一种双位点荧光探针及其合成方法和应用与流程

1.本发明涉及荧光探针，具体属于一种双位点荧光探针的合成，以及该探针应用于生物样品中cys/hcy和so2的检测。


背景技术：

2.半胱氨酸(cys)和同型半胱氨酸(hcy)在维持生物体内氧化还原稳态方面起着至关重要的作用。通常，细胞硫醇水平的变化与许多疾病有关，例如白细胞减少、牛皮癣、肝损伤、癌症和艾滋病等。其中，半胱氨酸属于合成蛋白质的20种天然氨基酸之一，是一种含巯基的非必需氨基酸，正常细胞内半胱氨酸浓度是30-200μm。半胱氨酸的浓度异常会引起生长缓慢、神经性病变、肝损伤、嗜睡、水肿等疾病，与硫化氢结合的半胱氨酸在缺氧条件下可调节神经血管。同型半胱氨酸是氨基酸半胱氨酸的异种，是蛋氨酸代谢过程中的重要中间产物，血清中同型半胱氨酸的正常浓度大约是5-12μm，同型半胱氨酸是人体内含硫氨基酸的重要代谢中间体，可能是动脉粥样硬化等心血管疾病的独立危险因素。同型半胱氨酸的水平异常会导致心血管疾病、精神障碍、阿尔兹海默症、妊娠并发症等。二氧化硫是一种重要的气态信号分子，以hso
3-/so
32-动态平衡的形式存在于活细胞中，与心血管结构和功能的调节以及抗氧化作用密切相关。研究证实，二氧化硫具有调节血管、降压、抗炎等多种功能。因此，设计一种可以识别生物样品中cys/hcy和so2的荧光探针具有十分重要的意义。
3.目前国内外已经报道了几种仪器检测cys/hcy和so2的方法，例如高效液相色谱法(hplc)、毛细管电泳法、质谱法(ms)、电化学分析法和表面增强拉曼光谱法等，这些传统的仪器检测方法虽然可以有效的检测，但大多存在工程复杂，用时长，消费高，不能实时监测等缺点，不适合高通量的常规临床研究项目。荧光探针又称为荧光传感器，是由荧光信号和分子识别所构建的功能性有机分子。随着荧光探针的发展，荧光探针在生物学方面有着重要的应用，且用于生物或环境中一些重要的阳离子、阴离子、中性小分子的荧光探针得到了很好的发展，由于荧光探针本身具有快速响应、灵敏度高、选择性好、低毒性、实时成像等优点，使得荧光探针广泛地应用于检测。因此，开发用于生物活性硫检测的探针具有重大的意义，也具有广阔的应用前景。香豆素衍生物具有良好的溶解性、光稳定性和较大的斯托克斯位移，因此，它们通常用作荧光团。本发明设计了一种香豆素衍生物荧光探针，该荧光探针用于cys/hcy和so2的检测，反应灵敏且具有高度选择性。该荧光探针还可用于生物样品中cys/hcy和so2的检测。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一是提供一种双位点荧光探针及其制备方法。目的之二是提供探针的用途，即用于生物样品中cys/hcy和so2检测及成像。该探针应具有灵敏度高、选择性高、检出限低和光稳定性好等优点。
5.本发明提供的一种双位点荧光探针，其是7-(二乙氨基)-3-[3-(5-甲氧基-2-(7-硝基苯并恶二唑-4-氧基)-苯基)-3-氧代-1-丙烯基]香豆素，结构式为：
[0006][0007]
本发明提供的一种双位点荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
[0008]
(1)在反应容器中按摩尔比1:1-1.5加入7-(二乙氨基)-3-[3-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-氧代-1-丙烯基]香豆素和nbd-cl，加入二氯甲烷溶液溶解后，加入催化剂三乙胺，常温条件下搅拌10小时，溶液由红色变为黑色；
[0009]
(2)tlc跟踪反应，确定反应结束后，旋干二氯甲烷，用二氯甲烷:石油醚＝50-60:1进行柱层析纯化；用无水乙醇洗涤，干燥，即得到橘红色固体产物。
[0010]
进一步优选：步骤(1)中所述的7-(二乙氨基)-3-[3-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-氧代-1-丙烯基]香豆素和nbd-cl的按摩尔比1:1.5。步骤(2)中所述的二氯甲烷:石油醚＝60:1。
[0011]
其合成路线如下：
[0012][0013]
本发明提供的一种定量荧光检测cys/hcy和so2的方法，其步骤为：
[0014]
(1)用thf配制2mm的荧光探针储备液；
[0015]
(2)将2.0ml pbs缓冲液/dmso(8/2,v/v，ph 7.40)体系以及10.0μl荧光探针储备液加入荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上进行检测。探针本身无荧光，随着cys/hcy的加入，540nm处的荧光逐渐增强；随着so
32-的加入，590nm处的荧光逐渐增强；
[0016]
(3)以cys/hcy的浓度为横坐标，以540nm处的荧光强度为纵坐标绘制图，得到cys/hcy浓度的工作曲线，线性回归方程分别为：f＝6.8096*[cys] 165.8280、f＝12.1531*[hcy] 235.1302,cys/hcy浓度的单位为10-6
mol/l；线性相关系数分别为r2＝0.9997、r2＝0.9945，线性响应范围为0μm-150μm，检出限(lod)分别为0.25μm、0.14μm；
[0017]
以so
32-浓度为横坐标，以590nm处的荧光强度为纵坐标绘制图，得到so
32-浓度的工作曲线，线性回归方程为：f＝34.1188*[so
32-] 53.8964，so
32-浓度的单位为10-6
mol/l；线性相关系数为r2＝0.9945，线性响应范围为5μm-35μm，检出限(lod)为0.05μm。
[0018]
经实验验证，常见阴离子、阳离子和氨基酸均不干扰体系对cys/hcy和so2的测定。
[0019]
本发明的荧光探针通过结合荧光共聚焦显微镜成像技术，证明了可用于检测生物样品中如细胞以及斑马鱼内的cys/hcy和so2。
[0020]
与现有荧光探针相比，本发明合成的荧光探针具有以下优点：1、本发明的荧光探针合成步骤简单，成本低廉且光稳定性好。2、检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现。3、探针对cys/hcy和so2的响应具有选择性好、灵敏度高、检出限低等优点。4、该探针可通过双位点对cys/hcy和so2进行检测和区分。5、该探针可用于生物样品中如细胞以及斑马鱼内cys/hcy和so2的检测。
附图说明
[0021]
图1本发明荧光探针随cys/hcy和so2变化的荧光滴定图
[0022]
图2本发明荧光探针对cys/hcy和so2响应的工作曲线
[0023]
图3本发明荧光探针对常见阴离子、阳离子以及氨基酸的响应情况
[0024]
图4本发明荧光探针对人肝癌细胞(hepg2)的成像图
[0025]
图5本发明荧光探针对斑马鱼的成像图
具体实施方式
[0026]
实施例1荧光探针的制备
[0027]
(1)7-(二乙氨基)香豆素-3-甲醛的合成
[0028]
在冰浴下，将pocl3(0.40ml，4.2mmol)缓慢加入到0.40ml无水dmf中，撤下冰浴，50℃下搅拌45min，将7-(二乙氨基)香豆素(0.65g，3mmol)溶于3.00ml无水dmf中，两溶液混合，80℃下搅拌12h。反应完成后，把反应液加入到50.00ml冰水中，用氢氧化钠调节ph至7，抽滤，干燥，得到黄色固体。
[0029]
(2)7-(二乙氨基)-3-[3-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-氧代-1-丙烯基]香豆素的合成
[0030]
将7-(二乙氨基)香豆素-3-甲醛(0.12g，0.5mmol)和2-乙酰基-4-甲氧基苯酚(0.08g,0.5mmol)溶于10.00ml乙腈中，加入催化剂哌啶(0.10ml,1mmol),反应加热回流30h，反应结束后，冷却至室温，抽滤，干燥，得到红色固体。
[0031]
(3)7-(二乙氨基)-3-[3-(5-甲氧基-2-(7-硝基苯并恶二唑-4-氧基)-苯基)-3-氧代-1-丙烯基]香豆素的合成
[0032]
将7-(二乙氨基)-3-[3-(2-羟基-5-甲氧基苯基)-3-氧代-1-丙烯基]香豆素(0.04g，0.1mmol)和nbd-cl(0.03g，0.15mmol)溶于10.00ml二氯甲烷中，加入催化剂三乙胺20μl。常温下搅拌反应10h，通过tlc监测反应，反应结束后旋干二氯甲烷，用二氯甲烷：石油醚＝60：1进行柱层析纯化。用无水乙醇冲洗固体，干燥，得到橙红色固体。
[0033]
荧光探针用1h nmr表征，结果如下：
[0034]1h nmr(600mhz,cdcl3,δ/ppm):8.45(d,j＝8.4hz,1h),7.73(t,j＝8.4hz,2h),7.45(d,j＝15.6hz,1h),7.41(d,j＝3.0hz,1h),7.37(d,j＝8.4hz,1h),7.25(d,j＝9.0hz,1h),7.19(dd,j＝9.0,3.0hz,1h),6.80(s,1h),6.61(s,1h),6.54(d,j＝8.4hz,1h),3.95(s,3h),3.48(q,j＝6.9hz,4h),1.27(t,j＝6.9hz,6h)
[0035]
13
c nmr(150mhz,cdcl3,δ/ppm):189.90,159.81,158.23,156.76,154.82,152.17,145.75,144.97,144.16,144.04,140.94,133.73,133.38,130.69,130.18,124.73,123.40,119.23,115.14,114.07,109.69,108.85,107.87,97.03,55.94,45.09,12.42。
[0036]
实施例2荧光探针随cys/hcy和so2浓度变化的荧光发射光谱
[0037]
在2.0ml pbs缓冲液/dmso(8/2,v/v，ph 7.40)的体系中加入10.0μm荧光探针储备液进行cys/hcy和so2荧光滴定实验，在荧光分光光度仪上检测，随着cys/hcy浓度的增加，540nm处的荧光强度逐渐增强(图1a-b)。仪器参数：激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为5nm、10nm，电压为650v，荧光探针溶液的最大激发波长为λ
ex
＝450nm和最大发射波长为λ
em＝
540nm。以cys/hcy浓度为横坐标，以540nm处的荧光强度为纵坐标绘制图，得到cys/hcy浓度的工作曲线，线性回归方程分别为：f＝6.8096*[cys] 165.8280、f＝12.1531*[hcy] 235.1302,cys/hcy浓度的单位为10-6
mol/l；线性相关系数分别为r2＝0.9997、r2＝0.9945，线性响应范围为0μm-150μm，检出限(lod)分别为0.25μm、0.14μm(图2a-b)。随着so
32-浓度的增加，590nm处的荧光强度逐渐增强(图1c)。仪器参数：激发波长和发射波长的狭缝宽度分别为5nm、10nm，电压为650v，荧光探针溶液的最大激发波长为λ
ex
＝510nm和最大发射波长为λ
em
＝590nm。以so
32-浓度为横坐标，以590nm处的荧光强度为纵坐标绘制图，得到so
32-浓度的工作曲线，线性回归方程为：f＝34.1188*[so
32-] 53.8964,so
32-浓度的单位为10-6
mol/l；线性相关系数为r2＝0.9945，线性响应范围为5μm-35μm，检出限(lod)为0.05μm(图2c)。
[0038]
实施例3荧光探针对常见阴离子、阳离子以及氨基酸的响应情况
[0039]
在2.0ml pbs缓冲液/dmso(8/2,v/v，ph 7.40)的体系中加入10.0μm荧光探针储备液，再分别加入100μm小分子生物活性硫(h2s、gsh)、阴离子(no
3-、no
2-、co
32-、cl-、s2o
32-、ch3coo-)、阳离子(mg
2
、k

、na

、fe
2
、hg
2
、cu
2
、zn
2
、pb
2
、nh
4
、co
2
、cr
3
、mn
2
)以及氨基酸(thr、lea、tyr、glu、ser、asp、his、trp、arg、val、phe、pro、gly、lys、ile、ala、gln、asn、met),分别在λ
ex
＝450nm和λ
ex
＝510nm下，测其荧光光谱，绘制不同干扰物对应荧光强度的图。经试验验证，其它生物活性硫、阴离子、阳离子及氨基酸基本不引起荧光强度的变化。(图3)。
[0040]
实施例4荧光探针对人肝癌细胞(hepg2)的成像
[0041]
hepg2细胞培养在含有12％胎牛血清和1％抗生素的deme培养基中，置于5％的co2培养箱里，将细胞铺在平板上并使其粘附24小时，使用前把细胞分置于多个小培养皿中。绿色通道(540
±
30nm)；橙色通道(590
±
30nm)。细胞分为五组。第一组，将培养液抽出，并用ph 7.40的pbs缓冲液洗涤，然后加入含有10.0μl探针(2mm，用thf溶解)的2.0ml pbs(ph 7.40)缓冲溶液孵育，10min后抽出，再用ph 7.40的pbs缓冲液洗涤三次。第二组，将培养液抽出，并用ph 7.40的pbs缓冲液洗涤，先加入nem(200μm)孵育30min,再加入10.0μl探针孵育10min后抽出，再用ph 7.40的pbs缓冲液洗涤三次。剩下三组，先将培养液抽出，并用ph 7.40的pbs缓冲液洗涤，分别加入nem(200μm)孵育30min，再加入10.0μl探针孵育10min，最后分别加入含有20.0μl(1
×
10-2
m,用蒸馏水溶解)cys/hcy/so
32-的2.0ml ph 7.40的pbs缓冲溶液处理10min后抽出，再用ph 7.40的pbs缓冲液洗涤三次。最后，在五组细胞中加入2.0ml ph 7.40的pbs溶液在激光共聚焦显微镜下观察。第一组，绿色通道和橙色通道均有微弱的荧光(图4a)。第二组，绿色通道和橙色通道均无荧光(图4b)。第三组和第四组，绿色通道均出现较强的荧光(图4c-d)。第五组的橙色通道出现明显的荧光(图4e)。经以上结果
证明，该探针可用于细胞内cys/hcy和so2的成像。
[0042]
实施例5荧光探针对斑马鱼的成像
[0043]
将斑马鱼在28℃下，置于e3胚胎培养基(15mm nacl,0.5mm kcl，1mm mgso4,1mm cacl2,0.15mm kh2po4,0.05mm na2hpo4,0.7mm nahco3,5-10％亚甲基蓝，ph 7.50)中。绿色通道(540
±
30nm)；橙色通道(590
±
30nm)。将斑马鱼分为五组，分别置于五个ep管中。第一组，用20.0μl探针(2mm，用thf溶解)孵育10min。第二组，先用200μm nem预处理30min后，再用20.0μl探针孵育10min。剩下三组，先用200μm nem处理30min和20.0μl探针处理10min，并分别用40.0μl cys/hcy/so
32-(1
×
10-2
m，用蒸馏水溶解)处理10min。将斑马鱼从ep管中吸出，麻醉后，放入小培养皿中，并加入ph 7.40的pbs溶液，在激光共聚焦显微镜下观察。第一组，观察到绿色通道和橙色通道均有微弱的荧光(图5a)。第二组，两个通道均无荧光(图5b)。第三组和第四组，均在绿色通道看到较强的荧光(图5c-d)。第五组，在橙色通道看到较强的荧光(图5e)。以上现象都与细胞实验结果一致，说明该探针具有体内成像的能力，并且可以在体内对cys/hcy和so2进行检测和区分。