一种氨基酸酰胺化果胶的制备方法与流程

1.本发明属于高分子化学技术领域，具体涉及一种氨基酸酰胺化果胶的制备方法，该方法以木瓜蛋白酶为催化剂，在超低温固液两相界面上催化氨基酸与果胶的接枝反应，生成氨基酸酰胺化果胶，从而改善果胶的功能特性，如粘度、凝胶性能等。


背景技术：

2.果胶是主要由d-半乳糖醛酸通过α-1,4-糖苷键连接而成的酸性杂多糖，其广泛的存在高等植物的细胞壁中，是一种天然、绿色、健康的天然高分子聚合物。天然果胶分子中d-半乳糖醛酸中的c-6羧基有许多是以甲酯化的形式存在。根据甲酯基含量的比例，果胶可以分为高酯果胶（酯化度》50%）和低酯果胶（酯化度《50%）。果胶已经通过fao/who食品添加剂联合委员会确认并宣布无毒，无每日添加量限制。所以在很多国家，其使用量可完全按照“最佳生产需要”进行添加。因此，果胶被广泛应用于食品、保健品、日用化工以及医药等领域。
3.近年来，随着现代食品工业的不断发展，果胶等天然多糖在食品中的应用越来越广泛。其中，果胶溶液属于亲水性胶体，具有一定的凝胶性能，但其凝胶能力受酸碱度、可溶性固形物含量、金属离子等因素的影响较大。高酯果胶主要通过氢键以及甲酯基团间的疏水作用形成凝胶，低酯果胶形成的凝胶则是两个果胶分子链间的羧基通过钙桥实现离子连接以及氢键的共同作用的结果。但无论是高酯果胶还是低酯果胶，都必须要要加入大量的糖作为吸水剂，才能形成凝胶，这成为了果胶在水凝胶领域中应用的一大障碍。
4.对果胶进行分子修饰也是改善其凝胶性能的一个有效方式。有大量研究表明，相较于普通果胶，酰胺化果胶更容易形成凝胶，且其形成的凝胶有着更高的强度和热稳定性。一般认为，酰胺化果胶的成胶机理与低酯果胶类似，都是由于钙离子的“桥联”作用将果胶链交联起来，但同时酰胺基团的引入导致形成氢键，使果胶链间的交联作用加强。也有研究指出，酰胺基之间的疏水相处作用和氢键都促进了其凝胶网络结构的稳定性。
5.目前，酰胺化果胶的制备方法主要是在碱性条件下通过加入氨水、氨醇体系或氨气处理对果胶进行改性。然而，这种方法容易产生β消除，产生双键破坏果胶链，降低果胶的分子量。也有学者利用氨基酸热合成的方法接枝到果胶分子上。其中，氨基酸作为构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质之一，它在抗体内具有特殊的生理功能，是生物体内不可缺少的营养成分之一。但是，氨基酸酰胺化果胶的热合成过程中会导致果胶的长链结构被破坏，解聚为短链果胶分子，这些短链果胶分子不但不利于凝胶，而且还会与长链果胶分子的凝胶结合区相互作用，从而影响果胶形成凝胶网络结构，导致制备的酰胺果胶的胶体粘度和凝胶能力较原始果胶弱。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于，针对目前传统的酰胺化果胶制备方法存在的一些缺陷，如易产生β消除、分子链断裂等，提出了一种以木瓜蛋白酶为催化剂，氨基酸为改性剂，在超低温
水/有机混合溶剂中制备酰胺化果胶的方案。
7.1）将木瓜蛋白酶溶解于磷酸缓冲液中，充入氮气并封口，低速磁力搅拌。然后，向酶溶液中加入激活剂（l-半胱氨酸盐盐酸）和螯合剂edta，低速搅拌混匀，将木瓜蛋白酶激活。
8.2）将氨基酸溶解于磷酸缓冲液中，并加入步骤1）中的酶液；称取一定量的果胶溶于磷酸缓冲液，然后将果胶溶液与氨基酸/酶溶液混合，并缓慢加入无水乙醇。充入氮气并封口，超低温下搅拌直至反应结束。
9.3）向反应体系中加入一定量无水乙醇，混匀后通过离心去除上清液，收集沉淀物加入三氯乙酸溶液搅拌，使酶彻底失活，然后通过流水透析去除杂质，再经冷冻干燥得氨基酸酰胺化果胶。
10.本发明的有益效果是：（1）相较于传统的酰胺化果胶制备方案，本发明提出的方案在低温下进行，不易造成果胶分子的β消除、分子链断裂等。
11.（2）相较于未处理果胶，通过本发明制备的果胶具有更大的粘度以及更好的凝胶性能和凝胶持水能力，可以在低钙浓度和无糖的条件下形成凝胶，可用扩大果胶凝胶条件，降低酸碱度、可溶性固形物含量、金属离子等因素对凝胶的影响。
12.（3）本发明制备的一种氨基酸酰胺化果胶，以氨基酸为改性剂、木瓜蛋白酶为催化剂，催化氨基酸接枝到果胶的分子链上、这些天然高分子活性成分无毒无害，安全可靠，且氨基酸作为构成生物体蛋白质并同生命活动有关的最基本的物质之一，它在抗体内具有特殊的生理功能，是生物体内不可缺少的营养成分之一。
13.附图说明：图1为氨基酸酰胺化果胶制备流程示意图。
14.图2实施例1中制得氨基酸酰胺化果胶的核磁共振图谱（1h谱）（lmp：原料果胶；lmp-glu：谷氨酸酰胺化果胶；lmp-gly：甘氨酸酰胺化果胶；lmp-lys：赖氨酸酰胺化果胶）。
15.图3实施例1中制得氨基酸酰胺化果胶的接枝率（lmp-glu：谷氨酸酰胺化果胶；lmp-gly：甘氨酸酰胺化果胶；lmp-lys：赖氨酸酰胺化果胶）。
16.图4实施例1中制得氨基酸酰胺化果胶的粘度（lmp：原料果胶；lmp-glu：谷氨酸酰胺化果胶；lmp-gly：甘氨酸酰胺化果胶；lmp-lys：赖氨酸酰胺化果胶）。
17.图5实施例1中制得氨基酸酰胺化果胶的凝胶特性（lmp：原料果胶；lmp-glu：谷氨酸酰胺化果胶；lmp-gly：甘氨酸酰胺化果胶；lmp-lys：赖氨酸酰胺化果胶）。
18.具体实施方式：为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
19.本发明实施例提供的氨基酸酰胺化果胶的制备方法，具体包括以下步骤：（1）将2 g商品木瓜蛋白酶溶于180 ml的磷酸缓冲液中（ph=7，0.05 mol/l），充入氮气并封口，在0℃下低速磁力搅拌30 min。
20.（2）向步骤（1）中的水溶液中加入20 ml的l-半胱氨酸盐盐酸水溶液（0.4mol/l）和0.04 g的乙二胺四乙酸，低速搅拌10 min。
21.（3）将10-20 mmol的氨基酸溶解于100 ml的磷酸缓冲液（ph=7，0.2 mol/l）中，并
加入50 ml步骤（2）所述溶液。
22.（4）将5 g果胶溶于150 ml的磷酸缓冲液中（ph=7，0.2 mol/l），然后将步骤（3）中所述溶液全部加入。
23.（5）向步骤（4）中所述溶液中加入100 ml无水乙醇，冲入氮气后封口，在在-30℃~0℃下低速搅拌24 h。
24.（6）向步骤（4）中所述溶液中加入200 ml无水乙醇，混匀后通过离心5 min（4000r/min），并去除上清液，收集沉淀物。
25.（7）向沉淀物中加入100ml三氯乙酸溶液（15％）并搅拌10 min，然后透析48-96 h去除杂质，透析后的溶液经冷冻干燥去除水分，收集固体粉末，即氨基酸酰胺化果胶。
26.测试表征方法（1）氨基酸接枝率测定用元素分析仪测定了酰胺果胶的接枝率；将适量的氨基酸酰胺化果胶样品称重，并放入预先准备好的锡盒中；用镊子将锡盒边缘密封并折叠，将样品中的空气排出；装有样品的锡盒被放置在裂解管中；在高温下，有机物与氧反应生成相应的氧化物；混合气体经载气洗涤，在色谱柱中相互分离。然后对c、h、n信号峰进行定量分析。氨基酸接枝率的计算按以下公式进行：氨基酸接枝率=[(6m
nan
)/(a
nmc-acmn)]
×
100%式中：mn为n的含量，mc为c的含量，an和ac分别为对应氨基酸每个分子中的n元素和c元素的个数。
[0027]
（2）粘度测定采用旋转粘度计测定氨基酸酰胺化果胶的动态粘度；将4 g氨基酸酰胺化果胶样品溶解于100 ml的磷酸盐缓冲液中（ph=5，0.5 mol/l）；在25 ℃恒温条件下，用旋转粘度计测量样品在不同转速（5、10、20、50、100 rpm）下的动态粘度。
[0028]
（3）氨基酸酰胺化果胶样品的凝胶性能将1 g氨基酸酰胺化果胶样品溶解于35 ml磷酸缓冲液中（ph=5，0.5 mol/l）；在80
°
c下水浴磁力搅拌15 min直到完全果胶溶解，然后加入15 ml的预热好的氯化钙溶液（2 g/l）磁力搅拌5min；取出冷却至室温，在4
°
c下放置24h，即可得到相应水凝胶；通过质构分析仪测定该水凝胶特性。
[0029]
实施例1（1）将2 g商品木瓜蛋白酶溶于180 ml的磷酸缓冲液中（ph=7，0.05 mol/l），充入氮气并封口，在0℃下低速磁力搅拌30 min。
[0030]
（2）向步骤（1）中的水溶液中加入20 ml的l-半胱氨酸盐盐酸水溶液（0.4mol/l）和0.04 g的乙二胺四乙酸，低速搅拌10 min。
[0031]
（3）将15 mmol的谷氨酸溶解于100 ml的磷酸缓冲液（ph=7，0.2 mol/l）中，并加入50 ml步骤（2）所述溶液。
[0032]
（4）将5 g果胶溶于150 ml的磷酸缓冲液中（ph=7，0.2 mol/l），然后将步骤（3）中所述溶液全部加入。
[0033]
（5）向步骤（4）中所述溶液中加入100 ml无水乙醇，冲入氮气后封口，在在-15℃下低速搅拌24 h。
[0034]
（6）向步骤（4）中所述溶液中加入200 ml无水乙醇，混匀后通过离心5 min（4000r/min），并去除上清液，收集沉淀物。
[0035]
（7）向沉淀物中加入100 ml三氯乙酸溶液（15％）并搅拌10 min，然后透析48-96 h去除杂质，透析后的溶液经冷冻干燥去除水分，收集固体粉末，即谷氨酸修饰果胶（lmp-glu）。
[0036]
将本方案中的谷氨酸分别替换为甘氨酸和赖氨酸，通过同样的方法可以制得甘氨酸修饰果胶（lmp-gly）和赖氨酸修饰果胶（lmp-lys）。
[0037]
图2为原料果胶及本方案制备的3种氨基酸酰胺化果胶的核磁共振图谱（1h谱），由图1可以看出，果胶分子（d-半乳糖醛酸）分子上的h元素的峰主要位于3.50-5.00 ppm之间；相较于原料果胶的图谱，谷氨酸修饰果胶、甘氨酸修饰果胶和赖氨酸修饰果胶的图谱在2.00-3.70 ppm之间出现了一个或多个吸收峰，分别对应了谷氨酸、甘氨酸和赖氨酸分子上的h元素，这表明这三种氨基酸确实接枝到果胶分子上了。
[0038]
图3为本方案制备的3种氨基酸酰胺化果胶的接枝率，分别为13.04%，9.32%和11.71%。
[0039]
图4为原料果胶及本方案制备的3种氨基酸酰胺化果胶的粘度；由图可以看出，相较于原料果胶，氨基酸酰胺化果胶的粘度获得了显著的提高，尤其是甘氨酸修饰果胶和赖氨酸修饰果胶。
[0040]
图5为原料果胶及本方案制备的3种氨基酸酰胺化果胶的凝胶特性；由图可以看出，原料果胶很难形成固态凝胶，而氨基酸酰胺化果胶可以形成稳定的固态凝胶。
[0041]
实施例2（1）将2 g商品木瓜蛋白酶溶于180 ml的磷酸缓冲液中（ph=7，0.05 mol/l），充入氮气并封口，在0℃下低速磁力搅拌30 min。
[0042]
（2）向步骤（1）中的水溶液中加入20 ml的l-半胱氨酸盐盐酸水溶液（0.4mol/l）和0.04 g的乙二胺四乙酸，低速搅拌10 min。
[0043]
（3）将15 mmol的甘氨酸溶解于100 ml的磷酸缓冲液（ph=7，0.2 mol/l）中，并加入50 ml步骤（2）所述溶液。
[0044]
（4）将5 g果胶溶于150 ml的磷酸缓冲液中（ph=7，0.2 mol/l），然后将步骤（3）中所述溶液全部加入。
[0045]
（5）向步骤（4）中所述溶液中加入100 ml无水乙醇，冲入氮气后封口，在在-5℃下低速搅拌24 h。
[0046]
（6）向步骤（4）中所述溶液中加入200 ml无水乙醇，混匀后通过离心5 min（4000r/min），并去除上清液，收集沉淀物。
[0047]
（7）向沉淀物中加入100 ml三氯乙酸溶液（15％）并搅拌10 min，然后透析48-96 h去除杂质，透析后的溶液经冷冻干燥去除水分，收集固体粉末。
[0048]
通过本方案制得的甘氨酸修饰果胶的接枝率为6.78%，表明随着反应温度的升高，酰胺化果胶的接枝率下降了。
[0049]
实施例3（1）将2 g商品木瓜蛋白酶溶于180 ml的磷酸缓冲液中（ph=7，0.05 mol/l），充入氮气并封口，在0℃下低速磁力搅拌30 min。
[0050]
（2）向步骤（1）中的水溶液中加入20 ml的l-半胱氨酸盐盐酸水溶液（0.4mol/l）和0.04 g的乙二胺四乙酸，低速搅拌10 min。
[0051]
（3）将30 mmol的甘氨酸溶解于100 ml的磷酸缓冲液（ph=7，0.2 mol/l）中，并加入50 ml步骤（2）所述溶液。
[0052]
（4）将5 g果胶溶于150 ml的磷酸缓冲液中（ph=7，0.2 mol/l），然后将步骤（3）中所述溶液全部加入。
[0053]
（5）向步骤（4）中所述溶液中加入100 ml无水乙醇，冲入氮气后封口，在在-15℃下低速搅拌24 h。
[0054]
（6）向步骤（4）中所述溶液中加入200 ml无水乙醇，混匀后通过离心5 min（4000r/min），并去除上清液，收集沉淀物。
[0055]
（7）向沉淀物中加入100 ml三氯乙酸溶液（15％）并搅拌10 min，然后透析48-96 h去除杂质，透析后的溶液经冷冻干燥去除水分，收集固体粉末，即甘氨酸修饰果胶。
[0056]
通过本方案制得的甘氨酸修饰果胶的接枝率为9.87%，表明甘氨酸添加量增加一倍，酰胺化果胶的接枝率仅小幅上升。