一种红参多糖的提取和分离纯化方法与流程

1.本发明涉及一种红参多糖的提取和分离纯化方法。


背景技术：

2.红参(red gingseng)是人参(panax ginsengc.a.mey.)干燥根和根茎经蒸制后的一种炮制品，在中国、日本和韩国等国家广泛应用，历史悠久。红参的主要药效成分是皂苷和多糖，其中红参皂苷的研究报道较丰富，而红参多糖的结构和功能研究较少。与人参多糖相比，红参多糖一些活性如抗氧化活性、抗疲劳、抗肿瘤活性、免疫活性等提升明显。因此，红参多糖在中药、功能性食品、化妆品等方面具有广阔的应用前景。
3.当前对于红参多糖的工艺研究仍然比较粗放，多采用传统的水提醇沉方法获取粗多糖提取物，未进行进一步的分离和纯化。红参粗多糖提取物是由多种不同分子量多糖组成的混合物，且含有色素、蛋白质和小分子等杂质。当前对于红参多糖的结构研究几乎空白，多糖的结构显著影响着其活性。因此有必要进一步对其结构进行解析，为红参多糖的进一步开发利用提供依据。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于针对当前提取的红参多糖纯度低、结构不明确、理化性质不清晰的问题，提供一种可以实现工业生产、并可能转化为应用的红参多糖的提取纯化工艺。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
6.一种红参多糖的提取和分离纯化方法，包括：红参饮片脱脂后敲碎得到红参颗粒，再以水为提取溶剂回流提取，提取液经浓缩、醇沉得到红参粗多糖提取物，红参粗多糖提取物用蛋白酶-sevage联用法脱蛋白、上清液经过氧化氢脱色、透析、透析液冷冻干燥得到红参粗多糖，红参粗多糖经过deae-52柱层析得到红参混合多糖，红参混合多糖经透析除盐，最后再经sephadexg-100凝胶柱层析分离，冷冻干燥得到红参均一多糖rgp2-1。
7.具体的，一种红参多糖的提取和分离纯化方法，包括以下步骤：
8.步骤(1)、原料前处理：采用石油醚对红参饮片进行脱脂处理，除去石油醚，晾干，敲碎得到红参颗粒；
9.步骤(2)、回流提取：按照料液比1:10～1:40g:ml或kg:l，将红参颗粒和水混合，先浸泡0.5～2h，再回流提取，提取1～3次，每次提取完过滤，合并滤液，得到提取液；
10.步骤(3)、醇沉：提取液在65℃浓缩得到相对密度为1.10～1.20的浓缩液，调节浓缩液的乙醇浓度为60～90％，抽滤，得到红参粗多糖提取物；
11.步骤(4)、蛋白酶-sevage联用法脱蛋白：红参粗多糖提取物加纯化水溶解，加入蛋白酶，45～65℃水浴加热1～2h，100℃加热5～15min灭活；再按照红参粗多糖提取物溶液和sevage试剂的体积比(v/v)为1:3～1:5加入sevage试剂进行脱蛋白处理，离心，取上清液；
12.步骤(5)、过氧化氢法脱色：将上清液用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液调节ph 8～9，按照过氧化氢为上清液1％～10％(v/v)加入过氧化氢，脱色，得到红参多糖溶液；
13.步骤(6)、透析：将脱色得到的红参多糖溶液置于透析袋进行透析，透析液冷冻干燥得到红参粗多糖；
14.步骤(7)、离子交换层析：deae-52纤维素柱依次用2～4倍柱体积纯水、2～4倍柱体积0.1～0.5mol nacl溶液平衡，红参粗多糖上样后，依次用纯水，0.05～0.10、0.20～0.3、0.4～0.5、0.6～0.7、0.8～1.0mol/l nacl梯度洗脱，每个浓度洗脱1～2个柱体积，每个收集管收集0.03～0.05个柱体积洗脱液，采用苯酚-硫酸法监测各收集管的多糖含量，绘制洗脱曲线，合并峰位管，获得红参混合多糖；
15.步骤(8)、凝胶柱柱层析：红参混合多糖经透析脱盐后，上sephardex g-100凝胶层析柱，以纯水洗脱，每个收集管收集0.02～0.05个柱体积洗脱液，采用苯酚-硫酸法监测各收集管的多糖含量，绘制洗脱曲线，合并峰位管，洗脱液浓缩干燥得到红参均一多糖rgp2-1。
16.步骤(1)中，所述的脱脂处理为：按照红参饮片和石油醚的质量体积比为1:2～5g:ml或kg:l，往红参饮片中加入石油醚，静置12～24h进行脱脂处理。
17.所述的石油醚的沸程规格为60～90℃。
18.所述的红参颗粒的大小为0.1～0.2cm。
19.步骤(2)中，所述的回流提取的温度为80～100℃，每次提取的时间为0.5～4h。
20.步骤(3)中，采用95％乙醇调节浓缩液的乙醇浓度为60～90％，优选调节至醇浓度为80％。
21.所述的醇沉的时间为2～12h。醇沉的温度一般为室温。
22.步骤(4)中，所述的蛋白酶和红参粗多糖提取物的质量比(m/m)为1:2～1:10，优选为1:3～1:7，进一步优选为1:3～1:5，最优选为1:5。
23.所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶。
24.所述的sevage试剂为三氯甲烷和正丁醇的体积比(v/v)为4:1的混合溶剂。
25.步骤(5)中，过氧化氢的浓度为30％。脱色的温度为25～65℃，时间10～60min。
26.步骤(6)中，所述的透析袋的截留分子量为1000～35000da；透析时间为12～24h。
27.步骤(8)中，透析脱盐使用的透析袋的截留分子量为1000～35000da。
28.红参均一多糖rgp2-1为rg
‑ⅰ
型果胶，红参均一多糖rgp2-1主要由rha、gala、glc、gal组成，rha、gala、glc和gal的摩尔比为6.62:6.96:8.86:1.32，重均分子量为37610da；红参均一多糖rgp2-1的糖醛酸含量为22.98％；红参均一多糖rgp2-1以
→
1)-α-d-rhap-(2
→
，
→
1)-α-d-galpa-(4
→
为主链，以t-β-d-glcp
→
1)-α-d-glcp-(4
→
，t-α-d-galp为侧链；红参均一多糖rgp2-1的重复单元为：
[0029][0030]
本发明所述的红参均一多糖rgp2-1具有一定的支化度、具有较好的粒度分布、具有良好的热稳定性，且具有一些药用载体功能，因此，本发明的另一个目的是提供所述的红参均一多糖rgp2-1在作为药物载体的用途。
[0031]
本发明的有益效果：
[0032]
(1)、现有技术采用sevage法脱蛋白，蛋白脱除率一般为80％，但多糖损失率甚至
可高达40～50％；而本发明采用蛋白酶-sevage联用法脱蛋白，条件温和，脱蛋白效率高，多糖损失较少；使用过氧化氢脱色素效果较好，可以降低色素在后续柱纯化中对分离的影响。
[0033]
(2)、本发明对制备获取的红参多糖结构进行解析，明确多糖的理化性质和结构，对于进一步的活性研究有较大帮助。
[0034]
(3)、本发明首次对获取的红参多糖的外观形态等高级结构进行分析，有利于进一步开发其活性或其他要用功能。
附图说明
[0035]
图1为红参粗多糖的deae-52纤维素柱的洗脱曲线图。
[0036]
图2为rgp-2红参混合多糖的sephadex g-100凝胶层析柱的洗脱曲线。
[0037]
图3为红参均一多糖rgp2-1的分子量测定结果。
[0038]
图4为红参均一多糖rgp2-1单糖组成分析色谱图(a：混合单糖标准品，b：样品，1：甘露糖，2：核糖，3：鼠李糖，4：葡萄糖醛酸，5：半乳糖醛酸，6：n-乙酰-氨基葡萄糖，7：葡萄糖，8：n-乙酰-氨基半乳糖，9：半乳糖，10：木糖，11：阿拉伯糖，12：岩藻糖)。
[0039]
图5为红参均一多糖rgp2-1的tem图；其中，左图比例尺为200nm，右图的比例尺为500nm。
[0040]
图6为红参均一多糖rgp2-1的sem图。
[0041]
图7为红参均一多糖的刚果红实验。
[0042]
图8为红参均一多糖rgp2-1的dsc热图。
[0043]
图9为红参均一多糖rgp-1粒径测定分布图。
具体实施方式
[0044]
实施例1
[0045]
从红参中提取和分离纯化红参多糖的方法，包括以下步骤：
[0046]
步骤(1)、原料前处理：按照红参饮片和石油醚(60～90℃)的质量体积比为1:4(m/v,g:ml)，往红参饮片加入石油醚，静置12h进行脱脂处理，除去石油醚，将红参饮片晾干，敲碎至0.1～0.2cm大小的红参颗粒；
[0047]
步骤(2)、回流提取：将红参颗粒放入回流提取设备中，按照料液比(m/v,g:ml)1:15加入纯水，先浸泡2h，再加热回流提取，设置回流提取的温度95℃，每次提取2h，提取2次，每次提取完过滤，合并滤液，得到提取液；
[0048]
步骤(3)、醇沉：提取液在65℃浓缩得到相对密度为1.15的浓缩液，再加入95％乙醇至醇浓度为80％，静置12h，抽滤，得到红参粗多糖提取物；
[0049]
步骤(4)、脱蛋白：红参粗多糖提取物加纯化水溶解，按照木瓜蛋白酶(800u/mg)和红参粗多糖提取物的质量比(m/m)为1:5加入木瓜蛋白酶，65℃水浴加热1h，100℃加热灭活10min；然后按照红参粗多糖提取物溶液和sevage试剂(三氯甲烷:正丁醇＝4:1v/v)的体积比(v/v)为1:4加入sevage试剂，震荡，进行脱蛋白处理，离心，取上清液，即得脱蛋白的红参多糖溶液；
[0050]
步骤(5)、脱色：脱蛋白的红参多糖溶液用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(ph9.51)调节ph至8.50，再按照30％过氧化氢为多糖溶液的5％(v/v)加入过氧化氢，在温度45℃脱色
30min，得到脱色后的红参多糖溶液；
[0051]
步骤(6)、透析：将脱色后的红参多糖溶液置于透析袋(截留分子量为1000da)，在纯水中透析24h，透析液冷冻干燥，得到红参粗多糖；
[0052]
步骤(7)、离子交换层析：deae-52纤维素柱依次用3倍柱体积纯水、2倍柱体积0.5mol/lnacl溶液平衡，红参粗多糖上样后，依次用纯水，0.10、0.30、0.50、0.70、1.0mol/l nacl梯度洗脱，每个浓度洗脱1.5个柱体积，每个收集管收集0.03个柱体积洗脱液，采用苯酚-硫酸法监测各管的多糖含量，绘制洗脱曲线，如图1，合并50-82号收集管、浓缩得到rgp-2红参混合多糖；
[0053]
步骤(8)、透析除盐：rgp-2红参混合多糖用纯水溶解，置于透析袋(截留分子量为1000da)，在纯水中透析除盐，透析液冷冻干燥，得到除盐后的rgp-2红参混合多糖；
[0054]
步骤(8)、凝胶柱柱层析：除盐后的rgp-2红参混合多糖加入sephardex g-100凝胶层析柱，以纯水洗脱，洗脱2个柱体积，每个收集管收集0.02个柱体积，采用苯酚-硫酸法监测各收集管的多糖含量，绘制洗脱曲线，如图2，合并峰位管，洗脱液浓缩干燥，得到红参均一多糖rgp2-1。
[0055]
测定红参均一多糖的理化性质：采用hpgpc法测定多糖的纯度和分子量，采用苯酚硫酸法测定糖含量，采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，使用pmp柱前衍生-hplc法分析单糖组成。
[0056]
采用高效凝胶渗透色谱(hpgpc)法测定红参均一多糖的纯度及分子量：
[0057]
色谱柱：tsk-gel-4000wxl(7.8mm
×
300mm,10μm)；流动相：超纯水；柱温：35℃；检测器：waters 2414型示差折光检测器(rid)；检测器温度：30℃；流速：1ml/min；进样量：20μl。
[0058]
精密称取不同分子量(3kda～800kda)葡聚糖标准品10mg，置于10ml容量瓶，用纯水溶解定容至刻度，即得一系列不同分子量浓度为1mg/ml的葡聚糖标准溶液。分别取各样品注入凝胶渗透色谱(gpc)进行分析，采用gpc analysis软件计算各标准品的保留时间，建立标准曲线，得到线性回归方程，然后通过多糖的保留时间来计算其相对分子质量。
[0059]
精密称取红参均一多糖10mg，纯水溶解，用纯水定容于10ml容量瓶中，摇匀，即得样品溶液。取样品于上述条件中进样分析，记录保留时间，将保留时间代入上述回归方程，计算红参多糖的相对分子质量。
[0060]
用标准品的分子量(mw)的对数与其相应的保留时间(tr)绘制标准曲线，线性回归方程为lgmw＝-0.4332tr 13.45，r2＝0.9934。经过软件分析，获得红参多糖的重均分子量(mw)，多糖rgp2-1重均分子量为37610da(图3)。
[0061]
使用pmp柱前衍生-hplc法分析单糖组成：
[0062]
混合标准单糖衍生：精密称取各单糖对照品适量，加入纯水制备成每个单糖浓度为0.35mg/ml的混合对照品单糖溶液。精密吸取0.2ml混合单糖溶液于具塞试管中，加入0.1ml0.3mol/l naoh溶液和0.1ml 0.5mol/l的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(pmp)溶液，涡旋混合均匀，置于70℃水浴锅中反应1h。反应结束后，取出试管冷却至室温，加入0.15ml0.2mol/l hcl中和，除去溶剂，然后加入纯化水复溶，加入三氯甲烷萃取除去多余的pmp。分取水相层过0.45μm滤膜，备用。
[0063]
样品酸水解：精密称取红参均一多糖样品10mg于水解管中，加入1ml 4mol/l三氟
乙酸(tfa)溶液，密封，抽去空气，然后在110℃烘箱中水解8h。水解结束后，放冷至室温，加入甲醇，以除去多余的三氟乙酸，旋蒸发至干燥，然后加入0.1ml纯化水于水解物中，加入3mol/l的naoh调节至ph 7.0，离心，取上清液，备用。
[0064]
红参多糖样品衍生：精密吸取0.1ml红参均一多糖酸水解的上清液，按照混合标准单糖衍生的方法进行操作。
[0065]
色谱条件：色谱柱：agilent extend c
18
(4.6mm
×
250mm,5μm)；流动相：乙腈(a)-0.05mol/l kh2po4磷酸盐缓冲液(ph6.8,b)；柱温：30℃；流速：1ml/min；进样量：10μl；检测波长：250nm。
[0066]
表1.单糖分析洗脱程序
[0067][0068]
红参均一多糖rgp2-1的单糖组成分析色谱图见图4。红参均一多糖rgp2-1由rha、gala、glc、gal组成，rha、gala、glc和gal的摩尔比为6.62:6.96:8.86:1.32。
[0069]
表2.红参多糖理化性质
[0070][0071]
注：rha-鼠李糖，glc-葡萄糖，gal-半乳糖，gala-半乳糖醛酸。
[0072]
多糖连接方式分析：通过甲基化分析结合1d和2d nmr测出rgp2-1以
→
1)-α-d-rhap-(2
→
，
→
1)-α-d-galpa-(4
→
为主链，以t-β-d-glcp
→
1)-α-d-glcp-(4
→
，t-α-d-galp为侧链。
[0073]
rgp2-1的重复单元为：
[0074][0075]
实施例2
[0076]
取1g红参粗多糖提取物(同实施例1)，加10ml纯化水溶解，按照木瓜蛋白酶(同实施例1)和红参粗多糖提取物的质量比分别为1:3、1:5、1:7加入蛋白酶，65℃水浴加热1h，100℃加热灭活10min，然后加入按照多糖:sevage试剂(三氯甲烷:正丁醇-4:1)-1:4加入sevage试剂，震荡，进行脱蛋白处理，离心，取上清液，冷冻干燥后用考马斯亮蓝法在595nm测定吸光度。
[0077]
由表1可知，木瓜蛋白酶和红参粗多糖提取物的质量比为1:5时，蛋白脱除率为80.40％，多糖损失率为18.36％，继续增加蛋白酶用量，蛋白含量无明显下降，因此优选木
瓜蛋白酶和红参粗多糖提取物的质量比为1:5。
[0078]
表3.蛋白酶用量对蛋白脱除率的影响
[0079][0080]
实施例3
[0081]
取1g红参粗多糖提取物(同实施例1)，加10ml纯化水溶解，按照木瓜蛋白酶(同实施例1)和红参粗多糖提取物的质量比为1:5加入木瓜蛋白酶，65℃水浴分别加热0.5、1、2h，100℃加热灭活10min，然后按照红参粗多糖提取物溶液和sevage试剂(三氯甲烷:正丁醇＝4:1v/v)的体积比为1:4加入sevage试剂，震荡，进行脱蛋白处理，离心，取上清液，冷冻干燥后用考马斯亮蓝法在595nm测定吸光度。
[0082]
表4.蛋白酶用量对蛋白脱除率的影响
[0083][0084]
实施例4
[0085]
精密称取4mg红参均一多糖rgp2-1，置于10ml容量瓶中，加纯水溶解并定容至刻度，得到多糖样品溶液；量取0.5ml多糖样品溶液于具塞试管中，加纯水补至1.0ml，冰水浴中每个试管中均加入5ml0.5g/ml四硼酸钠-浓硫酸溶液，摇匀，沸水浴中加热10min，冰水浴冷却后再加入0.1ml1.5mg/ml间羟基联苯溶液，混匀后静置，显色10min后在525nm处测定吸光度，计算多糖的糖醛酸含量。
[0086]
表5.红参均一多糖糖醛酸测定结果
[0087][0088]
实施例5
[0089]
称取红参均一多糖rgp2-1约2mg，加适量纯水溶解配成浓度为2mg/ml，在45℃水浴保温15min后，立即滴在230目的铜网上，红外干燥后，再滴加一滴醋酸双氧铀溶液，染色10min，吸除染液。通过透射电子显微镜观察多糖形态。rgp2-1呈现球形结构，粒径在100～200nm(见图5)。
[0090]
实施例6
[0091]
精密称取2mg红参均一多糖rgp2-1，直接涂在铅条上，喷金1min后，在扫描电镜中
观察样品形态，红参多糖rgp2-1的sem图见图6，rgp2-1呈现不规则的形态，具有较多的空腔。
[0092]
实施例7
[0093]
刚果红试验用于测定红参均一多糖在碱性溶液中的螺旋-螺旋转变。称取5mg红参均一多糖rgp2-1，溶解在2ml纯水中，通过涡旋振荡与刚果红溶液(80μm)混合，然后向混合物中加入1mol/l naoh溶液，直至其最终浓度为0～0.5mol/lnaoh溶液。通过紫外光谱仪在400～800nm范围进行扫描，结果见图7，与对照组(不添加红参均一多糖，只加入对应浓度naoh溶液)相比，rgp2-1-刚果红复合物随着naoh浓度增大最大吸收波长显著变大，发生红移，在0.3mol/l时急剧下降，发生蓝移，说明在强碱条件下螺旋结构发生解聚。说明红参均一多糖rgp2-1可能具有三螺旋的结构。
[0094]
实施例8
[0095]
采用热重分析和差示扫描量热分析对多糖进行热稳定性分析。
[0096]
差示扫描量热(dsc)分析法一般用来测定样品放热或者吸热的速率与时间或者温度之间的关系。称取10mg红参均一多糖rgp2-1，置于样品盘中，使用n2作为载气，从室温以10℃/min的速率升到500℃，记录图谱。红参均一多糖rgp2-1的dsc图如图8所示，在从室温25～500℃是升温过程中，红参多糖rgp2-1的重量变化经历了三个阶段，首先起止温度为20～100℃，温度拐点在58.6℃，说明此时达到了rgp2-1的玻璃态温度，这段主要是因为失去了物理吸附的水分；最大的转折温度为366.8℃，这部分质量损失的主要原因是多糖分子发生剧烈的分解，c-o键和c-c键裂解为co2和h2o等成分，说明rg2-1具有良好的热稳定性。
[0097]
实施例9
[0098]
粒径和电位也是影响多糖功能的重要因素。通过马尔文粒径仪测定了红参均一多糖的粒径和电位。
[0099]
采用马尔文粒径仪nano zs激光粒度仪测定红参均一多糖的粒径，操作如下：分别精密称取红参均一多糖1mg，溶于2ml超纯水中，充分混匀，即得0.5mg/ml的样品溶液，过0.8μm水系滤膜，吸取1ml样品溶液置于粒径仪的粒径池中，在室温下平衡2min，测定样品的粒径和粒径分散指数。
[0100]
采用马尔文粒径仪nano zs激光粒度仪测定红参均一多糖的zeta-电位值(mv)，吸取1ml样品溶液(同粒径测定的样品溶液)置于粒径仪的电位池中，zeta值可以通过henry方程计算得到。
[0101]
结果如表6和图9所示。rgp2-1的粒径在100～200nm之间，说明可能具有一些药用载体功能，其电位均为负值，这可能与其带有大量的糖醛酸有关。
[0102]
表6.红参均一多糖的粒径、pdi和zeta电位值
[0103]