一种蠋蝽病毒特异性CP检测引物及PCR检测方法与流程

一种蠋蝽病毒特异性cp检测引物及pcr检测方法
技术领域
1.本发明涉及基因检测技术领域，具体为一种蠋蝽病毒特异性cp检测引物及pcr检测方法。


背景技术：

2.蠋蝽（arma chinensis），又名蠋敌，隶属半翅目（hemiptera），蝽科（pentatomidae），益蝽亚科（asopinae），蠋蝽属（arma）,蠋蝽的若虫和成虫可捕食粘虫、刺蛾、叶甲、蚧壳虫、蚜虫、草地贪夜蛾等40余种常见害虫，是一类捕食性天敌昆虫,蠋蝽分布范围较为广泛，国内主要分布在黑龙江、北京、云南、贵州等近二十个省份,基于蠋蝽食性广谱的特点，其对农业上为害严重的鳞翅目、鞘翅目等害虫的大发生有显著的抑制作用，但自然条件下蠋蝽数量很难满足害虫防治需要，故需对蠋蝽进行室内培养人工扩繁。
3.蠋蝽食性广，适应性强，为其人工规模化饲养提供了可能，使其成为田间生物防治的一类重要天敌资源,近年来，贵州省烟草公司遵义市公司通过建立蠋蝽人工扩繁基地研究人工大量扩繁技术，以规模化饲养的粘虫为食物，将蠋蝽打造成一种成熟的商品化天敌昆虫，并建立了防治烟草害虫的田间应用技术,现已列为烟草行业绿色防控重大专项推荐的关键技术之一，并在全国主要烟区进行了示范推广。
4.我国科研人员对蠋蝽的防治效果和人工饲养技术开展了详细的研究，包括种群动态、人工饲料、防治害虫种类等,但在蠋蝽规模化繁育过程中遇到了因染病而导致个体大量死亡的问题，该问题严重威胁蠋蝽规模化生产及推广应用，急需对蠋蝽体内的病原物种类及其功能开展相关的研究。
5.前期通过rna-seq高通量测序，我们在蠋蝽体内发现了一种新的双顺反子病毒，命名为acv-1，该病毒对蠋蝽生长和繁殖有何影响尚不清楚,研究该病毒的基因组序列、生物学分类、传播途径、组织分布以及该病毒与蠋蝽发育的生理、生化和分子调控机制，有助于明确病毒与宿主的关系，同时为进一步深入研究病毒蛋白质的功能、病毒侵染宿主的机制及病毒基因组的复制奠定理论基础，进而促进该双顺反子病毒的应用研究,若为有害病毒，可根据其传播途径等构建防控技术体系；若为有益病毒，进一步加以利用，为蠋蝽商业化应用奠定基础。
6.在明确病毒对蠋蝽种群繁殖影响及其传播途径的基础上，设计特异性检测引物，通过单对配对并检测母体的方法，检测蠋蝽个体是否携带acv-1，利用健康的蠋蝽后代，构建蠋蝽工厂化繁育的种群。


技术实现要素：

7.本发明提供的发明目的在于提供一种蠋蝽病毒特异性cp检测引物及pcr检测方法。通过本发明一种蠋蝽病毒特异性cp检测引物及pcr检测方法，该蠋蝽病毒特异性cp检测引物及pcr检测方法，检测准确性高，本发明根据acv-1编码蛋白外壳的核酸序列设计的引物acv-1f/r，在pcr快速检测acv-1时，可扩增出725 bp的片段，不仅可对蠋蝽单头成虫、5龄
若虫和4龄若虫进行检测，也可检测单头3龄若虫、2龄若虫、初孵若虫及卵块，操作简便快捷，本发明采用pcr技术，操作过程简单、快速、高效，一般整个过程可在2个小时内完成，特异性强，本发明设计的特异性引物只对acv-1具有扩增能力。
8.为了实现上述效果，本发明提供如下技术方案：一种蠋蝽病毒特异性cp检测引物及pcr检测方法，包括以下步骤：步骤一、蠋蝽总rna的提取，依次进行研磨、提取和提纯；步骤二、蠋蝽cdna的制备；步骤三、检验acv-1的特异性引物的合成；步骤四、pcr扩增反应、pcr扩增程序与pcr产物的鉴定；步骤五、对检验结果进行复检。
9.进一步的，包括以下步骤：根据步骤一中的操作步骤，蠋蝽样本研磨后，取0.1 g于1.5 ml 无菌无酶离心管中，加入trizol
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reagent混匀，室温静置5 min，加入200
ꢀµ
l三氯甲烷，上下剧烈震荡25-30 s，室温静置3min后，4℃ 12000 rpm，离心15 min，离心完毕后，吸取400
ꢀµ
l上清于新的1.5 ml无菌无酶离心管中，加入500
ꢀµ
l异丙醇，混匀，室温静置10 min后，4℃ 12000 rpm，离心10 min，弃上清，加入1 ml 75%乙醇，吹打沉淀使其悬浮，洗涤结束后，4℃ 7500 rpm，离心5 min，弃上清，4℃ 7500 rpm，离心1 min，将剩余上清吸净，晾干。
10.进一步的，包括以下步骤：根据步骤一中的操作步骤，用50-100
ꢀµ
l depc水溶解rna，检测rna浓度和纯度后，置于-80℃ 冰箱中保存备用。
11.进一步的，包括以下步骤：根据步骤二中的操作步骤，参照transscript
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one-step gdna removal and cdna synthesis supermix（transgen, beijing, china）试剂盒合成acv-1基因组的第一链cdna，反转录体系：total rna 2
ꢀµ
l、oligo(dt) 1
ꢀµ
l、rnase-free water 5
µ
l混匀65℃ 孵育5 min，冰浴2 min后，再向体系内加入2
×
ts reaction mix 10
ꢀµ
l、transscript
®ꢀ
rt/ri enzyme mix 1
ꢀµ
l、gdna remover 1
ꢀµ
l，反应条件为42℃ 30 min、85℃ 5 s，得到的cdna储存于-20℃。
12.进一步的，包括以下步骤：根据31中的操作步骤，acv-1f：cacaggggattttactgaagc。
13.进一步的，包括以下步骤：根据步骤三中的操作步骤，acv-1r: cgtcgggtgtacctgtagaaa。
14.进一步的，包括以下步骤：根据步骤四中的操作步骤，反应体系为20
ꢀµ
l，其中2
×
easytaq
®ꢀ
pcr super mix（transgen, beijing, china） 10
ꢀµ
l、forward primer 0.5
ꢀµ
l、reverse primer 0.5
ꢀµ
l、ddh2o 8
ꢀµ
l、cdna 1
ꢀµ
l。
15.进一步的，包括以下步骤：根据步骤四中的操作步骤，94℃ 预变性5 min；94℃ 30 sec，60℃ 30 sec，72℃ 30 sec，35个循环。
16.进一步的，包括以下步骤：根据步骤四中的操作步骤，取5
ꢀµ
l pcr产物用含有核酸染料的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果。
17.进一步的，包括以下步骤：根据步骤五中的操作步骤，分别使用特异性引物acv-1f/r及蠋蝽actin引物检测携带/不携带acv-1蠋蝽样本，用蠋蝽actin引物检测样本以确保蠋蝽cdna样本可用性，ac-actin引物检测样本及阳性对照均有条带且阴性对照无条带，说
synthesis supermix（transgen, beijing, china）试剂盒合成acv-1基因组的第一链cdna，反转录体系：total rna 2
ꢀµ
l、oligo(dt) 1
ꢀµ
l、rnase-free water 5
µ
l混匀65℃ 孵育5 min，冰浴2 min后，再向体系内加入2
×
ts reaction mix 10
ꢀµ
l、transscript
®ꢀ
rt/ri enzyme mix 1
ꢀµ
l、gdna remover 1
ꢀµ
l，反应条件为42℃ 30 min、85℃ 5 s，得到的cdna储存于-20℃，步骤三、检验acv-1的特异性引物的合成，acv-1f：cacaggggattttactgaagc，acv-1r: cgtcgggtgtacctgtagaaa，其中，本发明的acv-1特异性检测引物，可以特异性扩增得到的725bp的基因片段，其核苷酸序列如下所示：cacaggggattttactgaagcagaaatgcgtaagttatggacagataaaacatatgcgaagaaaccagcccgcatttatgcacaagcagcacgagaacttaaacaacttgaagcaaataactcaccatccacagcattaggacagatttcagaaggactatccactttgagtcacataccagtattaggaaatatctttagcaccccagcatggatatcggcgaaagctgcagatttggcaaaattatttggtttttctaaacctacggttcaaggtaaagttggagaatgtaagttacgcggtcaaggaagaatggcaaattttgacggtatggatatgtcacacaaaatggcattgtcgtcaactaatgaaatagaaacaaaagaaggattggcaggaacatcactagacgaaatggatttatctcggattctatctatcccaaattattgggatcgattcacttggaaaacatcggatgcaacaaatgcagttttgtgggataattatgtatcaccttttaaagtaaaaccatattcttcaacaataacagatagatttagatgcactcatatgggatatgtagccaacgcttttacttattggagaggttctattgtatatacttttaaatttgtaaaaactcaatatcattcaggtaggttaagaatttcatttattccatattattacaacgataagatttctacaggtacacccgacg本发明根据acv-1编码蛋白外壳的核酸序列设计一对特异性引物acv-1f/ r，该特异性检测引物只对acv-1具有扩增能力，可用于检测筛选不携带acv-1的蠋蝽，利用健康的蠋蝽后代，进行规模化繁育，将蠋蝽打造成一种成熟的商品化天敌昆虫，这为蠋蝽是否携带acv-1的鉴定提供了一种可行的办法，在生物防治方面存在重要意义，步骤四、pcr扩增反应、pcr扩增程序与pcr产物的鉴定，反应体系为20
ꢀµ
l，其中2
×
easytaq
®ꢀ
pcr super mix（transgen, beijing, china） 10
ꢀµ
l、forward primer 0.5
ꢀµ
l、reverse primer 0.5
ꢀµ
l、ddh2o 8
ꢀµ
l、cdna 1
ꢀµ
l，94℃ 预变性5 min；94℃ 30 sec，60℃ 30 sec，72℃ 30 sec，35个循环，取5
ꢀµ
l pcr产物用含有核酸染料的1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，于凝胶成像系统根据扩增产物的大小判定结果，步骤五、对检验结果进行复检，分别使用特异性引物acv-1f/r及蠋蝽actin引物检测携带/不携带acv-1蠋蝽样本，用蠋蝽actin引物检测样本以确保蠋蝽cdna样本可用性，ac-actin引物检测样本及阳性对照均有条带且阴性对照无条带，说明检测样本cdna均可用；acv-1f/r检测结果中阳性对照有条带，阴性对照无条带，说明检测结果可信，对照（即不携带acv-1）蠋蝽样本无扩增产物，图1a中1泳道及图1b中1、2泳道为对照（即不携带acv-1）蠋蝽样本无扩增产物，yc1-yc13为携带acv-1蠋蝽样本均扩增出了725 bp的目的条带，判定所设计的acv-1f/r引物特异性强。
33.实施例2：蠋蝽总rna的提取、cdna的制备、acv-1f/r的合成、pcr扩增及pcr产物的鉴定均同实例1，将实例1中的目的片段参照easypure
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quick gel extraction kit（transgen, beijing, china）说明进行切胶回收，回收目的片段与载体peasy-t1 25℃连接30 min，热激法转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布于含氨苄（amp）的培养基过夜培养，挑取平板上的克隆进行菌落pcr，将pcr结果中大小正确条带对应的菌液样品送上海派森诺生物科技股份有限公司进行序列测定，测序结果比对正确的菌液，在37℃ 200 rpm的摇床中过夜培养，参照easypure
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plasmid miniprep kit（transgen, beijing, china）说明进行质粒提取，提取质粒测定浓度为419.1 ng/
µ
l，通过探针法绝对荧光定量，以提取的质
粒标准品为模板，以10倍为梯度稀释7个浓度，建立acv-1的标准曲线以便后续病毒拷贝数的计算，以拷贝数为2.05
×
10
10 copies/
µ
l、2.05
×
10
6 copies/
µ
l的质粒为模板，分别在退火温度52℃、54℃、56℃、58℃、60℃和62℃进行pcr扩增。
34.实施例3：蠋蝽总rna的提取、cdna的制备、acv-1f/r的合成、pcr扩增鉴定及纯化、载体克隆、质粒的提取均同实例2，质粒浓度，原始质粒拷贝数为2.05
×
10
13 copies/
µ
l，将其从2.05
×
10
8 copies/
µ
l以10倍为梯度稀释10个浓度梯度，使用特异性引物acv-1f/r，以上述10个浓度梯度的质粒为模板进行特异性扩增，检测效果见图3，最低检测极限达到20.5 copies/ul，浓度梯度为2.05
×
10
8 copies/
µ
l，2：2.05
×
10
7 copies/
µ
l，3：2.05
×
10
6 copies/
µ
l，4：2.05
×
10
5 copies/
µ
l，5：2.05
×
10
4 copies/
µ
l，6：2.05
×
10
3 copies/
µ
l，7：2.05
×
10
2 copies/
µ
l，8：20.5 copies/
µ
l，9：2.05 copies/
µ
l，10：0.205 copies/
µ
l，-：阴性对照。
35.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。