一种可减轻烟杆预处理产物抑制影响的乙醇制备方法与流程

1.本发明涉及木质素降解技术领域，特别涉及一种减轻烟杆木质素预处理产物抑制乙醇发酵影响、将废弃烟杆中的木质纤维素低成本、无污染转化为生物乙醇的方法。


背景技术：

2.随着人类社会的进步，作为人类赖以生存和发展的物质基础，能源的需求量也日益剧增。目前世界上的能源供应大部分都是化石能源，但是由于其不可再生、储量有限和环境污染制约着人类社会的进步。能源和环境危机将生物质能源推向了研究热潮，希望其可以替代化石能源，支撑人类社会对能源的需求。生物质能源以可再生的木质纤维素为原料，利用微生物或者其他手段转化为可以直接利用的可再生能源，由于可再生性和环境友好性被人们寄予厚望，受到众多研究者的重视。
3.由于木质纤维素通常是由纤维素、半纤维素和木质素组成的紧密高分子聚合物，纤维素嵌入木质素和半纤维素相互结合的紧密复合结构中，并被一层半纤维素覆盖，使得原料预处理成为木质纤维素生物质生产醇类物质或糖类物质的主要工艺挑战。预处理技术的应用可以有效破坏木质纤维素的结构，提高底物与酶的可及性，进而提供酶解效率。到目前为止，不同的预处理方法已经被开发出来，如酸预处理、碱预处理、生物预处理、离子液体预处理、蒸汽爆破等，但是对于工业应用而言，酸预处理是成本最低，也最好工业化规模扩大的一种预处理技术。但是由于酸处理过程中会产生大量的糠醛、5-羟甲基糠醛、香草醛、丁香醛等多种抑制剂混合物，制约着后续生物发酵的开展实施。
4.烟草作为中国重要的经济作物，种植面积及产量均居世界首位，在烟草的生产过程中，由于产品是烟叶，烟杆作为一种副产物往往被丢弃或者焚烧，不仅造成资源的浪费，又造成环境的污染问题。烟杆汇总纤维素的含量接近50％，是一种良好的生物质材料，但同样存在着酸处理过程中会生成抑制剂混合物制约后续发酵得到乙醇的缺陷。


技术实现要素：

5.为了解决烟杆酸处理过程会生成发酵抑制剂的技术问题，本发明提供一种减轻烟杆木质素预处理产物抑制乙醇发酵影响的方法。
6.本发明的技术方案如下：
7.一种可减轻烟杆预处理产物抑制影响的乙醇制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.(1)将废弃烟杆洗净晒干后用粉碎机进行粉碎，并过筛；
9.(2)用稀硫酸溶液处理粉碎后的烟杆；
10.(3)酸预处理后进行固液分离，固体部分不水洗进行烘干，打成粉末过筛；
11.(4)将预处理后的烟杆粉末作为碳源配置发酵培养基，调节ph值至5.4-5.6；
12.(5)发酵培养基添加纤维素酶，添加硼氢化钠，并接种4-6％的酵母种子液，置于28-32℃摇床中进行乙醇发酵，发酵周期为40-54h。
13.优选的，步骤(1)和(3)中所述筛为100目。
14.优选的，步骤(2)中使用1％硫酸溶液悬浮处理，温度为118-125℃，时间为25-35min。
15.优选的，步骤(3)中用真空泵进行固液分离，置于45-55℃进行烘干。
16.优选的，步骤(4)中烟杆粉末的质量浓度为2-10％，还包括硫酸铵1.5-2.5g/l，酵母粉4-6g/l，磷酸二氢钾4-6g/l，七水硫酸镁0.4-0.6g/l。
17.进一步优选的，步骤(4)中所述发酵培养基中调节ph值至5.5，置于115℃灭菌30min.
18.优选的，步骤(5)所述纤维素酶的添加量为15fpu/g底物。
19.优选的，步骤(5)添加的所述硼氢化钠的浓度为20-60mm。
20.优选的，步骤(5)发酵周期为48h。
21.本发明的有益技术效果如下：
22.本发明提出一种减轻烟杆木质素的预处理产物抑制影响的乙醇制备方法，能够减轻烟杆木质素预处理产物抑制乙醇发酵的影响，以废弃烟杆为材料，仅仅通过酸预处理，通过添加硼氢化钠，不需要洗涤过程，预处理后的底物可以直接进行同步糖化发酵，减轻预处理产物的抑制影响，提高生物乙醇的产量。该过程使用原料成本低，不需要额外的水洗过程，具有绿色环保的特色，很大程度节省了生产成本，避免大量污水的产生，同时可以解决原料的环境污染问题，实现烟杆变废为宝，具有极高的可行性，是一种高效环境友好型的生物乙醇发酵工艺。具体的：
23.(1)本发明发酵使用的原料为烟叶生产后的废弃烟杆，具有较高的总纤维素含量，仅仅需要低强度的稀酸预处理即可被微生物利用，预处理底物不需要大量水洗过程，即可进行生物乙醇发酵，显著的降低了生产成本以及降低废弃烟杆所造成的环境污染问题，具有极其广阔的应用推广前景。
24.(2)本发明通过添加硼氢化钠可以显著提高乙醇产量，添加浓度不高，效果显著，添加过程与发酵过程一致，发酵工艺简单，显著降低生产成本。
25.本发明在酸预处理的基础上，通过添加硼氢化钠可以不用水洗，有效提高酵母的乙醇产量，提高乙醇的发酵效率和底物转化效率，为高浓度生物乙醇发酵提供技术支持。实现高效、低成本、绿色利用废弃烟杆材料，具有良好的应用前景。
附图说明
26.图1对比例中不同烟杆底物浓度的乙醇发酵产量；
27.图2为实施例1硼氢化钠对乙醇发酵产量的影响；
28.图3为实施例2-5不同浓度硼氢化钠对乙醇发酵产量的影响。
具体实施方式
29.为了便于理解本技术的技术方案，下面将通过具体实施例结合附图详细说明。
30.对比例
31.(1)废弃烟草秸秆用自来水洗涤干净之后用粉碎机粉碎成粉末，过100目筛。
32.(2)将浓硫酸溶于水中得到1％稀硫酸溶液，把粉碎后的烟杆粉末加入1％稀硫酸
溶液中，固液比为10％，放入灭菌锅中121℃处理30min取出。
33.(3)预处理后的烟杆粉末用真空抽滤泵将滤渣滤出，分为两部分，其中一部分用蒸馏水反复冲洗，冲洗至测量滤液ph为中性，将滤渣至于55℃烘箱，烘干至恒重后用打粉机粉碎成末，过100目筛得到水洗烟杆粉末；另外一部分直接置于55℃烘箱，烘干至恒重后用打粉机粉碎成末，过100目筛得到未水洗烟杆粉末。
34.(4)将预处理后的固态烟杆粉末(水洗涤和未洗涤烟杆)分别作为碳源配置发酵培养基，烟杆底物浓度为2％、5％和8％，其余成分为硫酸铵2g/l，酵母粉5g/l，磷酸二氢钾5g/l，七水硫酸镁0.5g/l，初始ph值调节为5.5，发酵容器为25ml西林瓶。
35.(5-1)配置种子培养基：液体种子培养基的成份为木糖20g/l、酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，固体种子液培养基再添加2％琼脂；
36.(5-2)将-80℃保存的酵母划线接种至培养皿内，再挑取单菌落接种至试管斜面上，30℃培养48h。将活化的酵母接种置于250ml的三角瓶中，含有25ml液体种子培养基。置于30℃摇床中，在180rpm下振荡培养14-16h；
37.(5-3)用注射器用按15fpu/底物的标准将纤维素酶液注入西林瓶；
38.(5-4)用注射器按5％的量接种酵母种子液，然后置于30℃、150rpm摇床中进行发酵，周期为48h。
39.发酵结束后测定培养基中的乙醇浓度，如图1所示，在2％、5％和8％的浓度下，其中水洗烟杆的乙醇产量分别为2.86g/l、7.03g/l和10.46g/l，而未洗涤烟杆的乙醇产量分别为2.02g/l、4.34g/l和6.28g/l，表明水洗过程能够清洗掉抑制物，提高乙醇的产量。
40.实施例1：硼氢化钠对烟杆乙醇发酵的影响
41.(1)废弃烟草秸秆用自来水洗涤干净之后用粉碎机粉碎成粉末，过100目筛。
42.(2)将浓硫酸溶于水中得到1％稀硫酸溶液，把粉碎后的烟杆粉末加入1％稀硫酸溶液中，固液比为10％，放入灭菌锅中121℃处理30min取出。
43.(3)预处理后的烟杆粉末用真空抽滤泵将滤渣滤出，不用水洗，直接置于55℃烘箱，烘干至恒重后用打粉机粉碎成末，过100目筛得到未水洗烟杆粉末。
44.(4)将预处理后的固态烟杆粉末作为碳源配置发酵培养基，烟杆底物浓度为5％，其余成分为硫酸铵2g/l，酵母粉5g/l，磷酸二氢钾5g/l，七水硫酸镁0.5g/l，初始ph值调节为5.5，发酵容器为25ml西林瓶。
45.(5-1)配置种子培养基：液体种子培养基的成份为木糖20g/l、酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，固体种子液培养基再添加2％琼脂。
46.(5-2)将-80℃保存的酵母划线接种至培养皿内，再挑取单菌落接种至试管斜面上，30℃培养48h。将活化的酵母接种置于250ml的三角瓶中，含有25ml液体种子培养基。置于30℃摇床中，在180rpm下振荡培养14-16h。
47.(5-3)用注射器用按15fpu/底物的标准将纤维素酶液注入西林瓶，添加终浓度为20mm的硼氢化钠。
48.(5-4)用注射器按5％的量接种酵母种子液，然后置于30℃、150rpm摇床中进行发酵，周期为48h。发酵结束后测定培养基中的乙醇浓度，如图2所示，未添加硼氢化钠的乙醇产量产量为4.34g/l，而添加20mm硼氢化钠后乙醇产量提高至4.70g/l，乙醇产量提高了8.3％。说明在未洗涤的情况下，添加硼氢化钠能够提升乙醇产量。
49.实施例2-5：不同浓度硼氢化钠对烟杆乙醇发酵的影响
50.(1)废弃烟草秸秆用自来水洗涤干净之后用粉碎机粉碎成粉末，过100目筛。
51.(2)将浓硫酸溶于水中得到1％稀硫酸溶液，把粉碎后的烟杆粉末加入1％稀硫酸溶液中，固液比为10％，放入灭菌锅中121℃处理30min取出。
52.(3)预处理后的烟杆粉末用真空抽滤泵将滤渣滤出，不用水洗，直接置于55℃烘箱，烘干至恒重后用打粉机粉碎成末，过100目筛得到未水洗烟杆粉末。
53.(4)将预处理后的固态烟杆粉末作为碳源配置发酵培养基，烟杆底物浓度为5％，其余成分为硫酸铵2g/l，酵母粉5g/l，磷酸二氢钾5g/l，七水硫酸镁0.5g/l，初始ph值调节为5.5，发酵容器为25ml西林瓶。
54.(5-1)配置种子培养基：液体种子培养基的成份为木糖20g/l、酵母粉10g/l，蛋白胨20g/l，固体种子液培养基再添加2％琼脂。
55.(5-2)将-80℃保存的酵母划线接种至培养皿内，再挑取单菌落接种至试管斜面上，30℃培养48h。将活化的酵母接种置于250ml的三角瓶中，含有25ml液体种子培养基。置于30℃摇床中，在180rpm下振荡培养14-16h。
56.(5-3)用注射器用按15fpu/底物的标准将纤维素酶液注入西林瓶，按需求添加终浓度为30mm、40mm、60mm和80mm的硼氢化钠。
57.(5-4)用注射器按5％的量接种酵母种子液，然后置于30℃、150rpm摇床中进行发酵，周期为48h。发酵结束后测定培养基中的乙醇浓度，在分别添加30mm、40mm、60mm、80mm硼氢化钠情况下，如图3所示，乙醇的浓度分别为4.98g/l、5.63g/l、6.94g/l和6.96g/l，乙醇的产量相对于对比例中5％烟杆底物浓度未添加硼氢化钠的情况，分别提高了14.75％、29.72％、59.9％和60.4％，表明添加硼氢化钠可以显著提高未洗涤酸预处理烟杆的生物乙醇发酵产量，其中在添加60mm时，在未洗涤的情况下基本接近对比例的洗涤的效果，但再增加含量则乙醇发酵产量没有明显提升。
58.以上仅为本发明专利得实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化，凡在本发明的精神和原则之类，所做的任何修改、替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。