一种PLGF单克隆抗体、试剂盒、其制备方法和应用与流程

id no.4所示的氨基酸序列，或seq id no.2、seq id no.3、 seq id no.4所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
11.作为本发明实施例的另一种优选方案，plgf单克隆抗体的轻链高变区 cdr-l1、轻链高变区cdr-l2、轻链高变区cdr-l3氨基酸序列分别为seq id no.6、 seq id no.7、seq id no.8所示的氨基酸序列，或seq id no.6、seq id no.7、seqid no.8所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
12.本发明实施例的另一目的在于提供一种如所述的plgf单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
13.一、plgf蛋白抗原的制备；
14.二、plgf多克隆抗体的制备；
15.三、plgf单克隆抗体的制备；
16.四、单克隆抗体筛选：建立剂量反应曲线，筛选最优单克隆抗体；
17.五、杂交瘤中单克隆抗体基因的调取：
18.提取杂交瘤细胞的总rna；
19.以oligodt为引物，逆转录合成得到cdna；
20.以合成cdna为模板，进行pcr扩增；
21.获取编码重链可变区基因序列和编码轻链可变区基因序列；
22.重链可变区基因序列和编码轻链可变区基因序列和抗体的恒定区进行密码子优化并合成，分别获得完整抗体基因的重链和轻链；
23.将获得的重链和轻链基因分别克隆到pmd18-t表达载体中；
24.将获得的质粒转染感受态细胞中；
25.收集细胞上清液，纯化、浓缩后获得plgf单克隆抗体。
26.作为本发明实施例的另一种优选方案，pcr扩增的条件为：95℃变性5min； 95℃，1min，55℃，2min，72℃，1min，35个循环；72℃，延伸10min。
27.本发明实施例的另一目的在于提供一种plgf检测试剂盒，含有所述的plgf 单克隆抗体。
28.本发明实施例的另一目的在于提供一种所述的plgf检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
29.将plgf单克隆抗体用缓冲液稀释，加入链霉亲和素磁珠反应；
30.清洗缓冲液；
31.加入含胎牛血清的pbs封闭液，反应后进行磁性分离，去除上清液；
32.用缓冲液清洗后，磁粒悬于含牛血清白蛋白的pbs的保存缓冲液中，制成plgf包被磁珠；
33.用plgf蛋白抗原，按比例稀释多个梯度分装制成plgf校准品；
34.将plgf多克隆抗体加入吖啶酯溶液，避光反应；
35.反应完毕后取出，加入赖氨酸盐溶液，继续避光反应；
36.纯化，得到plgf吖啶酯标抗体；
37.plgf包被磁珠中加入血清样本和校准品，再加入plgf吖啶酯标抗体，温育后即形成抗体-抗原-标记抗体复合物；
38.分别加入hno3、h2o2发光激发液a、naoh、triton-100发光激发液b，立即放入化学发光免疫检测仪内，检测各孔的发光强度；
39.根据反应曲线算出样品中plgf的含量。
40.作为本发明实施例的另一种优选方案，用pbs、tween-20清洗缓冲液。
41.作为本发明实施例的另一种优选方案，用g-25脱盐柱纯化，得到plgf吖啶酯标抗体。
42.本发明实施例的另一目的在于提供一种所述的plgf检测试剂盒在制备评估胎盘功能不全、监测子痫前期检测试剂盒中的应用。
43.本发明的plgf单克隆抗体，具有较高的亲和力，特异性强，在体外具有良好的生物学活性；包含有plgf单克隆抗体的检测试剂盒具有检测方法简便、准确性强、成本低的优点。含有plgf单克隆抗体的检测试剂盒的胎膜早破符合率为99％，可作为胎盘功能不全的独立评估因子，还可以对由此引起的子痫前期进行预测、鉴别和治疗监测。
附图说明
44.图1是plgf检测剂量-反应体系示意图。
45.图2是两种plgf试剂盒检测数据的绝对偏倚图。
46.图3是两种plgf试剂盒检测数据的相对偏倚图。
具体实施方式
47.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
48.以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
49.实施例1
50.该实施例提供了一种plgf单克隆抗体，plgf单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为seq id no.1所示的氨基酸序列；或seq id no.1所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；
51.plgf单克隆抗体的重链高变区cdr-h1、重链高变区cdr-h2、重链高变区 cdr-h3的氨基酸序列分别为seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4所示的氨基酸序列；或seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；
52.plgf单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为seq id no.5所示的氨基酸序列；或seq id no.5所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列；
53.plgf单克隆抗体的轻链高变区cdr-l1、轻链高变区cdr-l2、轻链高变区cdr-l3氨基酸序列分别为seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8所示的氨基酸序列；或seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
54.seq id no.1：
[0055][0056]
seq id no.2：
[0057][0058]
seq id no.3：
[0059][0060]
seq id no.4：
[0061]
seq id no.5：
[0062]
seq id no.6：
[0063]
seq id no.7：
[0064][0065]
seq id no.8：
[0066][0067]
实施例2
[0068]
该实施例提供了一种plgf单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：
[0069]
一、plgf蛋白抗原的制备：
[0070]
(1)根据genbank数据库中人plgf(cal49880.1)的序列设计一对引物：
[0071]
上游引物为vf：5
’‑
cggcgacggagcgggctggcatgtgggggg-3’；
[0072]
下游引物为vr：5
’‑
ccagctcttgcagcactcatcccatccctg-3’；
[0073]
上游引物、下游引物的位点与哺乳细胞高效表达质粒载体psec/wg上的相应多克隆位点吻合；
[0074]
通过全基因合成含有人plgf基因片段的克隆质粒，以质粒为模板，用pyrobestdna聚合酶进行plgf基因特异性扩增，pcr扩增的条件：95℃变性5min；95℃，1min，55℃，2min，72℃，1min，35个循环；72℃，延伸10min；
[0075]
扩增后的pcr产物进行凝胶回收、氯仿抽提产物、乙醇沉淀、te溶解，得到psec/wg质粒，备用；
[0076]
回收的plgf基因与psec/wg质粒分别进行pcii和xhoi双酶切，凝胶电泳法回收；
[0077]
再次分别纯化pcr酶切产物和载体的回收产物，plgf与psec/wg按照1:1的摩尔比混合，用te溶解，于16℃反应12小时，置于70℃条件下10min终止反应；
[0078]
将上述反应产物连接dh-5α感受态细胞，通过氨苄(1mg/ml)抗体筛选出阳性克隆，进行扩增，抽提重组plgf/psec/wg质粒并经酶切、测序鉴定，备用；
[0079]
(2)采用脂质体试剂lipofectamine2000转染重组plgf/psec/wg质粒到真核表达细胞系flp-incho中，转染后将细胞置于含潮霉素的培养基中培养和筛选；
[0080]
未转染的flp-incho细胞系在hamsf12完全培养基中培养(含10％fbs、2mml-谷氨酰胺)，其中添加1％青/链霉素和100μg/mlzeocin转染了重组质粒plgf/psec/wg的flp-incho细胞，因为plgf基因插入使宿主细胞基因组中的zeocin抗性基因失活，但同时带入了潮霉素抗性基因(hyg )，因此，转染了重组质粒的宿主细胞可以在含潮霉素的培养基中培养，而未转染的宿主细胞在此条件下不能存活；在含800μg/ml的潮霉素的hamsf12完全培养基中培养，6-7天可以筛选出相应的重组基因表达克隆；
[0081]
将转染了plgf/psec/wg重组质粒的flp-incho细胞在ultracho无血清培养基中培养，每隔3-4天收集细胞培养上清液1次；
[0082]
收集的培养上清液10000r/min离心5分钟，去除沉淀；上清液中加入0.02％nan3，并通过0.22μm滤膜过滤除去所有可能的细胞碎片；
[0083]
在柱子中填装l.0ml树脂，并用大约10体积的pbs(ph7.2)平衡；将含目的蛋白的上清液过proteing-sepharose4b柱2次；20-30体积的pbs(ph7.2)洗柱；预先在每支收集小管中加入28μl的1.25mtris-hcl(ph8.0)；再用100mmglycine-hcl(ph3.0)洗脱液洗脱，按每管1.0rnl收集于收集小管中，使洗脱液能在收集小管中立即被中和；通常蛋白在第3-10管被洗脱下来，峰值大约在3、4、5管；收集所有a280＞0.01的洗脱液，再用ultrafree15(mwco10000，millipore)的离心过滤柱浓缩；表达水平为50mg/l，进行sds-page电泳鉴定，纯化后的plgf蛋白纯度大于98％；蛋白定量后，最后通过0.22μm滤膜过滤除菌，贮存于-20℃备用；
[0084]
二、plgf多克隆抗体的制备
[0085]
(1)用雄性大耳兔作为免疫动物，先用10mg卡介苗注射刺激动物，使用plgf蛋白作为免疫抗原一周后开始免疫；足下4-6点皮下注射，使用弗氏完全佐剂作为免疫佐剂，分四次免疫动物；每次取1mgplgf蛋白将等量的弗氏完全佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内充分乳化1小时，进行足皮下注射，每次间隔两周；
[0086]
取耳静脉血elisa法检测效价，达到1:40000进行颈动脉放血，5000rpm离心取血
清，利用deae离子交换纯化，得到血清粗提多克隆抗体，备用；
[0087]
(2)血清粗提多克隆抗体用0.5mol/l pbs(ph 7.5)稀释至1mg/ml，配置 cnbr-sepherose 4b的琼脂糖凝胶3ml，用偶联剂偶联9mg plgf蛋白抗原，室温反应4小时，制成plgf抗体亲和层析柱，将血清粗提多克隆抗体上柱纯化，洗脱收集，使用紫外可见分光光度计在波长280nm处测定抗体od值，所得od 值除以1.35即为所测抗体的浓度，添加40-50％甘油置于-20℃可长期保存；
[0088]
三、plgf单克隆抗体的制备
[0089]
(1)培养上述获得稳定表达的plgf/psec/wg重组质粒flp-in cho细胞，免疫5只雌性bala/c小鼠，每只balb/c小鼠皮下注射1
×
107细胞，连续免疫4 次，每次间隔2周；免疫7天后取血，用clia法检测血清效价，选择效价最高的小鼠，脾内注射1
×
106个细胞加强免疫，3天后取小鼠脾脏，研磨，并对脾细胞计数备用；
[0090]
(2)取脾细胞与骨髓细胞sp2/0按细胞计数5:1的比例融合，peg1200诱导，融合后加到含有饲养层的96孔板中培养，一周后用hat培养基半量换液，观察融合后细胞状态；
[0091]
用间接clia法筛选阳性杂交瘤细胞株，选择1株plgfab持续分泌阳性率 98％以上的杂交瘤细胞(2h2)进行扩大培养准备腹腔注射小鼠，小鼠1周前腹腔注射500μl液体石蜡；
[0092]
离心收集杂交瘤细胞，用不完全培养液悬浮并混匀，将细胞数调至1
×
109/l，开始接种小鼠，每只小鼠腹腔注射500μl，1周后对腹部明显肿胀小鼠抽取腹水，所得腹水3000r/min离心3分钟，收集上清液；
[0093]
(3)protein g纯化柱纯化腹水；用0.02mol/l pb缓冲液平衡纯化柱，加入腹水上样，用0.1mol/l甘氨酸盐酸缓冲液(ph 2.7)进行洗脱，ep管收集， 0.05mol/lpb透析，浓缩得到plgf单克隆抗体，置于-20℃冻存；
[0094]
四、单克隆抗体筛选
[0095]
(1)包被制备好的plgf单克隆抗体，以0.5mol/l pbs稀释抗体至 2～5μg/ml；100μl/孔加入酶标板中包被，2-8℃过夜后，0.9％nacl洗3次，加入含有1％bsa的封闭液，150μl/孔封闭，2-8℃过夜后晾干备用；
[0096]
(2)筛选最优单克隆抗体：稀释制备好的plgf蛋白抗原，按比例稀释8 个梯度(0、10、50、100、200、400、1000、2000pg/ml)，依次加入前述制备好的酶标中，每孔50μl，再加入生物素化多克隆抗体及标记有辣根过氧化物酶的链霉亲和素，37℃温育1小时，pbst洗涤5次，加入显色底物液，用酶标仪检测od值；
[0097]
以plgf浓度为横坐标x值，od值为纵坐标y值，建立剂量反应曲线(见图1所示)。图1可以看出，plgf检测试剂盒所建立的剂量反应曲线，线性系数r》0.99，检测范围可达0-600pg/ml，试剂盒的分析性能优越；最终挑选评价指标最好的plgf单克隆抗体；单克隆抗体隆抗体作为夹心法elisa检测方法的评价标准应同时满足s0 od值＜0.1，s7/s1(p/n)最大，剂量反应曲线相关系数大于0.99，30例质控血清检出率大于90％；
[0098]
五、杂交瘤中单克隆抗体基因的调取
[0099]
(1)用trizol试剂提取5
×
106的选中杂交瘤细胞(2h2)的总rna；
[0100]
再以oligodt为引物，amv逆转录酶逆转录温度37℃、时间15分钟，合成得到cdna；
[0101]
以合成cdna为模板，针对rna序列的引物和基因特异性引物gsp进行巢式pcr扩增，pcr的条件均为：95℃变性5min；95℃，1min，55℃，2min， 72℃，1min，35个循环；72℃，延伸
10min；
[0102]
(2)将pcr产物经1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，切取并回收目的凝胶条带，调取目的基因，连接到pgem-t载体中，ecori酶切鉴定阳性的重组质粒，进行dna序列的测定，分别获得编码重链可变区基因序列，编码轻链可变区基因序列；
[0103]
将获得重链和轻链可变区基因序列和抗体的恒定区一起进行密码子优化并合成，分别获得完整抗体基因的重链和轻链，将获得的重链和轻链基因分别克隆到pmd18-t表达载体中；质粒分别提取150μg的量，并去内毒素(＜1eu/mg)，将获得的2种质粒1:1共转染到50ml体积的悬浮的感受态tg1细胞中，转染试剂采用pei，质粒和pei的比值为1:2；
[0104]
转染3-7天后，收集细胞上清液，sds-page检测抗体表达是否正确，proteina柱纯化，浓缩后获得合格的plgf单克隆抗体，纯度大于98％。
[0105]
实施例3
[0106]
该实施例提供了一种plgf检测试剂盒，含有实施例1所述的plgf单克隆抗体。
[0107]
实施例4
[0108]
该实施例提供了一种plgf检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[0109]
(1)以链霉亲和素磁珠作为免疫反应载体，将plgf单克隆抗体用0.02mol/ltris-hcl偶联缓冲液稀释至2.2μg/ml，加入链霉亲和素磁珠，于37℃摇床中反应30min；
[0110]
用0.01mol/lpbs、0.05％tween-20清洗缓冲液，清洗3次左右；
[0111]
加入1ml含2％胎牛血清的0.01mol/lpbs封闭液，于37℃，180rpm，摇床中反应2h，磁性分离，去除上清液；
[0112]
用1mlph7.4，含0.1％tween-20的0.01mol/lpbs缓冲液清洗3次，磁粒悬于1mlph7.4的含1％牛血清白蛋白的0.01mol/lpbs的保存缓冲液中，制成plgf包被磁珠，4℃备用；
[0113]
(2)用1％bsa/0.5mol/lpbs稀释制备的plgf蛋白抗原，按比例稀释6个梯度(10、50、100、200、400、600pg/ml)分装制成plgf校准品；
[0114]
将生物素化plgf多克隆抗体加入0.5mm的吖啶酯(4-(2-琥珀酰亚氨基羧基)苯基-10-甲基吖啶-9-羧酸酯氟磺酸盐)溶液50μl，避光于25℃，180rpm，摇床中反应20min；
[0115]
反应完毕后取出，加入10％的赖氨酸盐溶液100μl，继续避光于25℃，180rpm，摇床中反应30min；
[0116]
用g-25脱盐柱纯化，得到plgf吖啶酯标抗体；
[0117]
(3)在包被好plgf的磁珠中加入各50μl/孔的血清样本和校准品，再加入50μl/孔plgf吖啶酯标抗体，37℃温育1h，温育后即形成固相抗体-抗原-标记抗体的复合物，0.01mol/lpbs洗涤5次，除去未结合的plgf多克隆抗体和吖啶酯；
[0118]
分别加入0.1mol/lhno3，0.1％h2o2发光激发液a50μl，0.25mol/lnaoh，2％triton-100发光激发液b50μl，立即放入化学发光免疫检测仪内，检测累计时间1.5s各孔的发光强度(rlu)；
[0119]
样品的rlu值随plgf浓度的增加而升高，根据反应曲线即可算出样品中plgf的含量。
[0120]
实验例检测plgf检测试剂盒的性能
[0121]
(1)plgf检测试剂盒的性能分析
[0122]
重复性：plgf检测试剂盒的批内变异系数(cv)不大于10％；批间变异系数(cv)不大于15％；
[0123]
分析灵敏度：试剂盒最低检出限不大于5pg/ml；
[0124]
分析特异性：一定浓度特异性物质(vegf、egf)检测结果不大于50pg/ml；
[0125]
线性范围：在0-600pg/ml浓度范围内，线性相关系数r不小于0.9900。
[0126]
(2)plgf检测试剂盒的临床性能
[0127]
2.1开展122例临床样本检测，43例正常人，76例胎膜损伤及胎盘功能不全患者。试剂盒正常参考值plgf≤87pg/ml，试剂盒检测结果如下：
[0128]
表1符合率及其置信区间
[0129][0130]
表2对称度量
[0131][0132]
a.不假定零假设。
[0133]
b.使用渐进标准误差假定零假设。
[0134]
2.2选择alere公司plgf检测试剂盒作为对比试剂盒，本发明试剂盒作为试验试剂盒，进行测值对比，结果见图2相对偏倚图和图3绝对偏倚图。
[0135]
表3测试结果
[0136][0137]
可以看出，本发明试验试剂盒和对比试剂盒测定结果均未同时超过绝对差值的平均值的4倍和相对差值的平均值的4倍。两种试剂盒的测定结果均无离群值。
[0138]
2.3相关性分析
[0139]
表4相关性分析结果
[0140][0141]
**.在.01水平(双侧)上显著相关。
[0142]
由表4可以看出，对比试剂盒与试验试剂盒检测结果的相关系数为0.996，对相关系数进行的假设检验的结果为p＜0.05，表明两种试剂检测结果之间有直线相关关系；相关系数r接近最大的可能值1，表明两种试剂检测结果间具有很强的相关性。
[0143]
2.4对比试剂盒与试验试剂盒回归方程及方程斜率b的95％置信区间
[0144]
表5方程斜率b的95％置信区间
[0145]
系数a[0146][0147]
a.因变量:本发明试剂盒测值
[0148]
由spss输出的上表可以看出临床试验试剂盒检测结果与对比试剂检测结果之间的回归方程为y＝1.004x-0.494，方程斜率b在95％置信区间内。
[0149]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0150]
[0151]
[0152]
[0153]