HNRNPA2B1在心脏成纤维细胞中的应用的制作方法

hnrnpa2b1在心脏成纤维细胞中的应用
技术领域
1.本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，涉及hnrnpa2b1在心脏成纤维细胞中的应用。


背景技术：

2.心肌间质纤维化是诱发心率失常、导致心衰的重要因素。目前临床缺乏有效的干预策略，是当前亟待解决的重大难题。心肌纤维化是心衰发生的重要病理基础，其主要表现为心肌成纤维细胞增多活化，胶原成分异常沉积，心肌弹性下降进而影响心输出量，最终导致心功能不全。如能及时抑制心肌过度纤维化，则有望改善心脏整体功能。抑制过度的心肌纤维化是防控心衰和心肌纤维化相关疾病的重要切入点。心肌间质纤维化的发生与多种因素有关。烟草主要有害成分尼古丁是心血管疾病的重要危险因素，但目前相关研究较少，其具体作用机制尚不明确。中国男性一直属于全球吸烟率最高的人群之一。2020 年中国成人烟草调查显示，中国现在的吸烟人数比五年前增长了1500 万，已达3.16亿（人均15.2支/天）。吸烟仍是导致心血管事件重要元凶。发现调控心肌纤维化的药物及特异分子及信号通路，对于阐明心肌纤维化发生发展的内在机制，寻找防控心衰和心肌纤维化相关疾病提供潜在新靶点，具有十分重要的理论和临床意义。
3.tgf-β途径是调节细胞生长、分化和形态发生的主要信号途径之一，是许多组织纤维化中细胞外基质沉积的中枢调节因子，它能够激活成纤维细胞增殖并促进细胞外基质的产生，在心肌纤维化的过程中发挥重要作用。tfg-β/mapk信号通路能够促进细胞增殖和转化，是诱导心肌纤维化的一个重要的通路。
4.hnrnpa2b1通过交替剪接编码2个主要蛋白hnrnpa2和hnrnpb1。参与新生mrna的包装，选择性剪接以及细胞质rna的运输，翻译和稳定化。hnrnpa2和hnrnpb1也在端粒维持，细胞增殖和分化以及葡萄糖转运中起作用。最新发现，hnrnpa2b1激活mapk/erk信号通路来促进胰腺癌的转移，并且在皮肤纤维化疾病的病人血清中发现抗hnrnpa2b1血清抗体增高。其亚家族hnrnpa1、k和e可以促进心肌成纤维细胞中胶原i和胶原iii的表达，tgf-β可以诱导hnrnpa1、k和e的表达，促进心肌纤维化。
5.微小核糖核酸(microrna，mirna)是一类内源性非编码单链小分子rna，长度约为22个核苷酸，可通过与信使核糖核酸(messengerribonucleicacid，mrna)的3
′
非翻译区(untranslatedregion，utr)不同程度的互补配对，诱导靶基因mrna降解或抑制翻译，从而在转录后水平调控靶基因的表达。


技术实现要素：

6.为了研究调控心肌纤维化的作用靶点及特异分子及信号通路，阐明心肌纤维化发生发展的内在机制，本发明提出hnrnpa2b1作为靶点在心肌成纤维细胞中的应用。
7.为了达到上述目的，本发明是采用下述的技术方案实现的：本发明运用darts实验、wb实验，考马斯亮蓝染色、质谱分析，以及后期实验进一步
的分析证实， hnrnpa2b1在尼古丁诱导心肌纤维化的过程中发挥作用。hnrnpa2b1核酸序列为核苷酸序列表中的seq id no.1。
8.本发明的另一目的在于提供抑制hnrnpa2b1基因的小干扰rna片段sirna。
9.sirna序列如下：si-r-hnrnpa2b1_001 ：5
’‑
ggatttggctttgtaactt-3’,si-r-hnrnpa2b1_002： 5
’‑
ggaagatactgaggagcat-3’，si-r-hnrnpa2b1_003 ：5
’‑
ggaaattatggaagtggaa-3’。
10.本发明通过qrt-pcr与rip实验验证，hnrnpa2b1与mir-125b-5p结合并调控其表达，mir-125b-5p序列为：5'-ucccugagacccuaacuuguga-3'。hnrnpa2b1增加了mir-125b-5p表达并加剧了心肌成纤维细胞的增殖、分化及胶原蛋白的积累。
11.所用到的qrt-pcr引物序列为：β-actin：正向5
’‑
cgttgacatccgtaaagacc-3’，反向5
’‑
tagagccaccaatccacaca-3’；col1：正向5
’‑
ccagcggtggttatgacttca-3’，反向5
’‑
tgctggctcaggctcttga-3’；col3：正向5
’‑
ggtcactttcactggttgacga-3’，反向5
’‑
ttgaatatcaaacacgcaaggc-3’；a-sma：正向5
’‑
catccgaccttgctaacgga-3’，反向5
’‑
gtccagagcgacatagcaca-3’；fn：正向5
’‑
ggatcccctcccagagaagt-3’，反向5
’‑
gggtgtggaagggtaaccag-3’；tgfb1：正向5
’‑
gccgcccgaagggtagat-3’，反向5
’‑
gaggcaagactggtgtctcc-3’；tgfbr1：正向5
’‑
tgcctgcttctcatcgtgtt-3’，反向5
’‑
tgcttttctgtagttgggagttc-3’；hnrnpa2b1：正向5
’‑
cagactgtgtggttatgcgg-3’，反向5
’‑
tcaaccaccctgccatcaat-3’。
12.与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：本发明探究了尼古丁诱导心肌纤维化的关键分子和信号通路，对于阐明心肌纤维化发生的内在机制意义重大。本发明提出了hnrnpa2b1对心脏成纤维细胞中的作用，并且以hnrnpa2b1为研究对象，合成hnrnpa2b1干扰小片段sirna，转染心脏成纤维细胞，发现
hnrnpa2b1促进心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成。还通过控制其表达的mir-125b-5p在心脏成纤维细胞中的功能来进行研究；本发明验证干扰hnrnpa2b1后，能够抑制mir-125b-5p的表达，达到抗纤维化的目的。表明mir-125b-5p在心脏成纤维细胞中是hnrnpa2b1的一个重要功能靶标，hnrnpa2b1可通过mir-125b-5p来调节成纤维细胞的功能。对于研究尼古丁诱导的心肌纤维化机制具有很好的应用价值。
附图说明
13.图1是尼古丁诱导的细胞增殖情况。
14.图2是干扰基因敲低hnrnpa2b1基因情况。
15.图3为darts和cetsa实验结果。
16.图4为加入尼古丁后心脏成纤维细胞的活化及相关信号通路的情况。
17.图5为rip实验结果。snp70为阳性对照组。
18.其中，图2中ctr为小干扰rna的阴性对照，s1为si-r-hnrnpa2b1_001 ，s2为si-r-hnrnpa2b1_002，s3为si-r-hnrnpa2b1_003。
具体实施方式
19.为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本技术的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
20.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明并不限于下面公开说明书的具体实施例的限制。
21.实施例11.前处理。
22.实验对象：出生2-3d的wistar大鼠的乳鼠的心脏成纤维细胞，由北京维通利华公司提供，所用培养基为美国gibco的dmem高糖培养基。
23.(1)实验前准备：超净台紫外灭菌30min。
24.(2)取乳鼠的心脏成纤维细胞，ii型胶原酶进行消化，在培养瓶中进行差速贴壁除去非成纤维细胞。
25.(3)弃上清，重新加入培养基，37℃下，5％co2培养箱中静置培养24h。
26.2.心脏成纤维细胞的接种和转染。
27.(1)显微镜观察心脏成纤维细胞汇合度达到90％时，弃培养基，用预热的含1％双抗(青霉素和链霉素)的pbs清洗细胞两次。
28.(2)预热的0.25％胰酶加入培养瓶，放入培养箱中静置2min，显微镜下观察到细胞大部分飘起时，加入终止液(10％fbs的dmem高糖培养基)终止消化。
29.(3)用枪头轻轻吹打细胞，制成细胞悬液，转移至15 ml离心管，800 rpm离心5min。
30.(4)适量完全培养基重悬细胞沉淀，细胞计数后，均匀分布到每一个孔中，放入培养箱中继续培养。
31.(5)24h左右观察细胞形态及汇合度，细胞形态良好且汇合度达到70％～90％时，
可以用于转染。取第3代传代的心脏成纤维细胞进行转染，转染步骤参照invitrogen公司的 2000试剂盒说明书进行。
32.(6)转染后，细胞在37℃，5％ co2培养箱中继续培养。
33.(7)转染48h后收集细胞。
34.3.心脏成纤维细胞增殖实验。
35.参照广州市锐博生物科技有限公司的cell-lighttm edu apollo567 in vitro kit使用说明进行，具体步骤如下(96孔板)。
36.用细胞培养基按1000：1的比例稀释edu溶液，得到浓度为50μm的edu培养基。
37.每孔加入100μl浓度为50μm的edu培养基孵育2h，弃培养基。
38.pbs清洗细胞1～2次，每次5min。
39.每孔加入50μl细胞固定液(4％多聚甲醛的pbs)室温孵育30分钟，弃固定液。
40.每孔加入100μl的pbs，脱色摇床清洗5min，弃pbs。
41.每孔加入100μl的1
×
apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液。
42.加入100μl渗透剂(含0.3% triton x-100 的pbs)脱色摇床清洗2～3次，每次5min，弃渗透剂。
43.用去离子水按100：1的比例稀释得到1
×
hoechst3342反应液，避光保存。
44.每孔加入100μl的1
×
hoechst3342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液。
45.每孔加入150μl的pbs清洗1～3次。
46.每孔加入100μl的pbs保存待用。
47.采用1-1000 nm范围内一系列不同浓度的尼古丁处理心脏成纤维细胞，用荧光显微镜进行照片采集和增殖率分析。结果如图1所示，从图中可以看出，尼古丁加入后能够显著诱导心肌成纤维细胞的增殖，且细胞增殖数量随着尼古丁浓度的不同而变化。
48.实施例2qrt-pcr实验。
49.(1)冷pbs清洗贴壁细胞2～3次，倾斜细胞培养皿，吸净pbs，加入1 ml的trizol，静置5 min，直至镜下观察到细胞全部裂解后，用枪头吹打均匀并转移到1.5 ml的rnase-free 离心管中。
50.(2)每管加入200μl预冷液(trizol组织液:氯仿为5：1)，剧烈震荡15～30 s，冰上放置5 min后，12000 rpm，4 ℃，离心15 min。液体分三层：上层为无色的rna，中层为含有酚-氯仿的白色水相，下层为浅红色。小心吸取上层无色液相(避免触及中间相)。将上层液相(约300μl)移入新的1.5 ml 离心管中，加入等量异丙醇溶液，轻轻上下颠倒摇匀10次，冰上静置10 min。然后在12000 rpm，4 ℃，离心10 min。
51.(3)弃上清、留沉淀，沿管壁加入预冷的1 ml，75％乙醇-depc以洗涤rna，然后在12000 rpm，4 ℃下，离心5 min后去上清。
52.(4)将液体吸干，室温自然干燥5～10min，同时避免rna沉淀干燥过度。
53.(5)根据沉淀量，加入20μl的depc水以溶解rna沉淀。分光光度计测定rna浓度和纯度。
54.qrt-pcr采用thermo公司的sybr green qrt-pcr mastermix(2x)，rox solution provided mix。以2
‑△△
ct
法计算mrna与mirna的相对表达量。
55.所用到的qrt-pcr引物为如下：β-actin：正向5
’‑
cgttgacatccgtaaagacc-3’，反向5
’‑
tagagccaccaatccacaca-3’；col1：正向5
’‑
ccagcggtggttatgacttca-3’，反向5
’‑
tgctggctcaggctcttga-3’；col3：正向5
’‑
ggtcactttcactggttgacga-3’，反向5
’‑
ttgaatatcaaacacgcaaggc-3’；a-sma：正向5
’‑
catccgaccttgctaacgga-3’，反向5
’‑
gtccagagcgacatagcaca-3’；fn：正向5
’‑
ggatcccctcccagagaagt-3’，反向5
’‑
gggtgtggaagggtaaccag-3’；tgfb1：正向5
’‑
gccgcccgaagggtagat-3’，反向5
’‑
gaggcaagactggtgtctcc-3’；tgfbr1：正向5
’‑
tgcctgcttctcatcgtgtt-3’，反向5
’‑
tgcttttctgtagttgggagttc-3’；hnrnpa2b1：正向5
’‑
cagactgtgtggttatgcgg-3’，反向5
’‑
tcaaccaccctgccatcaat-3’。
56.结果如图2所示，在利用不同的小干扰sirna片段转染心脏成纤维细胞后(转染浓度为50 nm)，qrt-pcr检测对于hnrnpa2b1的敲低效率，结果显示片段si-r-hnrnpa2b1_001(s1)、si-r-hnrnpa2b1_002(s2)、si-r-hnrnpa2b1_003(s3)均能够显著敲低hnrnpa2b1的表达，其中si-r-hnrnpa2b1_001的敲低效率最高。ctr(scramble sirna)为sirna的阴性对照，小干扰sirna片段序列如下：si-r-hnrnpa2b1_001：5
’‑
ggatttggctttgtaactt-3’，si-r-hnrnpa2b1_002：5
ꢀ’‑
ggaagatactgaggagcat-3’，si-r-hnrnpa2b1_003：5
’‑
ggaaattatggaagtggaa-3’。
57.上述小干扰sirna片段由广州市锐博生物科技有限公司合成。
58.实施例3药物亲和反应的靶点稳定性实验（简称darts)。
59.具体操作步骤如下：
（1）m-per裂解液的配制（1ml）。
60.将10μl蛋白酶抑制剂cocktail，200mm磷酸酯酶抑制剂10μl，1 m氟化钠50μl，100mmβ-甘油磷酸二钠100μl，50mm 焦磷酸钠100μl，以及730μl的m-per混合得到m-per裂解液。
61.（2）预冷pbs洗涤细胞2次，吸净pbs，每大皿加入500μl的m-per裂解液（可根据细胞密度2/3皿合一），用细胞刮刮取细胞移至1.5 ml 离心管，4℃旋转摇床孵育30 min。
62.（3）13000 rpm 4 ℃离心10 min，取上清，测浓度。-80℃保存或者接着做下一步。
63.（4）两个1.5ml离心管各自分装225μl蛋白，其中一管加入2μldmso，另一管加入2μl尼古丁，室温避光旋转摇床孵育1-1.5h。
64.（5）tnc缓冲液的配制：将1 ml的10
×
tnc，1 m tris-hcl 缓冲液（ph 8.0）500μl，5m 氯化钠100μl，1 m氯化钙100μl，以及300μl超纯水混合得到tnc。使用时用超纯水将tnc稀释10倍。
65.（6）将每管蛋白分为4管（共8管），每管50μl。准备四个空离心管，配制不同浓度的蛋白酶：按照蛋白酶/蛋白=0、1:800、1:400、1:200的比例加入蛋白酶。将稀释好的蛋白酶分别加入相对应的蛋白管内(分组为-0、 0、-1:800、 1:800、-1:400、 1:400、-1:200、 1:200，-为对照组、 为药物组，跑胶加样顺序也按此)，每管加入2μl；其中-0、 0组加入2μl 1
×
tnc室温孵育15 min，每管加入1μl 蛋白酶抑制剂cocktail，冰上孵育5 min终止消化。
66.（7）按蛋白：上样缓冲液等于4:1的比例加入上样缓冲液，水浴锅煮沸10 min后-80度冰箱保存。
67.（8）按上述顺序加样，电泳后不转膜直接考马斯蓝染色1 h，更换脱色液洗脱至出现清晰条带（一般24 h），选送质谱分析，后期再根据上述步骤进行转膜，显色，进行验证。
68.其中，考马斯亮蓝染液由0.05 g考马斯亮蓝r-250，91ml的50%甲醇水溶液，9ml冰乙酸组成。
69.脱色液配制由10ml冰乙酸，80ml蒸馏水，10ml甲醇混合得到。
70.结果如图3a所示，通过图3a可知，尼古丁能与hnrnpa2b1结合进而保护其蛋白不被降解，提示hnrnpa2b1是尼古丁潜在的结合靶点。
71.实施例4cetsa实验。
72.实验步骤如下：1.获得目标蛋白的熔融曲线。
73.（1）细胞扩增至2
×
106个，四条熔融曲线需要1.2
×
108个细胞。
74.（2）细胞在合适的细胞培养培养皿中进行复合培养(对照组加水作为溶剂对照，实验组加尼古丁)，加热步骤在细胞分离后进行。
75.（3）将培养皿从培养箱中取出置于冰上，pbs洗3遍，将对照组和实验组分别用细胞刮刮下，置于1.5ml的离心管中，放于冰上。
76.（4）计算细胞数量，评估细胞活性。
77.（5）4℃离心机中1000 rpm离心5 min。
78.（6）15 ml pbs重悬细胞，再次离心并弃上清（可重复此步骤）。
79.（7）将细胞悬液分配到10个0.2 ml的qrt-pcr小管中，每管有100μl的细胞悬液，用
指定温度标记每个管子，40个管分成10条，每条4个，室温放置。
80.（8）使用96孔板热循环仪在前六个温度下（40-67℃）加热管子3 min，立即取出管子，室温孵育3 min，置于冰上，当所有小管加热完毕时，立即按照步骤12对样品进行冷冻。
81.（9）加热处理后的细胞悬液在液氮中快速冷冻（或-80 ℃冰箱中进行冷冻保存），样品置于-80 ℃保存一夜。
82.（10）使用液氮（-80 ℃冰箱）和设置为25 ℃的热循环器（或37 ℃干热箱）将细胞冷冻-解冻两次，确保管子之间温度均匀，每次解冻后用震荡器短暂震荡，裂解产物置于冰上。
83.（11）最后一次解冻后，短暂震荡管子，4 ℃下，12000 rpm离心10 min，使细胞碎片和聚集的蛋白质一起沉淀，小心点取下管子，置于冰上。
84.（12）取上清90μl于新的试管，加入上样缓冲液煮蛋白10 min。
85.（13）每孔上样20μl，wb检测靶蛋白。
86.（14）根据不同温度下，蛋白灰度值进行测定，并绘制熔融曲线。
87.2.获得固定温度下的剂量-反应曲线。
88.本步的温度通过上一步的分析得出，以50 ℃为例进行说明。
89.（1）将细胞均匀的种植于六孔板中，根据药物的不同浓度进行处理。
90.（2）将六孔板中从培养箱中拿出至于冰上，pbs洗3遍，将不同浓度的处理组分别用细胞刮刮下，置于1.5 ml的离心管中，放置于冰上。
91.（3）计算细胞数量，评估细胞活性。
92.（4）4℃离心机中1000rpm离心5 min。
93.（5）再次离心并弃上清。
94.（6）配制含有10%的细胞裂解液，分别将100μl的细胞裂解液，加入到不同浓度的离心管中，吹打使细胞重悬，然后分别移到对应的200μl的离心管中，标记不同的浓度。
95.（7）将200μl的离心管置于96孔板热循环仪，在50℃的温度下，加热管子3 min，立即取出管子，置于冰上，并立即放置于液氮或-80度冰箱中。
96.（8）使用液氮（-80℃冰箱）和设置为25℃的热循环器（或37℃干热箱）将细胞冷冻-解冻两次，确保管子之间温度均匀，每次解冻后用震荡器短暂震荡，裂解产物置于冰上。
97.（9）最后一次解冻后，短暂震荡管子，4℃ 12000g离心10 min，使细胞碎片和聚集的蛋白质一起沉淀，小心点取下管子，置于冰上。
98.（10）取上清90μl或80μl于新的试管（避免触及管壁和沉淀），bca试剂盒进行蛋白浓度的测定，加入上样缓冲液煮蛋白10 min。
99.（11）每孔上样20μl，wb检测靶蛋白。
100.根据不同浓度下，蛋白灰度值进行测定，并绘制熔融曲线。
101.结果如图3b所示，加入尼古丁与不加尼古丁组相比，hnrnpa2b1的热稳定性增加，提示尼古丁可能通过与hnrnpa2b1直接结合增加其热稳定性。
102.实施例5westernblot实验。
103.（1）心脏成纤维细胞总蛋白的提取。
104.细胞转染后48h，用pbs清洗细胞3次，6孔板细胞每孔加入80μl蛋白裂解液进行蛋
125b-5p类似物能够显著诱导心肌纤维化标志蛋白的表达，而加入抑制剂结果相反。
124.以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。