛋白或其编码基因在体内的递送。
5.但痘苗病毒作为重组病毒载体，有很强的载体反应，能活化产生较强的针对痘苗病毒自身的免疫应答，其中包括强烈的中和抗体应答。而且，该应答持续时间很长，接种痘苗病毒载体疫苗的个体甚至终身具备该中和抗体应答。因而，体内存在的高水平中和抗体，将极大地影响目的重组痘苗病毒载体的再次感染，从而影响病毒载体药物投递效果。这一特点也限制了痘苗病毒载体的反复或多次应用。


技术实现要素：

6.针对现有技术所存在的上述缺点，本发明在于提供一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，重组病毒载体可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体，本发明重组痘苗载体的l1r和b5r编码基因被敲除或破坏，不能正常表达l1r和b5r基因，所述痘苗病毒载体可以作为肿瘤疫苗或基因治疗载体，可以用于预防或治疗多种肿瘤。
7.为了本发明的目的，以下定义下列术语。
8.本发明所称的“基因敲除”或“敲除”是一种遗传工程技术，是指利用外源的已突变的基因通过同源重组的方法替换掉内源的正常同源基因，从而使内源基因失活而表现突变体的性状的技术或方法。本发明中，所述l1r和b5r敲除是通过分别在l1r和b5r基因内部引入突变，通过同源重组的方式分别替换痘苗病毒内源的正常l1r和b5r基因，从而使得l1r和b5r基因不能正常表达。
9.本发明所称的“重组病毒载体(recombinant virus vector”或“重组病毒(recombinant virus)”是指通过dna重组技术产生，可用于生产病毒疫苗或制造基因疗法的载体。
10.本发明所称的“重组痘苗病毒载体(recombinant vaccinia virus vector)”或“重组痘苗病毒(recombinant vaccinia virus)”是指通过dna重组技术产生的痘苗病毒载体或痘苗病毒，可用于生产病毒疫苗或制造基因疗法的载体。在本发明中，“重组痘苗病毒载体”或“重组痘苗病毒”是通过带有目的基因同源臂序列的穿梭载体与痘苗病毒在目的细胞内通过同源重组产生，然后通过重组痘苗病毒携带的报告基因或抗性基因选择而纯化得到。
11.本发明所称的“穿梭质粒载体”或“穿梭载体”是指将目的基因序列导入另一物种基因组中的中间质粒载体。在本发明中，“穿梭质粒载体”或“穿梭载体”是指将目的基因序列通过同源重组的方式导入痘苗病毒载体中的中间质粒载体，其特征在于所述穿梭载体含有两段与痘苗病毒基因组部分序列相同的同源重组臂。
12.本发明所称的“同源重组臂”或“同源臂”是指与痘苗病毒内源基因相同的一段核酸序列。
13.一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，所述重组痘苗病毒载体的l1r和b5r编码基因被敲除，且不能正常表达l1r和b5r基因。
14.本发明进一步设置为：所述痘苗病毒载体为复制型痘苗病毒载体或非复制型痘苗
病毒载体。
15.本发明进一步设置为：所述l1r和b5r敲除是通过在分别在l1r和b5r基因内部引入突变，通过同源重组的方式替换痘苗病毒内源的正常l1r和b5r基因，使得l1r和b5r基因不能正常表达。
16.本发明进一步设置为：所述l1r和b5r敲除是通过分别在l1r和b5r两端的核酸序列中插入一段核酸序列，使得l1r和b5r基因突变，实施敲除，所述核酸序列包括至少一个痘苗病毒启动子元件，或至少一个报告基因或一个抗性基因，所述核酸序列还包括除报告基因或抗性基因以外的一个或多个外源基因。
17.本发明进一步设置为：所述痘苗病毒启动子元件为p7.5或pe/l。
18.本发明进一步设置为：所述报告基因为荧光蛋白编码基因或半乳糖苷酶编码基因。
19.本发明进一步设置为：所述抗性基因为新霉素编码基因，所述抗性基因用于重组痘苗病毒载体纯化时，施加选择性压力。
20.本发明进一步设置为：所述外源基因为除所述报告基因或抗性基因外的非痘苗病毒自身来源的基因。
21.本发明进一步设置为：所述l1r两端的核酸序列分别为l1r-l同源重组臂和l1r-r同源重组臂。
22.本发明进一步设置为：所述b5r两端的核酸序列分别为b5r-l同源重组臂和b5r-r同源重组臂。
23.本发明进一步设置为：所述l1r和b5r敲除的重组痘苗病毒载体在l1r和b5r同源重组臂序列中还插入了一段核酸序列。
24.本发明进一步设置为：所述l1r和b5r敲除的重组痘苗病毒载体为rvv-δl1r/g-b5r/r。
25.本发明进一步设置为：所述可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体为l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体。
26.本发明进一步设置为：所述l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体含有l1r-l同源重组臂序列，所述l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体还含有l1r-r同源重组臂序列。
27.本发明进一步设置为：所述l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体含有b5r-l同源重组臂序列，所述l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体还含有b5r-r同源重组臂序列。
28.一种用来构建l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体的穿梭载体，所述穿梭载体含有l1r或b5r同源重组臂序列。
29.所述穿梭载体包括第一穿梭载体和第二穿梭载体，其中，所述第一穿梭载体含有l1r同源重组臂序列，所述第二穿梭载体含有b5r同源重组臂序列。
30.本发明进一步设置为：所述第一穿梭载体含有l1r-l同源重组臂序列。
31.本发明进一步设置为：所述第一穿梭载体还含有l1r-r同源重组臂序列。
32.本发明进一步设置为：所述第二穿梭载体含有b5r-l同源重组臂序列。
33.本发明进一步设置为：所述第二穿梭载体还含有b5r-r同源重组臂序列。
34.本发明进一步设置为：所述第一穿梭载体在l1r同源重组臂序列之间还插入了一段核酸序列，所述核酸序列包括至少一个痘苗病毒启动子元件，或至少一个报告基因或一
个抗性基因，所述核酸序列还包括除报告基因或抗性基因以外的一个或多个外源基因。
35.本发明进一步设置为：所述第二穿梭载体在b5r同源重组臂序列之间还插入了一段核酸序列，所述核酸序列包括至少一个痘苗病毒启动子元件，或至少一个报告基因或一个抗性基因，所述核酸序列还包括除报告基因或抗性基因以外的一个或多个外源基因。
36.本发明进一步设置为：所述痘苗病毒启动子元件为p7.5或pe/l。
37.本发明进一步设置为：所述报告基因为荧光蛋白编码基因或半乳糖苷酶编码基因。
38.本发明进一步设置为：所述抗性基因为新霉素编码基因，所述抗性基因用于重组痘苗病毒载体纯化时，施加选择性压力。
39.本发明进一步设置为：所述外源基因为除所述报告基因或抗性基因外的非痘苗病毒自身来源的基因。
40.本发明进一步设置为：所述l1r两端的核酸序列分别为l1r-l同源重组臂和l1r-r同源重组臂。
41.本发明进一步设置为：所述b5r两端的核酸序列分别为b5r-l同源重组臂和b5r-r同源重组臂。
42.本发明进一步设置为：所述穿梭载体在l1r或b5r同源重组臂序列中还插入了一段核酸序列，其中，所述第一穿梭载体在l1r同源重组臂序列中还插入了一段核酸序列，所述第二穿梭载体在b5r同源重组臂序列中还插入了一段核酸序列。
43.本发明进一步设置为：所述第一穿梭载体为pδl1r-gfp，所述第二穿梭载体为pδb5r
–
mcherry
44.一种构建l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体的制备方法，包括以下步骤：
45.s1、设计引物，将pcr分别扩增l1r的两个同源重组臂。
46.s2、将所述两个同源重组臂插入目的穿梭载体，构建含有l1r同源重组臂序列的穿梭载体。
47.s3、将所述穿梭载体转染至痘苗病毒感染过的细胞中。
48.s4、从细胞中收集重组痘苗病毒载体，并在新的细胞上进行单斑纯化，得到l1r基因敲除的重组痘苗病毒载体。
49.s5、设计引物，将pcr分别扩增b5r的两个同源重组臂。
50.s6、将所述两个同源重组臂插入目的穿梭载体，构建含有b5r同源重组臂序列的穿梭载体。
51.s7、将所述穿梭载体转染至l1r基因敲除的痘苗病毒感染过的细胞中。
52.s8、从细胞中收集重组痘苗病毒载体，并在新的细胞上进行单斑纯化，得到l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体。
53.有益效果
54.采用本发明提供的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下有益效果：
55.本发明可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，重组痘苗载体的l1r和b5r编码基因被敲除或破坏，不能正常表达l1r和b5r基因，该痘苗病毒载体可以作为肿瘤疫苗或基因治疗载体，可以用于预防或治疗多种肿瘤，能够增加重组痘苗载体在体内的使用次数。
附图说明
56.图1为带有l1r-l和l1r-r同源重组臂序列的穿梭载体pδl1r-gfp的质粒图谱；
57.图2为带有l1r-l和l1r-r同源重组臂序列的穿梭载体pδl1r-gfp的双酶切鉴定图；
58.图3为重组痘苗病毒载体rvv-δl1r/g的pcr扩增鉴定图；
59.图4为重组痘苗病毒载体rvv-δl1r/g的表达鉴定图；
60.图5为带有b5r-l和b5r-r同源重组臂序列的穿梭载体pδb5r-mcherry的质粒图谱；
61.图6为带有b5r-l和b5r-r同源重组臂序列的穿梭载体pδb5r-mcherry的双酶切鉴定图；
62.图7为重组痘苗病毒载体rvv-δl1r/g-δb5r/r的pcr扩增鉴定图；
63.图8为重组痘苗病毒载体rvv-δl1r/g-δb5r/r的表达鉴定图；
64.图9为实施例9中的中和抗体检测结果；
65.图10为实施例10中的病毒复制动力学结果。
具体实施方式
66.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
67.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
68.参照图1-10所示：本发明的目的是提供一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，其中所述重组痘苗病毒载体的l1r和b5r编码基因被敲除，且不能正常表达l1r和b5r基因。
69.在本发明的一个实施方案中，痘苗病毒载体为复制型痘苗病毒载体，例如痘苗病毒天坛株，例如752-1株，或非复制型痘苗病毒载体，例如痘苗病毒减毒疫苗安卡拉株(modified vaccinia ankara，mva)。
70.在本发明的一个实施方案中，l1r和b5r敲除是指痘苗病毒基因l1r和b5r通过分别在l1r和b5r基因内部引入突变，通过同源重组的方式替换痘苗病毒内源的正常l1r和b5r基因，使得l1r和b5r基因不能正常表达。
71.在本发明的一个实施方案中，l1r和b5r敲除是分别通过在l1r和b5r两端的核酸序列中插入一段核酸序列，使得l1r和b5r基因突变，实施敲除，核酸序列包括至少一个痘苗病毒启动子元件，或至少一个报告基因或一个抗性基因，核酸序列还包括除报告基因或抗性基因以外的一个或多个外源基因。
72.在本发明的一个实施方案中，痘苗病毒启动子元件为p7.5或pe/l，优选地，p7.5的序列为如seq id no:13所示，pe/l的序列为如seq id no:14所示。
73.在本发明的一个实施方案中，报告基因为荧光蛋白编码基因或半乳糖苷酶编码基因(lac z)，优选地，荧光蛋白编码基因为绿色荧光蛋白编码基因，黄色荧光蛋白编码基因，红色荧光蛋白编码基因或蓝色荧光蛋白编码基因，更优选地，荧光蛋白编码基因为绿色荧
光蛋白编码基因(enhanced green fluorescent protein，egfp)，其核酸编码序列如seq id no:15所示。
74.在本发明的一个实施方案中，抗性基因为新霉素编码基因，抗性基因用于重组痘苗病毒载体纯化时，施加选择性压力。
75.在本发明的一个实施方案中，外源基因为除报告基因或抗性基因外的非痘苗病毒自身来源的基因，可以根据使用目的选择的目标抗原或免疫原编码基因，目的免疫原为任意一种或多种免疫原，优选地，目的免疫原为肽、抗原、半抗原、碳水化合物、蛋白质、核酸、过敏原、病毒或病毒的一部分、细菌、寄生虫或其它完整的微生物，此外，目的抗原或免疫原为肿瘤抗原或感染相关抗原。
76.在本发明的一个实施方案中，l1r两端的核酸序列分别为l1r-l同源重组臂和l1r-r同源重组臂，优选地，l1r-l同源重组臂序列如seq id no:1所示，l1r-r同源重组臂序列如seq id no:2所示，b5r两端的核酸序列分别为b5r-l同源重组臂和b5r-r同源重组臂，优选地，b5r-l同源重组臂序列如seq id no:18所示，b5r-r同源重组臂序列如seq id no:19所示。
77.在本发明的一个实施方案中，l1r和b5r敲除的重组痘苗病毒载体分别在l1r同源重组臂序列中还插入了一段核酸序列，核酸序列如seq id no:16所示。
78.在本发明的一个实施方案中，l1r和b5r敲除的重组痘苗病毒载体分别在b5r同源重组臂序列中还插入了一段核酸序列，核酸序列如seq id no:28所示。
79.在本发明的一个实施方案中，l1r和b5r敲除的重组痘苗病毒载体为rvv-δl1r/g-b5r/r。
80.在本发明的一个实施方案中，l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体含有l1r-l同源重组臂序列，l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体还含有l1r-r同源重组臂序列，优选地，l1r-l同源重组臂序列如seq id no:1所示，l1r-r同源重组臂序列如seq id no:2所示，此外，l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体还含有b5r-l同源重组臂序列，l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体还含有b5r-r同源重组臂序列，优选地，b5r-l同源重组臂序列如seq id no:18所示，b5r-r同源重组臂序列如seq id no:19所示。
81.本发明还提供了一种用来构建l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体的穿梭载体，穿梭载体含有l1r或b5r同源重组臂序列。
82.在本发明的一个实施方案中，所述穿梭载体包括第一穿梭载体和第二穿梭载体，其中，第一穿梭载体含有l1r同源重组臂序列，第二穿梭载体含有b5r同源重组臂序列。
83.在本发明的一个实施方案中，第一穿梭载体含有l1r-l同源重组臂序列，优选地，l1r-l同源重组臂序列如seq id no:1所示。
84.在本发明的一个实施方案中，穿梭载体还含有l1r-r同源重组臂序列，优选地，l1r-r同源重组臂序列如seq id no:2所示。
85.在本发明的一个实施方案中，第二穿梭载体含有b5r-l同源重组臂序列，优选地，b5r-l同源重组臂序列如seq id no:18所示。
86.在本发明的一个实施方案中，穿梭载体还含有b5r-r同源重组臂序列，优选地，b5r-r同源重组臂序列如seq id no:19所示。
87.在本发明的一个实施方案中，第一穿梭载体在l1r同源重组臂序列之间还插入了
一段核酸序列，核酸序列包括至少一个痘苗病毒启动子元件，或至少一个报告基因或一个抗性基因，核酸序列还包括除报告基因或抗性基因以外的一个或多个外源基因。
88.在本发明的一个实施方案中，第二穿梭载体在b5r同源重组臂序列之间还插入了一段核酸序列，核酸序列包括至少一个痘苗病毒启动子元件，或至少一个报告基因或一个抗性基因，核酸序列还包括除报告基因或抗性基因以外的一个或多个外源基因。
89.在本发明的一个实施方案中，痘苗病毒启动子元件为p7.5或pe/l，p7.5的序列为如seq id no:13所示，pe/l的序列为如seq id no:14所示。
90.在本发明的一个实施方案中，报告基因为荧光蛋白编码基因或半乳糖苷酶编码基因(lac z)，优选地，荧光蛋白编码基因为绿色荧光蛋白编码基因、黄色荧光蛋白编码基因、红色荧光蛋白编码基因或蓝色荧光蛋白编码基因，更优选地，荧光蛋白编码基因为绿色荧光蛋白编码基因(enhanced green fluorescent protein，egfp)，其核酸编码序列如seq id no:15所示，更优选地，荧光蛋白编码基因为红色荧光蛋白编码基因mcherry，其核酸编码序列如seq id no:26所示。
91.在本发明的一个实施方案中，抗性基因为新霉素编码基因，抗性基因用于重组痘苗病毒载体纯化时，施加选择性压力。
92.在本发明的一个实施方案中，外源基因为除报告基因或抗性基因外的非痘苗病毒自身来源的基因，可以根据使用目的选择的目标抗原或免疫原编码基因，目的免疫原为任意一种或多种免疫原，优选地，目的免疫原为肽、抗原、半抗原、碳水化合物、蛋白质、核酸、过敏原、病毒或病毒的一部分、细菌、寄生虫或其它完整的微生物，此外，目的抗原或免疫原为肿瘤抗原或感染相关抗原。
93.在本发明的一个实施方案中，第一穿梭载体l1r两端的核酸序列分别为l1r-l同源重组臂和l1r-r同源重组臂，优选地，l1r-l同源重组臂序列如seq id no:1所示，l1r-r同源重组臂序列如seq id no:2所示。
94.在本发明的一个实施方案中，第一穿梭载体在l1r同源重组臂序列中还插入了一段核酸序列，核酸序列如seq id no:16所示。
95.在本发明的一个实施方案中，第二穿梭载体b5r两端的核酸序列分别为b5r-l同源重组臂和b5r-r同源重组臂，优选地，b5r-l同源重组臂序列如seq id no:18所示，b5r-r同源重组臂序列如seq id no:19所示。
96.在本发明的一个实施方案中，第二穿梭载体在b5r同源重组臂序列中还插入了一段核酸序列，核酸序列如seq id no:28所示。
97.在本发明的一个实施方案中，第一穿梭载体为pδl1r-gfp，其序列如seq id no:17所示，第二穿梭载体为pδb5r-mcherry，其序列如seq id no:28所示。
98.本发明还提供了一种构建l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体的制备方法，包括以下步骤：
99.步骤一、设计引物，用pcr分别扩增l1r的两个同源重组臂。
100.步骤二、将所述两个同源重组臂插入目的穿梭载体，构建含有l1r同源重组臂序列的穿梭载体。
101.步骤三、将所述穿梭载体转染至痘苗病毒感染过的细胞中。
102.步骤四、从细胞中收集重组痘苗病毒载体，并在新的细胞上进行单斑纯化，得到
l1r基因敲除的重组痘苗病毒载体。
103.步骤五、设计引物，用pcr分别扩增b5r的两个同源重组臂。
104.步骤六、将所述两个同源重组臂插入目的穿梭载体，构建含有b5r同源重组臂序列的穿梭载体。
105.步骤七、将所述穿梭载体转染至l1r基因敲除的痘苗病毒感染过的细胞中。
106.步骤八、从细胞中收集重组痘苗病毒载体，并在新的细胞上进行单斑纯化，得到l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体。
107.其中，引物为可以结合l1r两端的引物序列，优选为seq id no:3l1r-lc-f引物、seq id no:4l1r-lc-r引物、seq id no:5l1r-rc-f引物或seq id no:6l1r-rc-r引物。
108.其中，引物为可以结合b5r两端的引物序列，优选为seq id no:20b5r-lc-f引物、seq id no:21b5r-lc-r引物、seq id no:22b5r-rc-f引物或seq id no:23b5r-rc-r引物。
109.穿梭载体其特征为含有l1r或b5r同源重组臂序列。
110.在本发明的一个实施方案中，穿梭载体为两个穿梭载体。其中，第一穿梭载体含有l1r同源重组臂序列，第二穿梭载体含有b5r同源重组臂序列。
111.在本发明的一个实施方案中，第一穿梭载体含有l1r-l同源重组臂序列，优选地，l1r-l同源重组臂序列如seq id no:1所示。
112.在本发明的一个实施方案中，第一穿梭载体还含有l1r-r同源重组臂序列，优选地，l1r-r同源重组臂序列如seq id no:2所示。
113.在本发明的一个实施方案中，第二穿梭载体含有b5r-l同源重组臂序列，优选地，b5r-l同源重组臂序列如seq id no:18所示。
114.在本发明的一个实施方案中，第二穿梭载体还含有b5r-r同源重组臂序列，优选地，b5r-r同源重组臂序列如seq id no:19所示。
115.在本发明的一个实施方案中，穿梭载体在l1r或b5r同源重组臂序列之间还插入了一段核酸序列。优选地，核酸序列包括至少一个痘苗病毒启动子元件，或至少一个报告基因或一个抗性基因，在本发明的实施方案中，核酸序列还可以包括除报告基因或抗性基因以外的一个或多个其他外源基因。
116.在一个实施方案中，痘苗病毒启动子元件为p7.5或pe/l，优选地，p7.5的序列为如seq id no:13所示，pe/l的序列为如seq id no:14所示。
117.在一个实施方案中，报告基因为荧光蛋白编码基因或半乳糖苷酶编码基因(lac z)，优选地，荧光蛋白编码基因为绿色荧光蛋白编码基因，黄色荧光蛋白编码基因，红色荧光蛋白编码基因或蓝色荧光蛋白编码基因。更优选地，荧光蛋白编码基因为绿色荧光蛋白编码基因(enhanced green fluorescent protein，egfp)，其核酸编码序列如seq id no:15所示。
118.在本发明中，抗性基因为如新霉素(neomycin)编码基因，可用于重组痘苗病毒载体纯化时，施加选择性压力。
119.在本发明中，其他外源基因为除报告基因或抗性基因外的其他非痘苗病毒自身来源的基因，可以根据使用目的选择的目标抗原或免疫原编码基因，目的免疫原为任意一种或多种免疫原。优选的，目的免疫原为肽、抗原、半抗原、碳水化合物、蛋白质、核酸、过敏原、病毒或病毒的一部分、细菌、寄生虫或其它完整的微生物。此外，目的抗原或免疫原为肿瘤
抗原或感染相关抗原。
120.在本发明的一个实施方案中，第一穿梭载体l1r两端的核酸序列分别为l1r-l同源重组臂和l1r-r同源重组臂，优选地，l1r-l同源重组臂序列如seq id no:1所示，l1r-r同源重组臂序列如seq id no:2所示。
121.在本发明的一个实施方案中，第一穿梭载体在l1r同源重组臂序列中还插入了一段核酸序列，核酸序列如seq id no:16所示。
122.在本发明的一个实施方案中，第二穿梭载体b5r两端的核酸序列分别为b5r-l同源重组臂和b5r-r同源重组臂，优选地，b5r-l同源重组臂序列如seq id no:18所示，b5r-r同源重组臂序列如seq id no:19所示。
123.在本发明的一个实施方案中，第二穿梭载体在b5r同源重组臂序列中还插入了一段核酸序列，核酸序列如seq id no:27所示。
124.在本发明的一个实施方案中，第一穿梭载体为pδl1r-gfp，其序列如seq id no:17所示，第二穿梭载体为pδb5r-mcherry，其序列如seq id no:28所示。
125.其中，痘苗病毒优选为复制型痘苗病毒载体，例如痘苗病毒天坛株，例如752-1株，或者为非复制型痘苗病毒载体，例如痘苗病毒减毒疫苗安卡拉株(modified vaccinia ankara，mva)。
126.细胞为真核细胞系，优选为哺乳动物细胞系，例如293t细胞、143b细胞、vero细胞或bhk-21细胞系。
127.转染为本领域熟知的技术方法，即将目的质粒dna投递至细胞中，包括但不限于物理方法(例如电穿孔法、细胞挤压法、奈米粒子以及磁转)，或者化学方法(例如磷酸钙转染法，脂质体转染法，deae-葡聚糖或聚乙烯亚胺转染法)，优选地，转染为聚乙烯亚胺转染法，例如turbofect(thermo fisher scientific，r0531)转染试剂。
128.为了更好的对本发明进行说明，请见实施例1-10：
129.实施例1pδl1r-gfp穿梭载体构建。
130.通过在天坛株痘病毒tp5克隆基因组(genbank:kc207811)序列上设计引物(表1)，以痘苗病毒野生型rvv-wt基因组dna(制备方法参考实施例3)为模板，分别扩增l1r-l(seq id no:1)和l1r-r(seq id no:2)片段，其中，l1r-lc-f和l1r-lc-r引物对用于扩增l1r-l片段，l1r-rc-f和l1r-rc-r引物对用于扩增l1r-r片段。
131.表1：实施例1中的引物
[0132][0133][0134]
第1步，构建带有l1r-l同源重组臂中间载体pδl1r-l-gfp。首先以从psc65穿梭载体(addgene，货号：30327)改造得到的psc65-gfp载体(将psc65载体上的表达半乳糖苷酶的lacz替换为表达绿色荧光蛋白的egfp基因，由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)为模板，用tkl-f和tkl-r(表1)引物对pcr扩增出大小为5kbp左右的线性化载体。然后用easygeno快速克隆试剂盒(天根，vi201)将该线性化载体与l1r-l片段进行同源重组，方法参考试剂盒说明书。然后用本领域熟知的重组转化方法构建成带有l1r-l同源臂序列的载体pδl1r-l-gfp。
[0135]
第2步，构建穿梭载体pδl1r-gfp。以第1步中构建的中间载体pδl1r-l-gfp为模板，用tkr-f和tkr-r引物对(表1)扩增出大小为5kbp左右的线性化载体。然后用easygeno快速克隆试剂盒(天根，vi201)将该线性化载体与l1r-r片段进行同源重组，方法参考试剂盒
说明书。然后用本领域熟知的重组转化方法构建成带有l1r-l和l1r-r同源臂序列的载体pδl1r-gfp(质粒图谱如图1)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶not和kpn i鉴定载体pδl1r-gfp(酶切体系如表2)，其酶切验证图谱如图4所示。
[0136]
表2：质粒pδl1r-gfp的酶切鉴定体系(37℃酶切2小时)
[0137]
酶切体系体积质粒pδl1r-gfp3μl，约1μgnot i(宝生物，货号1166a)1μlkpn i(宝生物，货号1068a)1μl酶切缓冲液1μlddh2o补至10μl
[0138]
实施例2重组痘苗病毒载体rvv-δl1r/g构建。
[0139]
在293t细胞中获得重组痘苗病毒载体，具体方法如下。第1天，在6孔细胞培养板(jet，tcp-010-006)铺293t细胞，1
×
106/孔，于37℃在二氧化碳细胞培养箱中过夜孵育。第二天，以0.05moi(即5
×
104pfu(空斑形成单位)/孔)加入痘苗病毒野生株rvv-wt(由北京生物制品所提供)，然后置于37℃二氧化碳细胞培养箱中孵育两个小时，期间准备穿梭载体/转染试剂复合物。其中穿梭载体为实施例1中获得的pδl1r-gfp，转染试剂为turbofect(thermo fisher scientific，r0531)，转染剂量与复合方法可参见转染试剂说明书。复合体系完成后，将293t细胞上清换为2ml/孔的含2％胎牛血清(fbs)的dmem维持培养基，然后加入穿梭载体/转染试剂复合物。转染48小时后，去上清，收集细胞，并在0.5ml维持培养基中重悬，反复冻融三次，然后将重组细胞裂解物接入vero细胞(ccl-81)上，37℃孵育1到2天。期间观察细胞病变，待病毒噬斑出现合适数量时(低于20空斑/孔)，进行单斑纯化。
[0140]
单斑纯化：
[0141]
在荧光显微镜下观察表达绿色荧光的病毒噬斑，做好标记。
[0142]
去上清，每孔挑取若干个分散较好的绿色荧光噬斑，分别转移至含0.5ml维持培养液的离心管中。
[0143]
振荡混匀含病毒的离心管，反复冻融三次(-80℃冰箱约5分钟，室温约2分钟)，最后振荡混匀，-80℃冻存。
[0144]
在6孔细胞培养板(jet，tcp-010-006)上准备vero细胞(ccl-81)，然后从-80℃冰箱取出病毒，分别接种10μl至vero细胞上，37℃孵育2到3天。期间观察细胞病变，待病毒噬斑出现合适数量时(低于20空斑/孔)，进行下一轮单斑纯化。
[0145]
重复至少六轮单斑纯化，直至纯度至100％。
[0146]
实施例3重组痘苗病毒载体rvv-δl1r/g鉴定。
[0147]
将完成纯化的痘病毒载体rvv-δl1r/g接种到vero细胞上(1
×
107细胞)，48小时后观察病变情况，待80％以上细胞感染时，收集细胞，1800g离心5分钟，去上清。然后用基因组dna提取试剂盒(tran,ee101-02)提取痘病毒基因组dna，具体方法参看试剂盒说明书，最后得到100μl基因组dna，-20℃冻存。
[0148]
用l1r基因两端的引物对l1r-f和l1r-r(表3)pcr扩增痘病毒基因组dna，结果如图
3所示，重组痘病毒载体rvv-δl1r/g基因组dna中能扩增出大小为2394bp的目的条带。将pcr扩增产物样品送金唯智公司测序，序列结果符合预期，表明l1r片段成功敲除。
[0149]
表3：实施例3中的鉴定用引物
[0150][0151]
同样地，将完成纯化的痘病毒载体rvv-δl1r/g接种到vero细胞上(1
×
107细胞)，48小时后观察病变情况，待80％以上细胞感染时，收集细胞，1800g离心5分钟，去上清。然后制成sds-page样品并进行免疫印迹杂交实验(一抗用抗gfp单抗-hrp(santacruz,sc-9996hrp))。如图4所示，在25kd左右有特异性条带，与预期的分子量位置吻合，而对照样品(rvv-wt)未见相应分子量位置的条带，表明所构建的rvv-δl1r/g能正确表达插入的外源基因gfp目的抗原。
[0152]
实施例4重组痘苗病毒载体rvv-δl1r/g扩增制备与滴定。
[0153]
将实施例2中构建的重组痘苗病毒载体rvv-δl1r/g以及痘苗病毒野生株(rvv-wt)分别在vero细胞上扩增，扩增方法如下：
[0154]
前一天，准备汇集度100％的vero单层细胞(1
×
107细胞/皿)，共10皿。
[0155]
去上清，换为维持培养基，将待扩增的痘病毒接种到细胞上(0.01pfu/细胞)，37℃培养箱中孵育2-3天，观察可见明显的细胞病变。
[0156]
将细胞刮下并收集，1800g离心5分钟，去上清。
[0157]
用5ml维持培养基进行重悬，在冰上用超声波细胞粉粹机超声，超声条件为：50瓦，5秒超声/5秒间隔，共15分钟。
[0158]
反复冻融两次(-80℃冰箱约5分钟，室温约2分钟)，最后振荡混匀；
[0159]
在二级生物安全柜中进行分装至1.5ml离心管中，1ml/支，-80℃冻存。
[0160]
扩增制备好的痘苗病毒在vero细胞上进行感染效价滴定，具体方法如下：
[0161]
前一天，在24孔板中，准备汇集度100％的vero细胞，3
×
105/孔。
[0162]
去上清，每孔添加200μl维持培养液，以防止细胞干涸。
[0163]
取100μl待测痘病毒加入900μl维持培养基，十倍稀释，连续稀释101，102，103，
……
，直到109倍。注意：进行稀释时，因为由高浓度向低浓度稀释，每次向低浓度稀释应更换枪头。
[0164]
从病毒浓度由小到大(109，108，
……
104)添加到24孔板中，每孔400μl稀释液，两个重复，连续测定6个稀释倍数。将添加完的24孔板放入37℃细胞培养箱中孵育2天。
[0165]
显微镜下数出病毒蚀斑的数目，多于20的，记为20 。将可以数出的20以内(含20)蚀斑数目的两复孔求平均
×
2.5(1000μl/400μl)
×
相应孔的稀释倍数，即为重组病毒滴度
(pfu/ml)。痘苗病毒载体效价滴定结果如表4所示。
[0166]
表4：痘苗病毒载体效价滴定
[0167]
痘苗病毒效价(pfu/ml)痘苗病毒野生型rvv-wt1
×
108重组痘苗病毒rvv-δl1r/g1
×
108[0168]
实施例5pδb5r-mcherry穿梭载体构建。
[0169]
通过在天坛株痘病毒tp5克隆基因组(genbank:kc207811)序列上设计引物(表5)，以痘苗病毒野生型rvv-wt基因组dna(制备方法参考实施例3)为模板，分别扩增b5r-l(seq id no:18)和b5r-r(seq id no:19)片段，其中，b5r-lc-f和b5r-lc-r引物对用于扩增b5r-l片段，b5r-rc-f和b5r-rc-r引物对用于扩增b5r-l片段。
[0170]
表5：实施例5中的引物
[0171]
[0172][0173]
第1步，构建带有b5r-l同源重组臂中间载体pδb5r-l。首先以从psc65穿梭载体(addgene，货号：30327)改造得到的psc65-mcherry载体(将psc65载体上的表达半乳糖苷酶的lacz替换为表达红色荧光蛋白的mcherry基因，由苏州工业园区唯可达生物科技有限公司提供)为模板，用tkl-f和tkl-r(表5)引物对pcr扩增出大小为5kbp左右的线性化载体。然后用easygeno快速克隆试剂盒(天根，vi201)将该线性化载体与b5r-l片段进行同源重组，方法参考试剂盒说明书。然后用本领域熟知的重组转化方法构建成带有b5r-l同源臂序列的载体pδb5r-l。
[0174]
第2步，构建穿梭载体pδb5r-mcherry。以第1步中构建的中间载体pδb5r-l为模板，用tkr-f和tkr-r引物对(表5)扩增出大小为5kbp左右的线性化载体。然后用easygeno快速克隆试剂盒(天根，vi201)将该线性化载体与b5r-r片段进行同源重组，方法参考试剂盒说明书。然后用本领域熟知的重组转化方法构建成带有b5r-l和b5r-r同源臂序列的载体pδb5r-mcherry(质粒图谱如图5)，经测序鉴定正确后入库。用限制内切酶not i与kpn i鉴定载体pδb5r-mcherry(酶切体系如表6)，其酶切验证图谱如图6所示。
[0175]
表6：质粒pδb5r-mcherry的酶切鉴定体系(37℃酶切2小时)
[0176]
酶切体系体积质粒pδb5r-mcherry3μl，约1μgnot i(宝生物，货号1166a)1μlkpn i(宝生物，货号1068a)1μl酶切缓冲液1μlddh2o补至10μl
[0177]
实施例6重组痘苗病毒载体rvv-δl1r/g-δb5r/r构建。
[0178]
在293t细胞中获得重组痘苗病毒载体，具体方法如下。第1天，在6孔细胞培养板(jet，tcp-010-006)铺293t细胞，1
×
106/孔，于37℃在二氧化碳细胞培养箱中过夜孵育。第二天，以0.05moi(即5
×
104pfu(空斑形成单位)/孔)加入实施例4制备的重组痘苗病毒载体
rvv-δl1r/g，然后置于37℃二氧化碳细胞培养箱中孵育两个小时，期间准备穿梭载体/转染试剂复合物。其中穿梭载体为实施例5中获得的pδb5r-mcherry，转染试剂为turbofect(thermo fisher scientific，r0531)，转染剂量与复合方法可参见转染试剂说明书。复合体系完成后，将293t细胞上清换为2ml/孔的含2％胎牛血清(fbs)的dmem维持培养基，然后加入穿梭载体/转染试剂复合物。转染48小时后，去上清，收集细胞，并在0.5ml维持培养基中重悬，反复冻融三次，然后将重组细胞裂解物接入vero细胞(ccl-81)上，37℃孵育1到2天。期间观察细胞病变，待病毒噬斑出现合适数量时(低于20空斑/孔)，进行单斑纯化。
[0179]
单斑纯化：
[0180]
在荧光显微镜下观察表达红色荧光的病毒噬斑，做好标记。
[0181]
去上清，每孔挑取若干个分散较好的红色荧光噬斑，分别转移至含0.5ml维持培养液的离心管中。
[0182]
振荡混匀含病毒的离心管，反复冻融三次(-80℃冰箱约5分钟，室温约2分钟)，最后振荡混匀，-80℃冻存。
[0183]
在6孔细胞培养板(jet，tcp-010-006)上准备vero细胞(ccl-81)，然后从-80℃冰箱取出病毒，分别接种10μl至vero细胞上，37℃孵育2到3天。期间观察细胞病变，待病毒噬斑出现合适数量时(低于20空斑/孔)，进行下一轮单斑纯化。
[0184]
重复至少六轮单斑纯化，直至纯度至100％。
[0185]
实施例7重组痘苗病毒载体rvv-δl1r/g-δb5r/r鉴定。
[0186]
将实施例6中完成纯化的痘病毒载体rvv-δl1r/g-δb5r/r接种到vero细胞上(1
×
107细胞)，48小时后观察病变情况，待80％以上细胞感染时，收集细胞，1800g离心5分钟，去上清。然后用基因组dna提取试剂盒(tran,ee101-02)提取痘病毒基因组dna，具体方法参看试剂盒说明书，最后得到100μl基因组dna，-20℃冻存。
[0187]
用b5r基因两端的引物对p75-f和b5r-r(表7)分别pcr扩增痘苗病毒基因组dna，结果如图7所示，重组痘病毒载体rvv-δl1r/g-δb5r/r基因组dna中能扩增出大小为1.3k左右目的条带。将pcr扩增产物样品送金唯智公司测序，序列结果符合预期，表明b5r片段成功敲除。
[0188]
表7：实施例7中的鉴定用引物
[0189]
引物序列b5r-f(seq id no:25)tgttatgcgtactacctgctgb5r-r(seq id no:26)aacgattctatttcttgttcap75-f(seq id no:30)acccacccgctttttatagta
[0190]
同样地，将完成纯化的痘苗病毒载体rvv-δl1r/g-δb5r/r接种到vero细胞上(1
×
107细胞)，48小时后观察病变情况，待80％以上细胞感染时，收集细胞，1800g离心5分钟，去上清。然后制成sds-page样品并进行免疫印迹杂交实验(一抗用抗gfp单抗-hrp(santacruz,sc-9996hrp))。如图8所示，在25kd左右有特异性条带，与预期的分子量位置吻合，而对照样品(rvv-wt)未见相应分子量位置的条带，表明所构建的rvv-δl1r/g能正确表达插入的外源基因gfp目的抗原。
[0191]
实施例8重组痘苗病毒载体rvv-δl1r/g-δb5r/r扩增制备与滴定。
[0192]
将实施例6中构建的重组痘苗病毒载体rvv-δl1r/g-δb5r/r以及痘苗病毒野生株(rvv-wt)分别在vero细胞上扩增，扩增方法如下：
[0193]
前一天，准备汇集度100％的vero单层细胞(1
×
107细胞/皿)，共10皿。
[0194]
去上清，换为维持培养基，将待扩增的痘病毒接种到细胞上(0.01pfu/细胞)，37℃培养箱中孵育2-3天，观察可见明显的细胞病变。
[0195]
将细胞刮下并收集，1800g离心5分钟，去上清。
[0196]
用5ml维持培养基进行重悬，在冰上用超声波细胞粉粹机超声，超声条件为：50瓦，5秒超声/5秒间隔，共15分钟。
[0197]
反复冻融两次(-80℃冰箱约5分钟，室温约2分钟)，最后振荡混匀；
[0198]
在二级生物安全柜中进行分装至1.5ml离心管中，1ml/支，-80℃冻存。
[0199]
扩增制备好的痘苗病毒在vero细胞上进行感染效价滴定，具体方法如下：
[0200]
前一天，在24孔板中，准备汇集度100％的vero细胞，3
×
105/孔。
[0201]
去上清，每孔添加200μl维持培养液，以防止细胞干涸。
[0202]
取100μl待测痘病毒加入900μl维持培养基，十倍稀释，连续稀释101，102，103，
……
，直到109倍。注意：进行稀释时，因为由高浓度向低浓度稀释，每次向低浓度稀释应更换枪头。
[0203]
从病毒浓度由小到大(109，108，
……
104)添加到24孔板中，每孔400μl稀释液，两个重复，连续测定6个稀释倍数。将添加完的24孔板放入37℃细胞培养箱中孵育2天。
[0204]
显微镜下数出病毒蚀斑的数目，多于20的，记为20 。将可以数出的20以内(含20)蚀斑数目的两复孔求平均
×
2.5(1000μl/400μl)
×
相应孔的稀释倍数，即为重组病毒滴度(pfu/ml)。痘苗病毒载体效价滴定结果如表8所示。
[0205]
表8痘苗病毒载体效价滴定
[0206][0207]
实施例9中和抗体检测。
[0208]
中和抗体检测方法如下：在96孔平底板第1列(细胞对照)所有孔中加入100μl dmem细胞培养基，2-12列所有孔中加入50有孔中加入me细胞培养基(第2列将作为病毒对照)。再在h3-h12孔中加入30加入12对照)细胞培养基(按1:10起始稀释度，2倍梯度稀释)。在h3-h12孔中分别加入20分别待测人血浆样本。混匀h行中所有样品，然后转移50所有至g行。重复混匀并转移，直至a行(2倍梯度稀释)。待最后一次转移和混匀完成后，从a行3-12列中弃去50弃去。计算痘苗病毒用量，以40pfu/孔作为感染剂量，融化足量的病毒储液。当融化完全时，用dmem细胞培养基稀释病毒至800pfu/ml。在96孔板中的2-12列所有孔中加入50
μl病毒稀释液，盖好板子，在细胞培养箱中孵育1小时。准备vero细胞，用胰酶/edta消化vero细胞，制成细胞悬液，用2％dmem维持培养基调整细胞浓度至5持培养5/ml，然后加入96孔细胞培养板，100μl/孔，即5
×
10
4/
孔。48小时后，小心吸弃上清，加入0.1％结晶紫，50μl/孔，室温染色10分钟。拍照，计算各孔空斑数量，并用实验孔空斑数量除以病毒对照(列2)空斑均值，再用1减，然后乘以100，即得到所测样品的抑制率百分数。根据抑制百分数确定ic50滴度，中和抗体ic50滴度可以表示为抑制率百分数》50的最高稀释度的倒数，也可以根据抑制率百分数拟合曲线计算ic50。
[0209]
结果如图9所示，人血浆对痘苗病毒野生型(rvv-wt)有较高的中和抗体水平(gmt均值为190.3)，而针对l1r和b5r缺陷型毒株rvv-δl1r/g-δb5r/r的中和抗体水平显著下降(gmt均值为56.6，p《0.05)。结果表明，l1r和b5r敲除后的毒株对人体内既存的抗体产生了逃逸，增加了再次感染的机会，提高了痘苗病毒载体的应用可能性。
[0210]
实施例10病毒复制动力学。
[0211]
在6孔板上准备vero细胞，以0.1moi接种痘苗病毒至各孔(1.5
×
105pfu)，然后在感染后各时间点分别取上清和细胞，冻融3次后在vero细胞上滴定(方法参看实施例4中的病毒滴定)。
[0212]
结果如图10所示，野生型痘苗病毒rvv-wt复制能力强，病毒主要存在于细胞中，上清含量较少，比细胞低。与野生型毒株相比，l1r和b5r缺陷型毒株rvv-δl1r/g-δb5r/r的复制能力略弱，复制动力学曲线趋势一致，均在48小时达到顶峰，比野生型毒株rvv-wt低约半个数量级，然后之后的时间点，差异逐渐减少。表明l1r和b5r敲除略微影响痘苗病毒的复制能力。
[0213]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不会使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。