一种分离纯化蝉拟青霉5704s菌丝体中HEA的方法与流程

一种分离纯化蝉拟青霉5704s菌丝体中hea的方法
技术领域
1.本发明涉及生物制品加工技术领域，具体涉及一种分离纯化蝉拟青霉5704s菌丝体中n
6-(2-羟乙基)腺苷的方法。


背景技术：

2.蝉拟青霉paecilomyces cicadae是蝉花的无性型，含有多种氨基酸、蛋白质、多糖以及核苷类物质等活性物质，具有镇痛、降血糖、降血压、抗肿瘤等功效。n
6-(2-羟乙基)腺苷[n
6-(2-hydroxyethyl) adenosine,hea]是第一种生物来源的钙离子拮抗剂，为腺苷类衍生物，首次分离于虫草液体培养菌丝体，具有镇静、镇痛、降血压、抗肿瘤、保护肾脏、降低炎症反应等多种功效，其含量的高低是评价虫草质量的重要指标之一。目前已报道的n
6-(2-羟乙基)腺苷产生菌主要是广义虫草属的一些种类及从其上分离得到的菌株，包括粉被虫草 cordyceps pruinosapetch、高雄山虫草c.takaomontan yakush.&kumaz、蝉花i.cicadae miq.等十余种，其中蝉花是n
6-(2-羟乙基)腺苷含量较高的虫草。n
6-(2-羟乙基)腺苷因具有效果显著的多种医疗功效而在医药和保健方面都具有较大的开发价值以及可观的市场前景，但目前而言，人们对n
6-(2-羟乙基)腺苷的研究尚处于前期探索阶段， n
6-(2-羟乙基)腺苷的高产菌株比较稀缺，对n
6-(2-羟乙基)腺苷采用的分离纯化方法也比较单一。
[0003]
目前分离纯化虫草中核苷类物质的方法主要有大孔树脂吸附法、离子交换树脂吸附法、硅胶柱层析分离、氧化铝柱层析、半制备液相、顺序式模拟移动床色谱分离等，其中大孔树脂因其操作简单、成本低、可回收以及纯化效果显著等优点而被广泛应用于多种天然产物的纯化。核苷类物质因具有酚羟基，可与大孔树脂形成氢键，从而达到选择吸附条件，因此大孔树脂是分离纯化n
6-(2-羟乙基)腺苷的理想选择。半制备高效液相色谱不仅能从天然产物中分离得到高纯度的化合物单体，而且产率高、速度快、操作简单、便于收集。当半制备高效液相色谱与大孔吸附树脂联用时，分离纯化效果更好。提取物经大孔树脂处理后，可去除多糖、蛋白质及杂质，再通过半制备高效液相色谱分离即可得到单体化合物，可使分离纯化过程更加快速、高效，大大节省溶剂的使用量。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于建立一种分离纯化蝉拟青霉5704s菌丝体中 hea的方法，该方法简单可行，重复性好，能够提高天然产物的利用效益，也为其今后在工业上的扩大化生产提供理论依据。
[0005]
本发明的目的是采取以下技术方案达到的：
[0006]
一种分离纯化蝉拟青霉5704s菌丝体中hea的方法，其特征在于：包括以下步骤：
[0007]
(1)取烘干的蝉拟青霉5704s菌丝体为原料，放入超微粉碎机中进行超微粉碎，过筛得到超微粉；所述蝉拟青霉5704s采自四川省峨眉山的蝉花分离纯化得到，分离鉴定纯化后由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：cgmcc no.22418，保藏
日期：2021年5月10日；保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0008]
(2)按照液料比为50:1往超微粉中加70％甲醇、超声提取后过滤，再次超声提取后过滤，合并提取液；
[0009]
(3)提取液浓缩去醇，冷沉过夜，取上清过滤清亮，上100mldm130大孔树脂柱，3倍柱体积水洗去杂，5倍柱体积20％乙醇洗脱；收集洗脱液，浓缩成浸膏，加入甲醇50ml，超声溶解，过滤，取滤液过10ml酸性氧化铝柱脱色，并用50ml甲醇洗脱，收集脱色后药液，浓缩蒸干得粗品；
[0010]
(4)取粗品用10ml甲醇超声溶解，过0.45μm微滤膜后通过半制备液相色谱进行分离，有机相为甲醇，水相为水，梯度洗脱，检测波长为260nm，进样量为100μl，收集目的色谱峰，浓缩后真空干燥，得hea，所述hea为n
6-(2-羟乙基)腺苷。
[0011]
所述步骤(1)中粉碎时间为每次3s，一共3次；过筛目数为80目。
[0012]
所述步骤(2)中超声时间为30min；提取次数为2次。
[0013]
所述步骤(3)酸性氧化铝柱脱色的径高比1：13。
[0014]
所述步骤(4)中采用的半制备液相色谱型号为日本津岛lc-20ar半制备高效液相色谱仪；采用半制备液相色谱柱为日本津岛shin-packg2sc18，规格20
×
250mm，5μm。
[0015]
本发明旨在建立一种高效、低成本的分离纯化蝉拟青霉5704s菌丝体中n
6-(2-羟乙基)腺苷的方法，使分离纯化过程更加快速、高效，大大节省溶剂的使用量。该方法简单可行，重复性好，能够提高天然产物的利用效益，也为其今后在工业上的扩大化生产提供理论依据。
附图说明
[0016]
图1是n
6-(2-羟乙基)腺苷标品分析色谱图。
[0017]
图2是供试品分析色谱图。
[0018]
图3是虫草素与n
6-(2-羟乙基)腺苷混标样制备液相定位色谱图。
[0019]
图4是供试品制备色谱图。
[0020]
图5是目标物的esi-ms图谱。
[0021]
图6是目标物的hnmr图谱。
具体实施方式
[0022]
下面通过实施例及附图对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
[0023]
实施例1：蝉拟青霉5704s菌丝体中n
6-(2-羟乙基)腺苷的分离纯化，步骤如下：
[0024]
(1)取烘干的蝉拟青霉5704s菌丝体为原料，放入超微粉碎机中进行超微粉碎，每次粉碎3s，一共3次，过80目筛得到超微粉；所述蝉拟青霉5704s采自四川省峨眉山的蝉花分离纯化得到，分离鉴定纯化后由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：cgmccno.22418，保藏日期：2021年5月10日；
[0025]
(2)按照液料比为50:1往超微粉中加1l70％甲醇、超声提取30min后过滤，按照液料比为50:1往滤渣中加1l70％甲醇、再次超声提取30min后过滤，合并提取液；
[0026]
(3)提取液浓缩去醇，冷沉过夜，取上清过滤清亮，上100mldm130大孔树脂柱，3倍柱体积水洗去杂，5倍柱体积20％乙醇洗脱。收集洗脱液，浓缩成浸膏，加入甲醇50ml，超声溶解，过滤，取滤液过10ml酸性氧化铝柱脱色(径高比1：13)，并用50ml甲醇洗脱，收集脱色后药液，浓缩蒸干得粗品；
[0027]
(4)取粗品用10ml甲醇超声溶解，过0.45μm微滤膜后通过lc-20ar半制备液相色谱进行分离，色谱柱为shin-packg2sc18(20
×
250mm，5μm)，梯度洗脱，洗脱梯度如表1所示，检测波长为260nm，进样量为100μl，基于定位对照溶液的制备色谱结果(图3)收集图4中的目的色谱峰，浓缩后真空干燥，得白色结晶型粉末的目的组分，初步判定为n
6-(2-羟乙基)腺苷。定位对照溶液的制备：用50％色谱甲醇溶解n
6-(2-羟乙基)腺苷标准品和虫草素标准品分别制成400μg/ml的标准品对照溶液，按照v
hea标准品对照溶液
：v
虫草素标准品对照溶液
＝2:1的比例混合，制成定位对照溶液。
[0028]
表1半制备液相色谱洗脱梯度
[0029][0030][0031]
实施例2：n
6-(2-羟乙基)腺苷的确认
[0032]
(1)hplc进行纯度分析：
[0033]
精密称取实施例1得到的目的组分n
6-(2-羟乙基)腺苷5mg，加10ml甲醇，超声溶解完全，过0.45μm微孔滤膜，经hplc进行纯度分析，其纯度达到99.32％，hplc谱图见图2，标准品对照溶液分析色谱图见图1。采用lc-20at高效液相色谱仪，c18(4.6
×
150nm，5μm)色谱柱，梯度洗脱，洗脱梯度如表2所示，柱温25℃，检测波长260nm,进样量5μl。
[0034]
表2高效液相色谱洗脱梯度
[0035][0036]
(2)质谱分析：
[0037]
对目的组分n
6-(2-羟乙基)腺苷进行正离子电喷雾质谱(esi-ms)分析：质谱图见图5。电喷雾质谱[( )-esi-ms]给出准分子离子峰m/z为312.13[m h]

。
[0038]
(3)核磁共振分析：
[0039]
对目的组分n
6-(2-羟乙基)腺苷进行核磁共振分析：核磁氢谱测定结果：1h-nmr
(dmso-d6，400mhz)δ：8.21(1h，s，h-2)， 8.36(1h，s，h-8)，5.87(1h，d，j＝6.3hz，h-1’)，4.60(1h， dd，j＝11.3，6.0hz，h-2’)，4.14(1h，m，h-3’)，3.96(1h， dd，j＝6.6，3.5hz，h-4’)，3.67(1h，dt，j＝12.1，3.9hz，h
ꢀ‑5’
)，3.56(2h，m，h-1”)，3.56(2h，m，h-2”)，5.44(1h， d，j＝6.3hz，2
’‑
oh)，5.12(1h，d，j＝4.7hz，3
’‑
oh)， 5.42(1h，dd，j＝6.9，4.7hz，5
’‑
oh)，7.73(1h，brs，n6h)， 4.77(1h，brs，2
”‑
oh)。氢谱如图6所示。
[0040]
综上，本发明实施例1得到的白色结晶型粉末为n
6-(2-羟乙基) 腺苷，其纯度达99％以上。本发明简单可行，重复性好，能够提高天然产物的利用效益，为其今后在工业上的扩大化生产提供理论依据。
[0041]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。