切口酶的改进或与切口酶相关的改进的制作方法

1.本发明涉及可用于进行由切口酶催化的反应的组合物，和进行由切口酶催化的反应的方法。


背景技术：

2.许多切口酶是本领域技术人员已知的。与限制性内切酶一样，切口酶识别短的特异性dna序列，并在相对于识别序列的固定位置切割dna链。然而，与限制性内切酶不一样，切口酶仅切割双链多核苷酸的一条链。切口酶的实例的非详尽列表包括：nb.bsml、nb.bts、nt.alwl、nt.bbvc、nt.bstnbi和nt.bpu101。后一种酶可以从thermofisher scientific商购获得；其它的可以从例如new england biolabs获得。在切口酶名称中小写字母“b”或“t”表示该酶是在底链还是在顶链中产生切口(公认的惯例是，顶链从左侧的游离5’端延伸到右侧的游离3’端，其中底链在相反的取向)。
3.切口酶在实验室中作为研究工具是有用的，而且在某些核酸扩增技术中也找到应用，所述核酸扩增技术可以用于(尤其是)检测目的核酸序列和/或诊断疾病或健康状况。这种情况的一个实例公开于wo 2018/002649和ep 2181196中。
4.已知为了使任何酶以接近最佳的速率催化反应，反应条件必须适合于该酶。这包括参数，例如温度、ph和盐/金属的浓度。例如，对于许多切口酶，常规的是提供包括金属阳离子(例如mg
2
)的反应条件，其浓度通常在5-20 mm范围内。
5.wo2017/093326公开了使用转导缓冲剂转导细胞的方法。转导缓冲剂包含“转导化合物”、一种或多种盐和另外的渗透压诱导组分。一种或多种盐可以包含铷盐，例如氯化铷或葡萄糖酸铷。“转导化合物”是“增强目的分子向细胞中的转导的任何化合物”。


技术实现要素：

6.在第一方面，本发明提供了包含切口酶和水溶性铷盐的组合物。
7.组合物可以作为干燥(例如冷冻干燥)固体在容器中提供，以溶解在限定体积的蒸馏水或水性溶液中，或者可以已经作为包含切口酶和一种或多种铷盐的水性溶液提供。干燥固体应理解为是指水含量小于5% w/w，优选小于3% w/w，更优选小于1% w/w水的固体组合物。溶液通常可用作包含在用于进行由切口酶催化的反应的反应混合物中的成分或组分，所述反应可以是例如如下所述的核酸扩增反应。
8.常规的是以浓缩形式提供这样的反应混合物组分，使得在稀释时(例如通过与反应混合物的其它组分混合)，实现期望的组分浓度。
9.通常，例如，浓缩的含酶组分可以以10倍浓度提供，并且当在完整的反应混合物中时稀释十倍。然而，根据本发明的溶液可以以1倍至约100倍浓度的任何浓度提供。
10.在完整的反应混合物中切口酶的最终浓度通常在0.001-5 u/ul范围内，而在完整的反应混合物中铷离子的最终浓度通常在5-50mm，优选10-50mm，更优选10-30mm范围内。因此，在根据本发明的组合物的10倍浓缩的溶液中，例如，切口酶的浓度可以在0.01-50 u/ul
范围内，而rb离子的浓度可以在5-500mm范围内，优选100-500 mm，更优选在100-300mm范围内。
11.在本技术的优先权日尚未公开的本发明人的共同未决专利申请(pct/gb2019/050005；wo2019/135074)偶然公开了包含切口酶反应混合物(尤其是包含硫酸铷)的组合物的一个特定实例。因此，在一个优选的实施方案中，所述组合物不是由以下组分组成的组合物或水性溶液： 12.5 mm mgso4、90 mm tris-hc1 (ph 8.5)、15 mm nh4ch3co2、15 mm na2so4、5 mm dtt、0.2 mg/ml bsa、0.02% triton x-100、20 mm rb2so4、10 mm l-苏氨酸和0.008 u/
µ
l切口内切酶。
12.在一个实施方案中，组合物不是由上文刚刚提到以相同的相对比例但以与所述的那些不同的绝对浓度存在的组分组成的组合物或水性溶液。
13.在其它实施方案中，组合物不是包含以下的组合物：12.5 mm mgso4、90 mm tris-hc1 (ph 8.5)、15 mm nh4ch3co2、15 mm na2so4、5 mm dtt、0.2 mg/ml bsa、0.02% triton x-100、20 mm rb2so4、10 mm l-苏氨酸和0.008 u/
µ
l切口内切酶，与一种或多种另外的组分的组合。
14.本领域技术人员将理解，上述放弃声明包括其中所述浓度的各种试剂可能与放弃保护的组合物中所述浓度相差微不足道的量(例如 /-0.5%的数值)的那些组合物，例如由于制备组合物缺乏准确性。
15.本发明的组合物不同于如在wo2017/093326中公开的。现有技术文献没有明确公开包含切口酶的组合物。此外，在wo2017/093326中基本要求其中公开的缓冲剂组合物包含转导化合物。相反，在本发明的优选的实施方案中，组合物不包含如在wo2017/093326中定义的转导化合物。wo2017/093326提及β-内酰胺酶测定(如其中所述)为适于确定物质是否是“转导化合物”。
16.在wo2017/093326中公开的转导化合物的实例包括非洗涤剂磺基甜菜碱(ndsb)、非洗涤剂的羧基甜菜碱(non-detergent carbobetaine, ndcb)、戊酸、正丁胺和根据在wo2017/093326的第11页中公开的通式i的化合物。
17.本发明人已经发现许多不同的铷盐对切口酶的活性提供有益作用，并且本发明因此不限于使用任何一种特定的铷盐(应理解，铷盐在水中具有合理的溶解度，并且在与切口酶组合使用时以其它方式可接受)。在水中具有良好溶解度的铷盐包括：溴化铷、氯化铷、氟化铷和碘化铷；乙酸盐、铬酸盐、甲酸盐、氢氧化物、碳酸氢盐、硝酸盐、亚硒酸盐和硫酸盐。然而，已发现某些铷盐是特别方便的，并且这些铷盐包括以下：硫酸铷；硝酸铷；和卤化铷(尤其是氯化铷)。
18.组合物可以作为反应混合物的一部分原位形成(例如，以进行多核苷酸切割反应，该反应本身可以形成dna扩增反应的一部分，例如near或star)，或者组合物可以作为试剂盒中的组分而是现成的。“near”是“切口酶扩增反应”的首字母缩写。“star”是“选择性温度扩增反应”的首字母缩写。
19.在
‘
near
’ꢀ
(例如在us2009/0017453和ep 2,181,196中公开的)中，正向和反向引物(在us2009/0017453和ep 2,181,196中称为“模板”)与双链靶的相应链杂交并延伸。正向和反向引物的其它拷贝(过量存在)与相反引物的延伸产物杂交，并且自身延伸，产生“扩增双链体”。如此形成的每个扩增双链体包含朝向每条链的5’端的切口位点，其被切口酶切
割，允许合成进一步的延伸产物。先前合成的延伸产物可以同时与互补引物的其它拷贝杂交，引起引物延伸，并从而产生“扩增双链体”的其它拷贝。以这种方式，可以实现指数扩增。
20.触发扩增过程所需的初始引物/靶杂交事件在靶标仍然基本上是双链的同时发生：尽管初始引物/靶杂交利用了靶链的局部解离(一种称为“呼吸(breathing)”的现象) (参见alexandrov等人，2012 nucl. acids res. 和von hippel等人, 2013 biopolymers 99 (12), 923-954的综述)。呼吸是dna链之间碱基配对的局部和瞬时松弛。初始引物/靶异源双链体的熔融温度(tm)通常比反应温度低得多，因此引物有解离的趋势，但瞬时杂交持续足够长的时间以使聚合酶延伸引物，这增加了异源双链体的tm并使其稳定。
21.near中的扩增阶段在恒定温度下等温进行。实际上，常规的是在相同的恒定温度下(通常在54-56℃的范围内)进行初始靶/引物杂交和随后的扩增循环两者。
22.与near一样，star也是需要使用切口酶的扩增反应。然而，与near不同，star不是等温进行的，而是涉及从(相对升高的)初始温度有意降低反应温度，并且产生更大产率的特异性扩增产物。该技术在wo2018/002649中详细描述。
23.如果需要，可以作为等分试样或多个等分试样提供无论何种形式(例如干燥的、即用溶液形式、浓缩溶液形式)的本发明的组合物。例如，可以在eppendorf
tm
管或其它带塞子的小瓶或容器中提供一个或多个等分试样。
24.方便地，本发明的组合物可以作为试剂盒(例如用于进行核酸扩增反应的试剂盒，其涉及由切口酶催化的切割步骤)的一部分提供。试剂盒可以含有组合物的一个或多个等分试样，每个等分试样在带塞子的小瓶或其它容器中提供。试剂盒通常包含包装，例如纸板或塑料包装，其包含本发明的组合物的一个或多个等分试样，并且通常还包括试剂盒的使用的书面说明书。
25.本发明的组合物可以方便地包含另外的组分，其可以用于例如优化和/或保持切口酶的酶活性。这样的另外的组分可以包含一种或多种缓冲剂、氨基酸、还原剂、保护性赋形剂和碳水化合物。
26.包含在本发明的组合物中的优选的缓冲剂包括tris盐酸盐、tris半硫酸盐、tris edta、tris碱、tris egta、n,n-双(2-羟乙基)甘氨酸、n,n-双(2-羟乙基)-3-氨基-2-羟基丙磺酸、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪丙磺酸、n-(2-羟乙基)哌嗪-n
′‑
(4-丁磺酸)、4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸、原硼酸、3-(n-吗啉代)丙磺酸半钠盐、3-(n-吗啉代)丙磺酸钠盐、3-(n-吗啉代)丙磺酸、哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)二水合物、n-[三(羟甲基)甲基]-3-氨基丙磺酸、3-(n-三[羟甲基]甲基氨基)-2-羟基丙磺酸、n-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸、氯化钠、硫酸钠、乙酸钠、氢化钠、亚硝酸钠、硝酸钠、硼酸钠、硼酸、硫酸钾、乙酸钾、硼酸钾、氯化钾、亚硝酸钾、硝酸钾、硫酸镁、氯化镁、乙酸镁、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、乙二胺四乙酸、乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-n,n,n
′
,n
′‑
四乙酸、柠檬酸或其组合。
[0027]
优选的碳水化合物包括果糖、聚蔗糖
®
、羟乙基(heta)淀粉、戊聚糖多硫酸酯、多磷酸、聚-l-谷氨酸、蔗糖、海藻糖、麦芽三糖、葡聚糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、乳果糖、棉子糖、松三糖、1,6-脱水葡萄糖、k-角叉菜胶、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、明串珠菌二糖、蔗果三糖、水苏糖、毛蕊花糖、蔗果四糖、麦芽糖糊精、环糊精、低聚异麦芽糖、低聚果糖、菊粉或其组合。
[0028]
优选的氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨
酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、瓜氨酸、赖氨酸、组氨酸、牛磺酸、精氨酸或其组合。
[0029]
优选的还原剂包括1,4-二硫赤藓糖醇、dl-二硫苏糖醇、三丁基膦、三(2-羧乙基)膦盐酸盐或其组合。
[0030]
优选的保护性赋形剂包括牛血清白蛋白、α-酪蛋白、球蛋白、α-乳白蛋白、人血清白蛋白、热休克蛋白、含缬酪肽的蛋白、α-晶体蛋白、明胶、乳酸脱氢酶、溶菌酶、肌红蛋白、丝心蛋白、卵清蛋白、白藜芦醇、羟基丁酸酯、辛酸、醌-色氨酸衍生物、壳聚糖、chaps、正辛基葡糖苷、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、油酸、乙醇酸钠、triton x-100、tween
® 20、tween
® 80、thesit
®ꢀ
(聚氧乙烯月桂基醚)、癸酰基-n-甲基葡糖酰胺、辛酰基-n-甲基葡糖酰胺、igepal
® ca-630 (辛基苯氧基聚(乙烯氧基)乙醇)、tergitol和疏水盐。
[0031]
方便地，组合物将使得当用合适体积的蒸馏水稀释和/或混合时，组合物的缓冲剂浓度在1mm至150mm (通常5-100 mm)范围内，并且通常ph在7.0-9.0范围内，更优选7.5-8.0。
[0032]
本发明的多个方面优选涉及在其正式名称中包括前缀字母“n”的切口酶。这指示该酶是“真正的”切口内切酶，与在细胞内与dna甲基转移酶相关的切口酶相反。后一组切口酶在g-t错配对的未配对碱基附近引入切口，这在序列中的胞嘧啶碱基(其被dna甲基转移酶识别)脱氨基后产生。这第二种切口酶用前缀字母“v”表示(其源于这种类型的最好表征的酶的名称“vsr
”‑
极短的补丁修复)。在本发明的优选的实施方案中，切口酶不是“v”型切口酶。
[0033]
在第二个方面，本发明提供了用于进行由切口酶催化的反应的方法，所述方法包括在水溶性铷盐存在下，在与切口酶相容的水性条件下，使切口酶与具有切口酶识别位点的双链寡核苷酸或多核苷酸底物接触的步骤，以在双链寡核苷酸或多核苷酸底物中实现至少一个单链切口或切割。通常，所述方法另外包括通过dna聚合酶(特别是链置换聚合酶)延伸带切口的链的游离3’端，向游离3’端加入核苷酸。寡核苷酸优选包含至少17个核苷酸，更优选至少19个核苷酸。对于本目的，任何长于30个核苷酸的序列都被认为是多核苷酸。多核苷酸可以长达1 kb，或甚至10或20 kb长。
[0034]
在一个实施方案中，本发明的方法在不存在细胞，尤其是不存在待转导的细胞的情况下进行。
[0035]
切口酶用于许多情况。例如，有利用切口酶的核酸扩增技术。这样的技术包括“near
”ꢀ
(“切口酶扩增反应”，例如如在us 2009/017453和ep 2181196中所述的)和“star
”ꢀ
(“选择性温度扩增反应”，如在wo 2018/002649中所述的)。因此，在本发明的第二方面的优选的实施方案中，反应是核酸扩增反应(例如near或star)的一部分或包含在核酸扩增反应(例如near或star)内。
[0036]
特别地，本发明人已经发现，在扩增反应(例如near或star)的反应混合物中包含铷以用其它金属阳离子未观察到的方式改进反应的灵敏度并增加再现性(降低从重复样品获得的结果范围)。
[0037]
另外，这些结果被认为是通过对切口酶的活性的作用而不是对核酸扩增反应混合物的其它酶组分(特别是dna聚合酶)的作用来发挥的。
[0038]
如上所述，可以有用地包含在本发明的组合物中的其它组分可以有助于保持切口酶的活性，或优化切口酶的条件和/或有助于优化进行核酸扩增反应的条件，所述核酸扩增
反应包括使用本发明的组合物。
[0039]
这样的组分可以包含一种或多种，优选两种或更多种，更优选三种或更多种，并且最优选四种或更多种以下物质：(a)镁盐(以用作扩增反应中使用的聚合酶的辅因子)，尤其是硫酸镁，通常浓度为10-15 mm；(b)缓冲剂(例如trishcl)，通常浓度在1-100 mm范围内，并且ph在7.0-9.0范围内；(c)还原剂/抗氧化剂，例如二硫苏糖醇(dtt)，通常浓度为1-15 mm；其它还原剂也是合适的(参见上文)；(d)洗涤剂，例如tritonx-100，通常以约0.01% v/v存在；(e)钠盐，例如硫酸钠，通常浓度在1-20 mm范围内；(f)铵盐，例如硫酸铵，通常浓度在1-25 mm范围内；(g)乙酸盐，例如乙酸钠，通常浓度在1-25 mm范围内；和(h)保护性赋形剂和/或碳水化合物。
[0040]
显然，任选地，单一组分可以在组合物中起多种作用。例如，乙酸铵可以用作铵盐(f)和乙酸盐(g)两者。
[0041]
上面给出的典型浓度值是指“1倍”浓度：即在最终反应混合物中的浓度。应当理解，可以提高组分的浓度以产生例如5倍或10倍的“原”溶液。
附图说明
[0042]
现在将通过说明性实例并参考附图来进一步描述本发明的各个方面，其中：图1是相对荧光单位对时间(分钟)的图，显示在反应混合物中没有硫酸铷(“对照”)或在10 mm、20 mm或50 mm硫酸铷存在下进行的star dna扩增测定的结果；图2a和图2b是相对荧光(任意单位)对时间(分钟)的图，显示在不存在铷盐(“对照”)或在10 mm或50 mm (图2a)硝酸铷或(图2b)氯化铷存在下进行的star dna扩增测定的结果；图3是由本发明人进行的聚合酶活性测定(“paa”)的示意图；图4a和图4b是相对荧光(任意单位)对以℃计的温度(图4a)或循环数(图4b)的图；图5是由本发明人进行的切口酶活性测定(“naa”)的示意图；图6a是平均相对荧光(任意单位)对瞬时温度(℃) (即，在进行荧光读取时样品的温度)的图；图6b是相对荧光(任意单位)对扩增循环数的图；图7-9是相对荧光(任意单位)对时间(分钟)的图，显示在不是铷的各种碱金属或碱土金属盐存在下进行的star dna扩增测定的结果；图10是平均相对荧光(任意单位)对时间(分钟)的图，显示本发明人使用切口酶nb.bsmi在不存在(虚线，对照)或存在(实线) 20 mm硫酸铷下进行的naa的结果；图11是相对荧光(任意单位)对时间(分钟)的图，显示在不存在(“对照”)或存在(“rb”) 20 mm硫酸铷下进行的等温“near
”ꢀ
dna扩增反应的结果；图12a是切口酶n.bspd6i的结构域构造的计算机产生的模型，并且图12b显示叠加
在模型上的表面填充表示；图13是n.bspd6i的推定活性位点的计算机产生的模型；图14显示在具有铷离子的潜在结合袋的n.bspd6i的表面上推定变构位点的计算机产生的模型；和图15是使用切口酶nb.bbvci在氯化铷存在下或不存在氯化铷下的naa的相对荧光(任意单位)对时间(分钟)的图。
具体实施方式实施例
[0043]
实施例1：通过硫酸铷增强扩增反应对各种star缓冲剂组分的研究已经导致发现铷化合物的增强性质，这证明了star方法(wo 2018/002649)中所有反应的测定速度和一致性的改进。
[0044]
酶、寡核苷酸和靶沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)(ct)用作铷测试的靶。沙眼衣原体血清变型j (atcc vr-886)基因组dna获自美国典型培养物保藏中心(manassas，va)。用引物starctf61a2 (seq id no: 1 5
’‑
cgactccatatggagtcgatttccccgaattamg-3’)和starctr61c2 (seq id no: 2 5
’‑
ggactccacacggagtcctttttccttgtttamc-3’)扩增隐蔽质粒的开放阅读框6区域。使用分子信标starctmb1 (seq id no:3，5
’‑
fam/ccattccttgtttactcgtatttttaggaatgg/bhq1-3’)检测所得dna模板，如在ep no. 0728218中所述的。bst x dna聚合酶购自qiagen (beverly，ma)。nt.bstnbi切口内切酶购自new england biolabs (ipswich，ma)，如在美国专利号6,191,267中所述的。硫酸铷购自sigma aldrich (st. louis，mo)。
[0045]
通过integrated dna technologies (coralville，ia)合成寡核苷酸和分子信标。用于star反应的引物的一般特征如在wo 2018/002649中所述。
[0046]
扩增条件和程序star反应的一般方法如在wo 2018/002649中所述。star混合物含有两种引物，聚合酶和切口酶(如上所述)。在25 μl的最终体积中进行反应，包括1.0 μm的正向引物、0.5 μm的反向引物、0.25 μm分子信标、10μl star master mix和5 μl dna样品。star master mix含有以下试剂；12.5 mm mgso4、90mm tris-hcl (ph 8.5)、300
ꢀµ
m每种dntp、20mm (nh4)2so4、15mm na2so4、2mm dtt、0.01% triton x-100、15u切口内切酶、60u聚合酶。在测试样品中向star master mix中加入10 mm、20 mm或50 mm的硫酸铷，或者在对照组中不加入硫酸铷(图1中的“对照”)。每个反应混合物含有100拷贝的靶引物。控制反应温度，使初始温度相对高，随后随着时间逐渐降低，以获得最佳star活性。主要涉及聚合酶活性的初始阶段是在60℃的高温下保持15秒。通过每15秒降低温度-0.4℃，共10分钟，实现其中聚合酶和切口酶两者都是高度活性的指数扩增阶段。使用agilent mx3005 p qpcr设备(agilent)进行扩增和star产物检测。
[0047]
每个反应都进行预孵育，以使试剂达到反应温度并测试盐对扩增动力学、酶性能和信号荧光的作用。
[0048]
扩增系统、等温和star依赖于两种主要的酶(聚合酶和切口酶)来实现功能。可以将任一种或两种酶优化至选定的温度，这导致显著的性能改进，这是选择性温度扩增反应利用的益处。此外，酶需要用于调节和活性的辅因子，例如，镁对于聚合酶活性是必要的。本发明人对替代金属离子和辅因子的研究导致发现，与不含硫酸铷的那些相比，铷改进了star反应(图1)。推荐铷的最佳浓度以获得最大的性能改进。图1证明，硫酸铷在10-20 mm之间的浓度改进star反应。50mm的浓度对扩增有害，减慢反应(尽管注意到，在50mm硫酸铷下，重复样品结果相对于对照组仍然是更紧密分组的)。不将本发明人限制于任何特定理论，据信硫酸根阴离子是在50mm硫酸铷浓度下较慢反应的原因。(注意到反应混合物中的mg
2
离子是聚合酶活性所需的)。
[0049]
实施例2：通过其它铷盐增强扩增反应为了进一步证明正是铷阳离子特异性地改进star，测试其它铷盐。如以上实施例1中所述进行实验，但使用硝酸铷或氯化铷代替硫酸铷。结果示于图2中。硝酸铷和氯化铷证明与硫酸铷相似的性能改进。不令人惊奇地，证明了对盐的阴离子的不同耐受性，但是所有三种铷盐都显示在10-50 mm范围内的测定性能的改进。
[0050]
不将发明人限制于任何理论，据信扩增改进可以归因于至少一种特性。在大多数核酸扩增反应中，聚合酶启动反应中的链延伸。已知聚合酶需要催化离子以帮助引导聚合酶选择正确的核苷酸以在链延伸期间掺入生长的核酸链中，强调了精细构象变化对于聚合酶效率和保真度的重要性。如果铷可以用作比本领域目前已知的用于聚合酶活性的离子更好的催化离子，则可能预期改进的保真度，导致增加测定灵敏度。然而，当将铷加入到star反应时，没有观察到这一点。显而易见的是(i)改进的反应速度和(ii)明显更紧密的重复(即，更高的再现性和更少的可变性)。这种观察到的改进可能是由于反应的指数阶段的改进。反应指数阶段依赖于用于产物周转的切口内切酶。更快的周转将增加速度并使重复紧密，因为产品更一致地制造。这将提示铷调节或改进切口内切酶。这是令人惊讶的并且据本发明人所知这在本领域中是先前未知的。
[0051]
实施例3：使用聚合酶活性测定的结果通过在铷存在下进行聚合酶活性测定(实施例3)和切口酶活性测定(实施例4)来检验上述假设。
[0052]
聚合酶活性测定设计、酶和寡核苷酸：通过integrated dna technologies (coralville，ia)合成用于聚合酶活性测定(paa)的合成寡核苷酸。设计由三种寡核苷酸组成：模板寡核苷酸(nef) (seq id no:4 5
’‑
/56-fam/accgcgcgcaccgagtctgtcggcagcaccgct-3’)、引物寡核苷酸(po) (seq id no:5 5
’‑
agcggtgctgccgaca-3’)和猝灭寡核苷酸(poq) (seq id no:6 5
’‑
ggtgcgcgcggt/3bhq_1/-3’)。将这三种寡核苷酸一起在溶液中形成复合物，每种都具有独特的功能，如在图3中所示。nef具有5’荧光团，poq具有3’猝灭部分，其吸收由5’模板寡荧光团释放的光子。po用作链置换聚合酶的起始位点以延伸和置换猝灭寡核苷酸，由于猝灭寡核苷酸不再接近模板寡核苷酸而允许产生荧光。与较低活性聚合酶或缺乏链置换活性的聚合酶相比，高度活性链置换聚合酶以增加的速率产生荧光信号。
[0053]
聚合酶活性测定条件基本paa混合物含有具有5
’‑
fam修饰的模板寡核苷酸(nef)、与模板的3-末端退火
的引物寡核苷酸(po)、与模板的5
’‑
末端退火的具有3
’‑
bhq1修饰的猝灭寡核苷酸(poq)和聚合酶(如上所述)。在25 μl的最终体积中进行反应，包括0.2 μm nef、0.3 μm po、0.7 μm poq和1倍paa master mix。在1倍浓度下，paa master mix含有以下试剂；12.5 mm mgso4、90 mm tris-hcl (ph 8.5)、300
ꢀµ
m每种dntp、15 mm nh4ch3co2、15 mm na2so4、5 mm dtt、0.2 mg/ml bsa、0.02% triton x-100、15 mm rb2so4、10 mm l-苏氨酸和0.03 u/ μl聚合酶。使用如前所述的star温度分布(实施例1)进行反应。用agilent mx3005p qpcr设备(agilent)进行paa。每个反应都具有反应前孵育以使试剂达到温度以测试所选温度分布的作用并阻止反应加热时的任何变化。每个反应都评估扩增动力学、酶性能和信号荧光。
[0054]
图4a显示含有和不含硫酸铷的平均聚合酶活性测定。该图显示硫酸铷不以任何显著的方式改变聚合酶的活性：对照结果(不加入铷)与在15 mm铷存在下获得的结果非常相似。图4b显示 /-铷的六个重复。没有一个重复显示显著的差异，这指示在star反应中看到的改进不是由于作用于聚合酶的铷。
[0055]
实施例4：使用切口酶活性测定的结果切口活性测定(naa)设计、酶和寡核苷酸：通过integrated dna technologies (coralville，ia)合成用于切口活性测定的合成寡核苷酸。设计由两种寡核苷酸组成：模板寡核苷酸(neq) (seq id no:7 5
’‑
accgcgcgcaccgagtctgtcggca/3bhq_1/-3’)和引物寡核苷酸(pof，seq id no:8 5
’‑
/56-fam/ctgccgacagactcggtgcgcgcggt-3’)。将这些寡核苷酸一起在溶液中形成复合物，每种都具有独特的功能，如在图5中所示。模板寡核苷酸具有用于切口内切酶活性的切口位点和下游3’猝灭剂。引物寡核苷酸具有互补切口位点序列和5’荧光团。当在溶液中时，两者形成复合物，其完成切口结合位点，允许切口内切酶切割。在切口内切酶切口之后，切口位点的寡核苷酸猝灭剂5’现在具有低的熔融温度。因为在高于该熔融温度下进行反应，含有猝灭剂的缩短片段从复合物中释放，产生荧光。切口酶越有活性，产生的荧光信号越快且越大。
[0056]
切口活性测定条件基本naa混合物含有具有3
’‑
bhq1修饰的模板寡核苷酸(neq)和与模板退火的具有5
’‑
fam修饰的引物寡核苷酸(pof)和切口内切酶(如上所述)。在25 μl的最终体积中进行反应，包括1.3 μm neq、1.6 μm pof和1倍naa master mix。在1倍浓度下，naa master mix含有以下试剂；12.5 mm mgso4、90 mm tris-hcl (ph 8.5)、15 mm nh4ch3co2、15 mm na2so4、5 mm dtt、0.2 mg/ml bsa、0.02% triton x-100、15 mm rb2so4、10 mm l-苏氨酸和0.008 u/μl切口内切酶。使用如前所述的star温度分布(实施例1)进行反应。用agilent mx3005p qpcr设备(agilent)进行naa。每个反应都具有反应前孵育以使试剂达到温度以测试所选温度分布的作用并阻止反应加热时的任何变化。每个反应都评估扩增动力学、酶性能和信号荧光。
[0057]
图6a显示含有和不含硫酸铷的平均切口酶活性。该图显示，令人惊讶地，硫酸铷显著增加切口酶的活性。图6b显示每种条件的六个重复。所有重复显示，与不存在铷的结果(重复d4-d9)相比，在铷存在下(重复e4-e9)的切口酶活性明显增加。这是出乎意料的结果，因为以前没有报道铷可以增加切口内切酶的活性。不将申请人限制于任何特定理论，这将进一步解释在实施例1和2中观察到的改进，指示指数扩增阶段得到改进，产生更快的产物周转。
[0058]
实施例5：在star中离子置换的结果铷对切口酶的意外改进表明，应当测试其它容易获得的碱金属和碱土金属以确定它们是否改进切口内切酶的活性。在各种缓冲剂组合中替换不同的盐，并确定它们对star的作用。在各种浓度下测试以下盐；乙酸锂、乙酸钾、硫酸锂、氯化锶、乙酸锶、乙酸钪和乙酸钇。图7显示用乙酸锂和乙酸钾获得的结果，两者都没有改进star，其中锂可能抑制反应，使反应减慢。图8显示乙酸锶的结果：10mm可能稍微减缓反应，而20mm和50mm完全抑制反应。图9显示乙酸钪的结果：所有浓度完全抑制反应。为了简便起见，未显示其它测试盐的结果，因为它们都没有改进star反应，并且大多数完全地抑制了反应，进一步支持了用铷获得的结果的令人惊奇的性质。
[0059]
实施例6：用其它切口酶的改良型切口酶活性测定(naa)的结果为了证明铷改进除nt.bstnbi以外的切口内切酶的活性，使用购自new england biolabs (ipswich，ma)的切口内切酶nb.bsmi进行改良型naa。使用以下条件，在含有和不含铷的情况下进行改良型naa。
[0060]
切口活性测定(naa)设计、酶和寡核苷酸：通过integrated dna technologies (coralville，ia)合成用于改良型切口活性测定的合成寡核苷酸。设计由以下寡核苷酸组成：探针寡核苷酸(dlpfq) (seq id no: 9 5
’‑
/56-fam/cacttggcattctattacacaatagaatgccaagtg/3bhq_1/-3’)。nb.bsmi识别序列为gaatg_cn。(下划线指示切口位点)。寡核苷酸含有自身互补序列，并在溶液中形成分子信标样探针。探针具有用于切口内切酶活性的切口位点和3’猝灭剂。切口结合位点的上游是5’荧光团。当在溶液中时，形成完成切口结合位点的复合物，允许切口内切酶切割。nb.bsmi是底部切割酶，并因此将在切口结合位点的相反链上切割。在切口内切酶切口之后，切口位点的寡核苷酸猝灭剂3’现在具有低熔融温度。因为在高于该熔融温度下进行反应，含有猝灭剂的缩短片段从复合物中释放，产生荧光。切口酶越有活性，产生的荧光信号越快且越大。
[0061]
切口活性测定条件基本naa混合物含有自身折叠的具有5
’‑
fam修饰和3
’‑
bhq1修饰的探针寡核苷酸(dlpfq)和切口内切酶(如上所述)。引物序列与在实施例1中详述的引物序列相同。在25 μl的最终体积中进行反应，包含不同浓度的dlpfq (取决于所用的切口酶)和1倍naa master mix。在1倍浓度下，naa master mix含有以下试剂；12.5 mm mgso4、90 mm tris-hcl (ph 8.5)、15 mm nh4ch3co2、15 mm na2so4、5 mm dtt、0.2 mg/ml bsa、0.02% triton x-100、20 mm rb2so4、10 mm l-苏氨酸和在0.01-0.5 u/μl范围内的切口内切酶。使用如前所述的star温度分布(实施例1)进行反应。用agilent mx3005p qpcr设备(agilent)进行改良型naa。每个反应都具有反应前孵育以使试剂达到温度以测试所选温度分布的作用并阻止反应加热时的任何变化。每个反应都评估动力学、酶性能和信号荧光。
[0062]
图10显示从含有和不含硫酸铷的切口酶活性测定的六个重复的平均值获得的结果。数据显示硫酸铷增加这种其它切口内切酶的活性。
[0063]
实施例7：等温扩增的结果铷可以用于任何扩增技术，因此，例如，扩增过程可以基于链置换扩增中所用的扩增过程，或基于near中所用的扩增过程，或实际上依赖于产生单链切口和随后从有切口的链的3’端延伸的任何其它核酸扩增过程。因此，与sda或near的扩增阶段相关的现有技术的
教导通常将同样适用于本发明的方法的扩增过程。
[0064]
扩增条件和程序基本混合物含有两种引物，聚合酶和切口酶(如上所述)。引物序列与在实施例1中详述的引物序列相同。在25 μl的最终体积中进行反应，包括1.0 μm的正向引物、0.5 μm的反向引物、0.25 μm分子信标、10μl master mix和5 μl dna样品。 master mix含有以下试剂；12.5 mm mgso4、90mm tris-hcl (ph 8.5)、300
ꢀµ
m每种dntp、40mm nh4oac、15mm na2so4、2mm dtt、0.01% triton x-100、15u切口内切酶、60u聚合酶。反应温度是等温的，如在us2009/0017453中所述的。用agilent mx3005 p qpcr设备(agilent)进行扩增和产物检测。
[0065]
每个反应都进行预孵育，以使试剂达到反应温度并测试盐对扩增动力学、酶性能和信号荧光的作用。
[0066]
结果图11中的结果显示在100拷贝和10拷贝模板下，含有和不含20 mm硫酸铷(“ntc”=无模板对照)的等温扩增运行的4个重复的平均值。从图中的数据明显地，硫酸铷改进等温反应，15 mm硫酸铷使得10拷贝反应的进行与没有硫酸铷的100拷贝反应相似。为了简洁起见，未显示数据的重复，但是发明人发现，具有铷的重复比没有铷的更紧密。
[0067]
实施例8：切口酶晶体结构在产生先前参考的经验数据之后，对切口酶的晶体结构进行进一步分析。不将申请人限制于任何特定理论，图12显示切口酶n.bspd6i (蛋白质数据库(“pdb”) id 2ewf)的结构域构造，其用来自pdb id 2vla的结合dna识别基序建模，如kachalova等人，2008中所提及。已经描述了整体构造，并且在本文以若干亚结构域显示：由d1和d2组成的dna结合结构域，和连接由亚结构域cd1和cd2组成的催化性c-末端结构域的接头。在图12b中显示表面填充图叠加在卡通模型上。图13显示推定的活性位点，其显示残基e482、e418、v470、h489和e469。通过铷相对于镁或钠的水合半径(1.6arb 对1.3nmg 至1.1na )鉴定的铷的推测的结合位点(由e418、e482或e469显示)可以赋予局部环境内切口酶折叠更大的稳定性和/或稳定催化结构域，允许对酶的功能关键的关键残基的更有效的活性。另外，在图14中，在切口酶的表面处，潜在的暴露于溶剂的袋由cd接头和d1结构域组成。铷可以在该袋中充当推测的变构辅因子并增强整体活性。该袋中的许多谷氨酸和天冬氨酸残基可以有助于铷结合(残基e364、e335、e368、d341、d357、e353、e305、e327)。然而，最接近活性位点的谷氨酸残基的簇可能螯合铷(残基e364、e335、e368)。
[0068]
实施例9：在等温条件下用第三切口酶的切口酶活性测定(naa)的结果为了证明铷改进第三切口内切酶的活性，使用购自new england biolabs (ipswich，ma)的切口内切酶nb.bbvci进行改良型naa。使用以下条件，在含有和不含铷的情况下进行naa。
[0069]
切口活性测定(naa)设计、酶和寡核苷酸：通过integrated dna technologies (coralville，ia)合成用于切口活性测定的合成寡核苷酸。所述测定包括使用以下寡核苷酸探针(dlpfq) (seq id no: 10 5
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/56-fam/ catgctgaggaatattacacaatattcctcagcatg/3bhq_1/-3’)。寡核苷酸在溶液中形成分子信标样探针。探针具有用于切口内切酶活性的切口位点和3’猝灭剂。切口酶结合位点的
上游是5’荧光团。当在溶液中时，形成完成切口结合位点的复合物，允许切口内切酶切割，该切口酶是底部切割酶，并因此将在切口结合位点的相反链上切割。在切口内切酶切口之后，切口位点的寡核苷酸猝灭剂3’现在具有低熔融温度。因为在高于该熔融温度下进行反应，含有猝灭剂的缩短片段从复合物中释放，产生荧光。切口酶越有活性，产生的荧光信号越快且越大。
[0070]
切口活性测定条件基本(naa)混合物含有自身折叠的具有5
’‑
fam修饰和3
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bhq1修饰的探针寡核苷酸(dlpfq)和切口内切酶(如上所述)。在25 μl的最终体积中进行反应，包含不同浓度的pofq (取决于所用的切口酶)和1倍naa master mix。在1倍浓度下，naa master mix含有以下试剂；40 mm rbcl、购自new england biolabs (ipswich，ma)的1倍cutsmart缓冲剂和在0.01-0.5 u/μl范围内的切口内切酶。使用50℃等温温度分布进行反应。用agilent mx3005p qpcr设备(agilent)进行naa。每个反应都具有反应前孵育以使试剂达到温度以测试所选温度分布的作用并阻止反应加热时的任何变化。每个反应都评估动力学、酶性能和信号荧光。
[0071]
图15是平均相对荧光单位(在naa中切口酶活性的度量)对时间(以分钟计)的图。该图显示在na测定中含有铷(实线)或不含铷(虚线，对照)的四个重复样品的结果。数据显示在等温条件下氯化铷增加nb.bbvci切口内切酶的活性。