一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体的制作方法

技术特征：
1.一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，其特征在于，所述重组痘苗病毒载体的l1r和b5r编码基因被敲除，且不能正常表达l1r和b5r基因。2.根据权利要求1所述的一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，其特征在于，所述痘苗病毒载体为复制型痘苗病毒载体或非复制型痘苗病毒载体。3.根据权利要求2所述的一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，其特征在于，所述l1r和b5r敲除是通过分别在l1r和b5r两端的核酸序列中插入一段核酸序列，使得l1r和b5r基因突变，实施敲除，所述核酸序列包括至少一个痘苗病毒启动子元件，或至少一个报告基因或一个抗性基因，所述核酸序列还包括除报告基因或抗性基因以外的一个或多个外源基因。4.根据权利要求3所述的一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，其特征在于，所述痘苗病毒启动子元件为p7.5或pe/l，优选地，所述p7.5的序列为seq id no:13，所述pe/l的序列为seq id no:14。5.根据权利要求4所述的一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，其特征在于，所述报告基因为荧光蛋白编码基因或半乳糖苷酶编码基因。6.根据权利要求5所述的一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，其特征在于，所述l1r两端的核酸序列分别为l1r-l同源重组臂或l1r-r同源重组臂，其中，所述l1r-l同源重组臂序列为seq id no:1，所述l1r-r同源重组臂序列为seq id no:2，所述b5r两端的核酸序列分别为b5r-l同源重组臂或b5r-r同源重组臂，其中，所述b5r-l同源重组臂序列为seq id no:18，所述b5r-r同源重组臂序列为seq id no:19。7.根据权利要求6所述的一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，其特征在于，所述l1r和b5r敲除的重组痘苗病毒载体在l1r同源臂之间的核酸序列为seq id no:16，且在b5r同源臂之间的核酸序列为seq id no:27。8.一种用来构建的l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体的穿梭载体，其特征在于，所述穿梭载体包括第一穿梭载体和第二穿梭载体，其中，所述第一穿梭载体含有l1r同源重组臂序列，所述第二穿梭载体含有b5r同源重组臂序列。9.根据权利要求8所述的一种用来构建的l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体的穿梭载体，其特征在于，所述第一穿梭载体含有l1r
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l和l1r-r同源重组臂序列，其中，所述l1r-l同源重组臂序列为seq id no:1，所述l1r-r同源重组臂序列为seq id no:2。10.根据权利要求8所述的一种用来构建的l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体的穿梭载体，其特征在于，所述第二穿梭载体含有b5r
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l和b5r-r同源重组臂序列，其中，所述b5r
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l同源重组臂序列为seq id no:18，所述b5r-r同源重组臂序列为seq id no:19。11.根据权利要求9所述的一种用来构建的l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体的穿梭载体，其特征在于，所述第一穿梭载体在l1r同源重组臂序列之间还插入了一段核酸序列，所述核酸序列包括至少一个痘苗病毒启动子元件，或至少一个报告基因或一个抗性基因，所述核酸序列还包括除报告基因或抗性基因以外的一个或多个外源基因，优选地，所述l1r同源重组臂序列之间插入的核酸序列为seq id no:16。12.根据权利要求11所述的一种用来构建的l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体的穿梭载体，其特征在于，所述第二穿梭载体在b5r同源重组臂序列之间还插入了一段核酸序
列，所述核酸序列包括至少一个痘苗病毒启动子元件，或至少一个报告基因或一个抗性基因，所述核酸序列还包括除报告基因或抗性基因以外的一个或多个外源基因，优选地，所述b5r同源重组臂序列之间插入的核酸序列为seq id no:27。13.根据权利要求12所述的一种用来构建l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体的穿梭载体，其特征在于，所述痘苗病毒启动子元件为p7.5或pe/l，优选地，所述p7.5的序列为seq id no:13，所述pe/l的序列为seq id no:14。14.根据权利要求13所述的一种用来构建l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体的穿梭载体，其特征在于，所述报告基因为荧光蛋白编码基因或半乳糖苷酶编码基因。15.根据权利要求11所述的一种用来构建的l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体的穿梭载体，其特征在于，所述第一穿梭载体为pδl1r-gfp，其序列为seq id no:17。16.根据权利要求12所述的一种用来构建的l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体的穿梭载体，其特征在于，所述第二穿梭载体为pδb5r-mcherry，其序列为seq id no:28。17.一种构建l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、设计引物，将pcr分别扩增l1r的两个同源重组臂；s2、将所述两个同源重组臂插入目的穿梭载体，构建含有l1r同源重组臂序列的穿梭载体；s3、将所述穿梭载体转染至痘苗病毒感染过的细胞中；s4、从细胞中收集重组痘苗病毒载体，并在新的细胞上进行单斑纯化，得到l1r基因敲除的重组痘苗病毒载体；s5、设计引物，将pcr分别扩增b5r的两个同源重组臂；s6、将所述两个同源重组臂插入目的穿梭载体，构建含有b5r同源重组臂序列的穿梭载体；s7、将所述穿梭载体转染至l1r基因敲除的痘苗病毒感染过的细胞中；s8、从细胞中收集重组痘苗病毒载体，并在新的细胞上进行单斑纯化，得到l1r和b5r基因敲除的重组痘苗病毒载体。

技术总结
本发明涉及分子生物学和免疫学技术领域，具体涉及一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体；重组痘苗病毒载体带有L1R和B5R同源重组臂序列，重组病毒载体为可用来构建在痘苗病毒L1R和B5R基因区域内插入外源基因的痘苗病毒载体；本发明提供了一种可以逃逸体内存在的既有抗痘苗病毒中和抗体的重组痘苗病毒载体，重组痘苗载体的L1R和B5R编码基因被敲除或破坏，不能正常表达L1R和B5R基因，该痘苗病毒载体可以作为肿瘤疫苗或基因治疗载体，可以用于预防或治疗多种肿瘤。瘤。瘤。


技术研发人员：徐建青 李雪 黄杨
受保护的技术使用者：苏州工业园区唯可达生物科技有限公司
技术研发日：2021.06.22
技术公布日：2022/2/18