一种鲎血蓝蛋白脱铜的方法及应用与流程

1.本发明涉及一种鲎血蓝蛋白脱铜的方法及应用，属于化妆品和药物技术领域。


背景技术：

2.鲎是一种甲壳类马海龙小动物，具有很高的药用价值，其肉辛、咸、平，可清热解毒，明目治青光眼、脓疱创，壳咸、平，有活血祛瘀、解毒作用，尾咸、温，有收敛止血功效，用于治疗肺结核、咳血以及疮疖，鲎血中含有铜离子，可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病。
3.血蓝蛋白是位于节肢动物和软体动物血淋巴中的含铜呼吸蛋白，有研究表明，血蓝蛋白是一种多功能蛋白，它不仅具有输氧功能，而且还与能量的贮存、渗透压的维持以及蜕皮过程的调节有关，除此之外，血蓝蛋白还有酚氧化物酶活性、抗病毒作用和凝集作用，被认为是一种重要的免疫分子。
4.在鲎体内的这种多功能蛋白目前只应用于人体组织部分疾病的检测，因其铜含量超标不符合食品标准，鲎血浆被人们废弃掉，造成宝贵血液蛋白资源的浪费，为了面对环境破坏、人类偷捕等造成的鲎数量的减少，充分利用鲎血蓝蛋白具有重大意义，并且为后续鲎血蓝蛋白的应用研究提供安全可靠的基础。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提供了一种鲎血蓝蛋白脱铜的方法及应用，通过去除鲎血蓝蛋白中的重金属铜，使鲎血蓝蛋白的铜含量达到可食用标准，为后续鲎血蓝蛋白的应用研究提供安全可靠的脱铜鲎血蛋白。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.技术方案之一：
8.一种鲎血蓝蛋白脱铜的方法，包括以下步骤：
9.鲎血浆前处理后加入螯合剂与蛋白沉淀剂溶液，搅拌离心得沉淀，在所述沉淀中加入无机溶剂继续离心，冷冻干燥得到脱铜鲎血蛋白。
10.进一步地，所述鲎血浆选自鲎的新鲜血液。
11.进一步地，所述鲎血浆前处理为加入缓冲液并在水浴搅拌后冷却。
12.进一步地，所述缓冲液为磷酸缓冲液，其ph为6。
13.进一步地，所述水浴温度为65℃，搅拌25min，冷却至10℃，并在3000-4000rpm下离心25-30min。
14.进一步地，所述鲎血浆与螯合剂体积比为103-104:175-225，螯合剂与蛋白沉淀剂体积比为1:1。
15.进一步地，加入螯合剂与蛋白沉淀剂溶液，搅拌离心得沉淀的具体步骤为：经前处理后的鲎血浆加入螯合剂后，在25-35℃水浴搅拌25min并加入蛋白沉淀剂溶液，之后在35℃水浴搅拌25-30min后离心，再次加入螯合剂，继续在30℃水浴搅拌20min并加入蛋白沉淀
剂溶液，再次在30℃水浴搅拌10min后离心得沉淀。
16.进一步地，所述离心的条件均为在4℃，3000-4000rpm条件下离心20-30min，第一次加入的螯合剂与第二次加入的螯合剂的体积比为3-5:4，第一次加入的螯合剂与第一次加入的蛋白沉淀剂溶液的体积比为1:(1-2)。
17.进一步地，所述螯合剂包括edta盐、枸橼酸钠、四水合酒石酸钠中的一种或多种，浓度为0.1-0.3mol/l；
18.进一步地，所述蛋白沉淀剂溶液包括丙酮、甲醇和乙醇中的一种或多种。
19.进一步地，所述沉淀加入10ml无机溶剂搅拌均匀后在4℃,3000-4000r下继续离心20-30min，该离心过程重复两次，收集沉淀并用无机溶剂洗涤三次。
20.所述冷冻干燥的条件为-50℃，真空干燥24h。
21.技术方案之二：
22.根据所述制备方法制备得到的脱铜鲎血蛋白。
23.技术方案之三：
24.所述脱铜鲎血蛋白在制备化妆品以及药物方面的应用。
25.本发明公开了以下技术效果：
26.1)本发明加入螯合剂，利用螯合剂的多齿配体结构，将其与铜离子结合形成具有环状结构的配合物，该配合物通过羧酸基与氮原子键合形成螯合环，使其具有更高的热稳定性，蛋白沉淀剂引起蛋白质沉淀的主要原因是使水溶液的介电常数降低，因而增加了两个相反电荷基团之间的吸引力，促进了蛋白质分子的聚集和沉淀。或者是与蛋白质争夺水化水，致使蛋白质脱除水化膜，而易于聚集形成沉淀，采用多次加入螯合剂、蛋白沉淀剂溶剂以及多次离心分离从而实现脱铜的目的，且螯合剂与蛋白沉淀剂溶液通过离心和水洗即可除去，简单可行。
27.2)本发明有效解决了鲎血蓝蛋白中的重金属铜含量超标的问题，使脱铜后的鲎血蛋白中铜的含量降低到≤1.40μg/g，符合gb15199-94《食品中铜限量卫生标准》的指标规定。
28.3)在鲎数量逐渐减少的情况下，本发明通过简单易操作的脱铜方法对鲎血蓝蛋白进行脱铜，生成的脱铜鲎血蛋白粉质细腻，不仅实现了资源的合理利用，还为后续鲎血蓝蛋白在化妆品和药物方面的应用研究提供了安全可靠的物质基础。
具体实施方式
29.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
30.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
31.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的
实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
32.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
33.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
34.以下通过实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
35.以下实施例中所使用的鲎血浆粉相同，依照《gb/t 5009.12-1996》对其铜含量进行测定，结果显示鲎血浆粉中铜含量为≤611.73μg/g。
36.实施例1
37.第一步：称取0.667g鲎血浆粉于锥形瓶中，加入10ml蒸馏水 10ml 0.9％nacl溶液 3.4ml磷酸缓冲液(ph＝6)，用玻璃棒搅拌使鲎血浆粉能充分溶解，放入65℃水浴锅中水浴搅拌25min，取出放入冰水中冷却至10℃，然后离心(3500rpm，30min，10℃)，收集上清液。
38.第二步：往第一步所得的上清液中加入25ml 0.1mol/l edta二钠溶液，放入35℃水浴锅中水浴搅拌25min后，加入25ml的乙醇溶液，继续在35℃水浴搅拌25min，然后离心(3500rpm，30min，4℃)，得沉淀。
39.第三步：取出第二步所得沉淀于锥形瓶中，加入20ml 0.1mol/ledta二钠溶液，然后放入30℃水浴锅中水浴搅拌20min，后加入等同edta二钠溶液体积的乙醇溶液，继续在30℃水浴搅拌10min，然后离心(3500rpm，30min，4℃)。
40.第四步：第三步离心后将离心管中的上清液倒掉，往离心管中加入10ml蒸馏水，用玻璃棒将沉淀搅拌混匀，之后将离心管放入离心机中离心(3500rpm，30min，4℃)。之后再重复两次，共清洗沉淀三次，放入冷冻干燥机中-50℃，真空干燥24h，得白色粉末即为脱铜鲎血蛋白。
41.实施例2
42.同实施例1，其区别仅在于，第二步中加入50ml的丙酮溶液代替25ml乙醇溶液。
43.实施例3
44.同实施例1，其区别仅在于，乙醇用甲醇代替。
45.对比例1
46.同实施例1，其区别仅在于，螯合剂选用草酸钠。
47.对比例2
48.同实施例1，其区别仅在于，省略第三步。
49.对比例3
50.第一步：称取0.6g鲎血浆粉于锥形瓶中，加入10ml蒸馏水 10ml0.9％nacl溶液 3.4ml磷酸缓冲液(ph＝6)，用玻璃棒搅拌使鲎血浆粉能充分溶解，放入60℃水浴锅中水浴搅拌30min，取出放入冰水中冷却至10℃，然后离心(4000rpm，28min，10℃)，收集上清液。
51.第二步：往第一步所得的上清液中加入25ml 0.1mol/l枸橼酸钠溶液，放入40℃水浴锅中水浴搅拌30min后，加入25ml的丙酮溶液，继续在40℃水浴搅拌30min，然后离心
(3000rpm，25min，4℃)，得沉淀。
52.第三步：取出第二步所得沉淀于锥形瓶中，加入25ml 0.1mol/l枸橼酸钠溶液，放入40℃水浴锅中水浴搅拌30min后，加入25ml的丙酮溶液，继续在40℃水浴搅拌30min，然后离心(3000rpm，25min，4℃)。
53.第四步：第三步离心后将离心管中的上清液倒掉，往离心管中加入10ml蒸馏水，用玻璃棒将沉淀搅拌混匀，之后将离心管放入离心机中离心(3000rpm，27min，4℃)。之后再重复两次，共清洗沉淀三次，放入冷冻干燥机中-50℃，真空干燥24h，得白色粉末即为脱铜鲎血蓝蛋白。
54.对比例4
55.第一步：称取0.8g鲎血浆粉于锥形瓶中，加入10ml蒸馏水 10ml0.9％nacl溶液 3.4ml磷酸缓冲液(ph＝6)，用玻璃棒搅拌使鲎血浆粉能充分溶解，放入70℃水浴锅中水浴搅拌20min，取出放入冰水中冷却至10℃，然后离心(300rpm，25min，10℃)，收集上清液。
56.第二步：往第一步所得的上清液中加入25ml 0.3mol/l四水合酒石酸钾钠溶液，放入30℃水浴锅中水浴搅拌20min后，加入25ml的10％三氯乙酸溶液，继续在30℃水浴搅拌20min，然后离心(4000rpm，20min，4℃)，得沉淀。
57.第三步：取出第二步所得沉淀于锥形瓶中，加入25ml 0.3mol/l四水合酒石酸钾钠溶液，放入30℃水浴锅中水浴搅拌20min后，加入25ml的10％三氯乙酸溶液，继续在30℃水浴搅拌20min，然后离心(4000rpm，20min，4℃)。
58.第四步：第三步离心后将离心管中的上清液倒掉，往离心管中加入10ml蒸馏水，用玻璃棒将沉淀搅拌混匀，之后将离心管放入离心机中离心(4000rpm，20min，4℃)。之后再重复两次，共清洗沉淀三次，放入冷冻干燥机中-50℃，真空干燥24h，得白色粉末即为脱铜鲎血蓝蛋白。
59.对比例5
60.第一步：称取20.6ml鲎血浆于锥形瓶中，加入3.4ml磷酸缓冲液(ph＝6)，用玻璃棒搅拌使鲎血浆能充分溶解，放入65℃水浴锅中水浴搅拌25min，取出放入冰水中冷却至10℃，然后离心(3500rpm，30min，10℃)，收集上清液。
61.第二步：往第一步所得的上清液中加入25ml 0.1mol/l edta二钠溶液，放入35℃水浴锅中水浴搅拌25min后，加入25ml的30％聚乙二醇溶液，继续在35℃水浴搅拌25min，然后离心(3500rpm，30min，4℃)，得沉淀。
62.第三步：取出第二步所得沉淀于锥形瓶中，加入20ml0.1mol/ledta二钠溶液，然后放入30℃水浴锅中水浴搅拌20min，后加入等同edta二钠溶液体积的丙酮溶液，继续在30℃水浴搅拌10min，然后离心(3500r，30min，4℃)。
63.第四步：第三步离心后将离心管中的上清液倒掉，往离心管中加入10ml蒸馏水，用玻璃棒将沉淀搅拌混匀，之后将离心管放入离心机中离心(3500r，30min，4℃)。之后再重复两次，共清洗沉淀三次，放入冷冻干燥机中-50℃，真空干燥24h，得白色粉末即为脱铜鲎血蛋白。
64.铜含量的测定
65.依照《gb/t 5009.12-1996》对实施例1-3与对比例1-5制备得到的脱铜鲎血蛋白进行铜含量的测定，并设置空白对照组(鲎血浆粉)，测试结果见表1。
66.表1各组含铜量
67.组别含铜量(μg/g)实施例11.40实施例22.70实施例32.42对比例1216.40对比例216.21对比例3168.94对比例423.90对比例517.04空白对照组611.73
68.由表1可知，本发明制备得到的鲎血蓝蛋白含铜量明显降低，脱铜后的鲎血蛋白中铜的含量降低到≤1.40μg/g，符合gb15199-94《食品中铜限量卫生标准》的指标规定。
69.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。