绿色木霉组蛋白去乙酰化酶及其编码基因和应用的制作方法

1.本发明属于微生物技术领域，具体涉及绿色木霉组蛋白去乙酰化酶及其编码基因和应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.木霉(trichoderma spp.)是一种多功能的丝状真菌，广泛存在于土壤和植物的根围、叶围、种子、球茎等生态环境中，其生防机制几乎包括了所有可能的机制，如代谢胞外酶、产生抗生性代谢产物、诱导植物抗性、水解酶与植物的防卫反应、保护酶与植物的抗病作用、毒性蛋白和协同拮抗作用等。因此，木霉已经被制成孢子粉、发酵液等多种制剂，广泛应用于农业生产中。
4.随着研究的广泛和深入，抗生性代谢产物在生物防治中的作用越来越受到注重，并成为植病生防菌筛选的重要指标。自1932年weindling发现胶霉毒素(gliotoxin)到现在，从木霉中分离到的抗生性代谢产物已超过了180种，早期的研究兴趣主要集中在植物病原菌的防治方面，近期的研究重点则是从中发现具有更广泛活性的化合物，并提高代谢物的产量。
5.染色质介导的调控在次级代谢产物生物合成基因簇的转录表达中起着重要作用，它通过表观遗传对组蛋白进行修饰如甲基化、组蛋白乙酰化、磷酸化、泛素化等改变染色质的构象，促进或抑制一些dna与转录因子的结合，来实现激活或沉默一些基因簇的表达。在丝状真菌表观遗传修饰中，组蛋白乙酰化研究最多，人们发现染色质组蛋白的乙酰化修饰与激活基因的表达密切相关，而一些次级代谢产物生物合成基因的表达也因为染色质乙酰化的程度影响其激活或沉默。组蛋白乙酰化和去乙酰化是基因转录调控的关键机制之一。
6.组蛋白去乙酰化酶hdacs可以分为3个家族，第一类和第二类分别是和酵母蛋白rpd3(reduced potassium dependency 3)、hda1(histone deacetylase 1)同源的酶类，第三类是和玉米hd2(histone deacetylase 2)相关的蛋白。有研究表明通过敲除里氏木霉组蛋白去乙酰化酶基因(histone deacetylase，hdac)显著提高了纤维素酶及其相关基因cbh1、egl1和xyr1的转录水平。
7.木霉体内代谢途径丰富，代谢产物繁多，其基因转录和表达受到复杂而严格的调控。目前及今后一段时间的研究方向是利用基因重组技术及基因敲除技术创制高产木霉菌株，或利用发酵调控手段来改变其代谢流等，以提高次级代谢产物的产量，增强其生物防治效能。


技术实现要素：

8.为了克服上述技术问题，本发明提供绿色木霉组蛋白去乙酰化酶及其编码基因和
应用。本发明从绿色木霉(trichoderma viride)tv-1511基因组中鉴定出一个组蛋白去乙酰化酶编码基因tvrpd3，通过在绿色木霉中敲除该编码基因构建相应工程菌发现，通过降低tvrpd3的表达，能够显著提高木霉基因组组蛋白乙酰化水平，改变了木霉菌株抗生性代谢产物种类和含量，增强了木霉菌株对多种植物病原菌的拮抗抑制能力，因此具有良好的实际应用之价值。
9.为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
10.本发明的第一个方面，提供绿色木霉组蛋白去乙酰化酶编码基因，命名为tvrpd3，所述编码基因具有(a1)-(a3)中任一所述核苷酸序列：
11.(a1)seq id no.1所示的核苷酸序列；
12.(a2)与(a1)互补的核苷酸序列；
13.(a3)与(a1)或(a2)所示的核苷酸序列具有≥90％(例如90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(完全)序列)一致性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
14.seq id no.1由2001个核苷酸组成，其中第1-1998为编码序列，第1999-2001位核苷酸转录为终止密码子终止肽链合成。
15.本发明的第二个方面，提供一种绿色木霉组蛋白去乙酰化酶，其氨基酸序列为如下(b1)-(b3)中任一项：
16.(b1)seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
17.(b2)将(b1)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同生物活性的由其衍生的蛋白质；
18.(b3)其它基因编码的与seq id no.2所示的氨基酸序列组成具有相似性达到50％以上并且具有seq id no.2所示的蛋白的活性的蛋白；
19.上述(b2)中，所述“一个或多个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加”为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
20.上述(b1)-(b3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
21.如上所述，本发明通过研究发现，通过降低tvrpd3的表达，能够显著提高木霉基因组组蛋白乙酰化水平，改变了木霉菌株抗生性代谢产物种类和含量，增强了木霉菌株对多种植物病原菌的拮抗抑制能力。
22.因此，本发明的第三个方面，提供一种木霉工程菌，所述木霉工程菌缺失上述tvrpd3基因或抑制上述tvrpd3基因的表达。
23.其中，所述木霉工程菌为绿色木霉工程菌。
24.本发明的第四个方面，提供上述木霉工程菌的构建方法，所述构建方法包括：通过同源重组的方法，敲除上述组蛋白乙酰化酶编码基因tvrpd3，即获得缺失组蛋白乙酰化酶编码基因tvrpd3的木霉工程菌。
25.具体的，所述构建方法包括如下步骤：
26.(1)基于tvrpd3基因5’侧翼序列(上游)、3’侧侧翼序列(下游)以及抗性基因hyg-r序列设计引物，通过融合pcr的方法构建tvrpd3的敲除基因片段；
27.(2)将构建好的敲除基因片段转入木霉原生质体；
28.(3)利用hyg-r抗性，进行菌落pcr筛选阳性突变子。
29.其中，所述步骤(1)中，所述引物包括如seq id no.3-8所示序列。
30.所述步骤(2)中，转入方法包括生物学上可接受的直接转化法(包括基因枪法、电击法、超声波法、显微注射法、peg法)或者间接转化法(包括dna病毒载体介导法、农杆菌介导法)；
31.优选的，利用peg-cacl2法；
32.优选的，所述木霉为绿色木霉，进一步优选的，所述绿色木霉为绿色木霉(trichoderma viride)tv-1511。
33.本发明的第五个方面，提供上述绿色木霉组蛋白去乙酰化酶编码基因、绿色木霉组蛋白去乙酰化酶和/或木霉工程菌在如下任意一种或多种中的应用：
34.c1)提高木霉对病原菌的拮抗抑制能力；
35.c2)改变木霉抗生性代谢产物种类和含量；
36.c3)提高木霉组蛋白乙酰化表达水平；
37.c4)提高木霉在农业生产中的应用效果。
38.其中，所述木霉优选为绿色木霉。
39.所述c1)应用中，所述病原菌包括植物病原菌，所述植物病原菌包括但不限于尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、灰葡萄孢菌、盾壳霉、立枯丝核菌、白绢病菌、层生镰刀菌、棒孢菌、禾谷镰孢菌。
40.所述c2)应用中，所述改变木霉抗生性代谢产物种类和含量具体表现为：增强木霉产木霉菌素、sorbicillinoids和monocillin i的能力，提高表达量。
41.所述c3)应用中，提高木霉组蛋白乙酰化表达水平具体包括提高提高木霉组蛋白h3和h4乙酰化表达水平。
42.所述c4)应用具体为增强对植物病害的防治效果，所述植物病害包括但不限于烟草黑胫病、小麦白粉病和番茄枯萎病。
43.上述一个或多个技术方案的有益技术效果在于：
44.上述技术方案在绿色木霉(trichoderma viride)tv-1511中鉴定到鉴定出一个组蛋白去乙酰化酶编码基因tvrpd3，通过在绿色木霉中敲除该编码基因构建相应木霉工程菌发现，通过降低tvrpd3的表达，能够显著提高木霉基因组组蛋白乙酰化水平，改变了木霉菌株抗生性代谢产物种类和含量，增强了木霉菌株对多种植物病原菌的拮抗抑制能力，能够促进木霉菌在农业生产中的应用，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
45.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
46.图1为本发明实施例中tvrpd3基因敲除片段构建示意图及验证；a为构建示意图，b为验证图。
47.图2为本发明实施例中tvrpd3敲除工程菌的qpcr和wb验证；其中，a-b为tvrpd3敲除工程菌tvrpd3转录水平表达图；c-d为tvrpd3敲除工程菌tvrpd3蛋白表达图。
48.图3为本发明实施例中绿色木霉tvrpd3敲除工程菌
△
tvrpd3中的组蛋白乙酰化修
饰水平的变化；其中，a为组蛋白h3乙酰化修饰水平变化图，b为组蛋白h4乙酰化修饰水平变化图。
49.图4为本发明实施例中绿色木霉tvrpd3敲除工程菌
△
tvrpd3与病原菌平板对峙实验。
50.图5为本发明实施例中绿色木霉tvrpd3敲除工程菌
△
tvrpd3发酵液对病原菌的抑制实验。
具体实施方式
51.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
52.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
53.如前所述，木霉体内代谢途径丰富，代谢产物繁多，其基因转录和表达受到复杂而严格的调控。目前及今后一段时间的研究方向是利用基因重组技术及基因敲除技术创制高产木霉菌株，或利用发酵调控手段来改变其代谢流等，以提高次级代谢产物的产量，增强其生物防治效能。
54.有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，从绿色木霉(trichoderma viride)tv-1511基因组中鉴定出一个组蛋白去乙酰化酶编码基因。通过对tv-1511开展全基因组测序和精细基因组图谱的绘制(genbank accession no.vcec00000000；bioproject:prjna543939；biosample:samn11791795)，得到了tvrpd3的详细基因信息。
55.其核苷酸序列如seq id no.1所示：
56.seq id no.1:
57.atggctgggctaggctccgtcgccttgaacgggtcctcaccaaagaaggttgcttatttttacgactcagatattggcaactacgcctacgtgactggtcatcccatgaagccgcaccgcatccgccttgctcacagccttatcatgcagtacggcctgtaccagaagatggagatttatcgcgcaaagcccgccacccggggcgagatgacgcagttccatacggatgactatattgacttccttcagaaagtaactcccgacaacatggattcatacatgcgtgagcaggggaaatacaacgtaggcgacgactgccctgtctttgacgggctattcgagttttgtggcatcagcgccggcggttcgatggagggcgcggcgcggctgaaccgccaaaagtgtgatattgccatcaactgggcggggggactgcaccatgccaagaagtgcgaggcgtcgggcttctgctacgtcaacgacatcgttcttggaatcctcgaactgctccgcttcatgaagcgcgtgctctacatcgacattgacgtgcaccacggcgatggagttgaagaagctttctacactactgaccgcgtcatgacggtgtctttccataagtatggcgagtactttcccggaaccggcgagttgagggacatcggcataggacaaggcaagaactacgccgtgaacttcccgctcagggatggcatcaccgacgaaagctacaagtccatcttcgaaccggtgattgagaatgtcatgaagtacttccagccggaagctgttgttctgcagtgcggcggtgactcgttgtctggagaccggctgggcgctttcaacctgagcatggacggccacgcaaactgcgtcaattttgtcaagtcgtttaatctgcccaccctggtactcggtg
gcggaggctataccatgcgaaacgtggccaggacctgggcctttgagactggcgtgctggtcgggcaagagatggacagggccctcccgtacaacgagtactacgagtattatgctcccgactttgagctcaacgtccgtgcgtcgaacatggaaaatagtaacagccgagaatatctggagaagattaccgccgccgtcatcgataacctcagacagacgggccccgcgcccagcgtccagatgcaggacgtccctcgcaagttcggcggtatgaccgatgaggaagaagccgaactcgacgaccttgacgaagatgaaaacaaggatgtgcgcatgacagagcatcgatgggacaagagggtcgagcacgagaatgagttcgagccttcagacgatgaggacatggccgccgccaacggcgtcacaccacgaaatggcaacaagcggtcgtacacggacttccggaaaggcgaaaatgaggacaactcggctagagcatccccagctgccgcaacagcggcggcagcctctacgaacgggggtgctgcggaggccacagccgcagaggattctcacgacataaatgatgacaccatcgaggattttgcagcagccggagagcaagacaaggcctctgccgacaagaaagagaaatccaaggagccagaaaaagaaaaggaggcagagaaggaaaacgaggaggagaaggaggaggagaagcaggaagacaaggtggatgacgacggcgacgttggaatggcggattccgagccgaaggaggaaatgaccatcaagaaggaggatgtcgagcccgaacctgcgcccgagcgagtcccgtccaagagcccagtcgtcgaggagaagacgcgtgaagagagcgagacgcccgttgcccctgcagctcctgccgaggagacggcggttcaagaggaggaaaagcctagcgaagccgaacccgagaaaaagtccccggaggcgtcgagtgacgccaaggagaaagaagatgagaccgccgatgctatggaggtcgaccaggagaaggacgaggaagagcccaagaaggcatcgacgccgccggcgtga
58.其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
59.seq id no.2:
60.maglgsvalngsspkkvayfydsdignyayvtghpmkphrirlahslimqyglyqkmeiyrakpatrgemtqfhtddyidflqkvtpdnmdsymreqgkynvgddcpvfdglfefcgisaggsmegaarlnrqkcdiainwagglhhakkceasgfcyvndivlgilellrfmkrvlyididvhhgdgveeafyttdrvmtvsfhkygeyfpgtgelrdigigqgknyavnfplrdgitdesyksifepvienvmkyfqpeavvlqcggdslsgdrlgafnlsmdghancvnfvksfnlptlvlggggytmrnvartwafetgvlvgqemdralpyneyyeyyapdfelnvrasnmensnsreylekitaavidnlrqtgpapsvqmqdvprkfggmtdeeeaelddldedenkdvrmtehrwdkrvehenefepsddedmaaangvtprngnkrsytdfrkgenednsaraspaaataaaastnggaaeataaedshdinddtiedfaaageqdkasadkkekskepekekeaekeneeekeeekqedkvdddgdvgmadsepkeemtikkedvepepapervpskspvveektreesetpvapaapaeetavqeeekpseaepekkspeassdakekedetadamevdqekdeeepkkastppa
61.本发明提供了敲除组蛋白乙酰化酶编码基因tvrpd3的方法，包括：通过同源重组的方法，敲除核苷酸序列如seq id no.1所示的组蛋白乙酰化酶编码基因tvrpd3，获得缺失了组蛋白乙酰化酶编码基因tvrpd3的重组木霉菌株。
62.上述构建方法获得的缺失tvrpd3基因的木霉工程菌(
△
tvrpd3)，检测不到tvrpd3的表达，实现了tvrpd3基因的完全敲除(图2)。
63.上述木霉工程菌(
△
tvrpd3)在与植物病原针菌的平板对峙实验中的应用及效果，步骤如下：将构建的木霉工程菌
△
tvrpd3以及原始菌株分别接种于含有pda培养基平板中的一侧，平板另一侧接种不同的植物病原真菌，28℃静置培养72h，观察抑菌效果。
64.上述平板对峙实验的结果显示，本发明构建的缺失tvrpd3基因的木霉工程菌(
△
tvrpd3)，与出发菌株相比，对不同病原菌均表现出了更强的抑制效果(图3)。
65.上述木霉工程菌(
△
tvrpd3)的发酵液在抑制植物病原针菌生长中的应用及效果，步骤如下：将构建的木霉工程菌
△
tvrpd3以及原始菌株分别接种于含pda培养基中，28℃，180rpm培养7天，收集其发酵液，0.22μm无菌滤膜过滤，滤液置于无菌离心管中备用。将10ml
无菌木霉菌发酵液与40ml pda培养基混合均匀后倒平板，待其冷却后在平板一侧接种不同的植物病原真菌，28℃静置培养72h，观察抑菌效果。
66.上述发酵液抑菌实验的结果显示，本发明构建的缺失tvrpd3基因的木霉工程菌(
△
tvrpd3)发酵液，与出发菌株相比，对不同病原菌均表现出了更强的抑制效果(图4)。
67.上述木霉工程菌(
△
tvrpd3)发酵液在田间病害防治中的应用，包括发酵液喷洒对小麦白粉病、烟草黑胫病、番茄枯萎病的田间防治效果。
68.上述田间病害防治实验的结果显示，本发明构建的缺失tvrpd3基因的木霉工程菌(
△
tvrpd3)发酵液喷施后，显著降低了小麦白粉病、烟草黑胫病和番茄枯萎病的发病率，减轻了病害(表1，2，3)。
69.上述木霉工程菌(
△
tvrpd3)在木霉抗生性次级代谢产物生产中的应用。
70.上述应用的结果显示，本发明构建的tvrpd3基因缺失木霉工程菌(
△
tvrpd3)能够增强木霉产木霉菌素、sorbicillinoids和monocillin i的能力，产量均比出发菌株显著提高(表4)。
71.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
72.生物材料来源：
73.绿色木霉(trichoderma viride)tv-1511为本实验室筛选鉴定的一株具有良好促生抗病能力的木霉菌株，其在中国普通微生物菌种保藏中心的保藏号为cgmcc no.16800；该菌株已在授权专利(cn110218659b)中公开。
74.大肠杆菌dh5α、t4连接酶试剂盒、高保真taq酶等购自于南京诺唯赞公司；
75.lb培养基、pda培养基和pd培养基等购自于青岛海博公司。
76.实施例1：绿色木霉tvrpd3基因缺失工程菌的构建
77.(1)敲除片段的构建
78.以绿色木霉tv-1511基因组dna为模板，扩增tvrpd3基因的上游片段和下游片段，敲除片段扩增引物分别为：上游片段扩增引物tvrpd3-up-f：gattcgggcgtctcgagatat(seq id no.3)和tvrpd3-up-r：gagagctaccttacatcaatatggcaagaggcgctttggcgca(seq id no.4)；下游片段扩增引物tvrpd3-down-f：ggtactatggcttagatggaatacccgcgattcaggaacttgttg(seq id no.5)和tvrpd3-down-r：tggatggatggcttgttg(seq id no.6)。以线性化的pbargpe1-hygro质粒为模板，扩增潮霉素抗性基因(hygr)，扩增引物为：hygr-f:gagagctaccttacatcaatatggc(seq id no.7)和hygr-r:ggtactatggcttagatggaataccc(seq id no.8)。通过融合pcr构建敲除片段(图1)，终浓度为423ng/μl，od
260/280
为1.91，共50μl。
79.(2)原生质体制备
80.接种绿色木霉tv-1511于pda平板，28℃培养10天后，产生大量新鲜分生孢子；用10ml生理盐水(0.9％nacl，0.05％tween-20)洗涤菌丝表面，经玻璃绒纸过滤，去除菌丝体得到孢子悬液；
81.在玻璃纸覆盖的pda平板上，取200μl孢子悬液涂布，28℃避光培养24h，使pda平板上的孢子萌发；
82.配制溶解酶溶液：取0.15g溶解酶(lysing enzyme，sigma：l1412)溶于20ml溶液i(1.2m d-sorbitol,0.1m kh2po4,ph 5.6)，0.2μm滤膜过滤除菌；
83.取出pda平板，将长有菌丝的纤维膜取出并反向贴在含有3-4ml裂解液的平板上，于28℃、100rpm条件下处理100min；
84.在无菌超净台下将平板中的纤维膜取出，确保大部分菌丝体保留在平板中，在此过程中可以用溶液a冲洗显微膜上残留的菌丝块，利用枪头反复吹吸液体中的菌丝块200次以上，充分释放内部的原生质体；
85.用装有4层纱布的1.5ml管过滤上述混合液，保留下层滤液并进行4℃离心，2000rpm离心10min，弃上清，保留底部的原生质体
86.加1ml溶液a，再次离心，弃上清；
87.加1ml 4℃预冷的溶液ii(1m sorbitol,50mm cacl2,10mm tris-hcl,ph 7.5)，冰上得到原生质体；用血球计数板观察计数，稀释原生质体至107个/ml。
88.(3)原生质体转化及突变子筛选
89.冰上放置15ml离心管，分别加入200μl原生质悬浮液、10μl纯化的pcr产物、50μl peg溶液(25％peg600,50mm cacl2,10mm tris-hcl,ph 7.5)；用枪头混匀，冰上放置20min；
90.加2ml peg溶液，轻轻混匀，常温下放置5min；加2ml溶液ii，轻轻混匀；
91.加2ml混合液涂布在覆盖层析纸的含1m蔗糖pda平板上，层析纸预先剪成条形；28℃避光培养24h；
92.将条形层析纸转导含抗生素的pda平板上，28℃避光培养36h，待条形层析纸边缘长出菌落后，挑取菌落，转接至新鲜的抗生素平板上，培养2天。
93.转化后，获得tv-1511的转化子18株。利用获得的tvrpd3缺失工程菌株
△
tvrpd3，采用荧光定量pcr的方法检测tvrpd3的转录表达，扩增引物为：tvrpd3-qpcr-f:caagttcggcggtatgac(seq id no.9)和tvrpd3-qpcr-r:ttctcctcctccttctcct(seq id no.10)；利用蛋白质免疫印迹wb的方法，检测tvrpd3的蛋白表达。结果显示，在tvrpd3缺失工程菌株中检测不到tvrpd3的转录表达(图2a，b)和蛋白表达(图2c，d)。
94.利用获得的tvrpd3缺失工程菌株检测组蛋白h3和h4的乙酰化水平。结果表明，与出发菌株相比，tvrpd3缺失突变体
△
tvrpd3中组蛋白h3和h4的乙酰化修饰水平明显上升(图3)。
95.实施例2：绿色木霉出发菌株及tvrpd3缺失工程菌与病原菌平板对峙实验
96.(1)无菌孢子的收集
97.接种绿色木霉出发菌株及tvrpd3缺失工程菌(
△
tvrpd3)于pda平板，28℃培养10天后，产生大量新鲜分生孢子；用10ml生理盐水(0.9％nacl，0.05％tween)洗涤菌丝表面，经玻璃绒纸过滤，去除菌丝体得到孢子悬液；用30％的甘油悬浮，充分混匀，分装到1.5ml离心管中，标记好名称和时间，-80℃冻存；取一管孢子液进行活菌计数，确定孢子液的浓度。
98.(2)病原菌平板对峙实验
99.先在pda平板上活化木霉出发菌株(wildtype)和突变工程菌(
△
tvrpd3)，28℃避光培养48-72h，使得出发菌株和突变工程菌木霉长势均一。同时在pda平板上活化不同植物病原菌株。
100.使用打孔器分别切取木霉菌菌饼(直径5mm)与病原菌菌饼(直径5mm)接种于直径为9cm装有pda的培养皿中，使2个菌饼直线距离为6cm，28℃暗培养3d，逐日观察抑制作用，测量病原菌菌落半径。
101.结果发现：缺失tvrpd3基因的木霉工程菌(
△
tvrpd3)，与出发菌株相比，对不同病原菌均表现出了更强的抑制效果(图3)。
102.实施例3：绿色木霉出发菌株及tvrpd3缺失工程菌发酵液平板抑菌实验
103.(1)木霉发酵液的制备
104.将200μl木霉出发菌株(wildtype)和突变工程菌(
△
tvrpd3)的孢子分别接种于pd液体培养基中，28℃，180rpm培养48h，通过2层无菌纱布过滤获得无菌的菌丝体。将等量的菌丝体转接于pd培养基中，180rpm，28℃培养7d，收集其发酵液，0.22μm无菌滤膜过滤，滤液置于无菌离心管中备用。
105.(2)发酵液平板抑菌实验
106.将10ml无菌木霉菌发酵液与40ml pda培养基混合均匀后倒平板，待其冷却后在平板一侧转接病原菌，28℃静置培养，逐日观察抑制作用，测量病原菌菌落半径。对照为10ml无菌pd培养基与40ml pda培养基均匀混合倒平板。
107.结果发现：缺失tvrpd3基因的木霉工程菌(
△
tvrpd3)发酵液，与出发菌株相比，对不同病原菌均表现出了更强的抑制效果(图4)。
108.实施例4：绿色木霉出发菌株及tvrpd3缺失工程菌发酵液喷施对几种植物病原菌的田间防治效果
109.试验设3个处理，包括清水对照(a)、绿色木霉tv-1511发酵液处理(b)、绿色木霉tv-1511
‑△
tvrpd3发酵液处理(c)。
110.烟草黑胫病田间抑制实验：各药剂均施用3次，第1次于移栽时施用，第2次于移栽后10d施用，第3次于移栽后20d施用。对植株全株进行喷雾，重点喷淋茎基部，使药液沿茎基部流渗到根际周围的表土里。移栽30d后观察是否出现药害，进行防效调查，每小区5点取样，每点选取30株。
111.小麦白粉病田间抑制实验：白粉病初发期采用手动喷雾器喷药。药后30d进行防效调查，每小区5点取样，每点选取30株。
112.番茄枯萎病田间抑制实验：选择番茄枯萎病发生严重且连作3年以上的田块。每个处理3次重复。在番茄6-7片真叶时进行移栽，移栽时采用孢子悬浮液灌根法接种番茄枯萎病病菌。移栽10d后进行第一次灌根处理，每棵苗300ml，间隔15d再灌根1次，共防治2次。30d后调查番茄植株枯萎病发病情况，计算防效。
113.病叶平均严重度(％)＝σ(各严重度级值
×
各级病叶数)/调查总病叶数
×
100；病情指数和防治效果按照以下公式计算：病情指数＝病叶率
×
病叶平均严重度
×
100，其中病叶率指发病叶片数占调查叶片总数的百分率；防治效果(％)＝(对照病叶平均严重度－处理病叶平均严重度)/对照病叶平均严重度
×
100。
114.结果发现：经缺失tvrpd3基因的木霉工程菌(
△
tvrpd3)发酵液喷施后，小麦白粉病、烟草黑胫病和番茄枯萎病的发病率显著降低，与出发菌株相比，防效效果分别提高了62.27％、57.45％和70.71％(表1，2，3)。
115.表1：绿色木霉tv-1511及tv-1511
‑△
tvrpd3工程菌发酵液对小麦白粉病的田间防治效果
[0116][0117]
表2：绿色木霉tv-1511及tv-1511
‑△
tvrpd3工程菌发酵液对烟草黑胫病的田间防治效果
[0118][0119]
表3：绿色木霉tv-1511及tv-1511
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tvrpd3工程菌发酵液对番茄枯萎病的田间防治效果
[0120][0121]
实施例5：绿色木霉出发菌株及tvrpd3缺失工程菌7天发酵液中几种抗生性次级代谢产物含量的检测
[0122]
将菌株接于含有pda培养基的摇瓶中，28℃下180rpm发酵7天。用滤纸过滤发酵液，然后经10,000rpm离心20min，乙酸乙酯((etoac)500m l)萃取，共3次，每次1h，用旋转蒸发仪37℃浓缩萃取液，并用无水硫酸钠干燥，制成发酵浸膏。将0.5g发酵浸膏用1ml乙醇溶解，3000rpm离心1min，取上清，用旋转蒸发仪浓缩，再用1ml的chcl3溶解，3000rpm离心1min，取上清，浓缩后用1m l的ch2cl2 0.5％meoh溶解，3000rpm离心1min，取上清，浓缩后用20μl ch2cl2 0.5％meoh溶解，液质联用仪(hplc/ms)测定分析。
[0123]
结果发现：tvrpd3基因缺失的木霉工程菌(
△
tvrpd3)能够增强木霉产木霉菌素、sorbicillinoids和monocillin i的能力，产量均比出发菌株显著提高。与出发菌株相比，
△
tvrpd3工程菌发酵液中木霉菌素、sorbicillinoids和monocillin i的产量分别提高了75.11％、95.63％和72.26％(表4)。
[0124]
表4：绿色木霉tv-1511及tv-1511
‑△
tvrpd3工程菌7天发酵液中几种抗生性次级代谢产物含量的检测
[0125][0126]
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。