通过非培养法对植物组织内生细菌进行定量检测的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种通过非培养法对植物组织内生细菌进行定量检测的方法。


背景技术：

2.植物内生细菌是指定植在植物组织内部或者分离自表面消毒的植物组织，并且对植物无害的可培养及不可培养的细菌。由于定植在组织内部，内生细菌与植物密切接触，与宿主植物的互作更加直接、高效，是植物微生物组的重要组成部分。研究发现，多种内生细菌对植物表现出益生作用，主要包括三个方面：促进植物氮、磷、离子等的营养吸收；通过调节生长素、细胞分裂素、乙烯等植物激素来调控植物的生长发育；帮助植物抵御生物胁迫和非生物胁迫。在抵御胁迫方面，dini-andreote通过对植物微生物组的研究认为，植物根部内生菌是植物防御病原菌的第二道微生态防线。
3.2015年，发表在《cell host&microbe》杂志上的一项研究表明，植物根部内生菌群的细胞密度为106cfu/g(鲜重)左右。2020年，发表在《nature》杂志上的一项研究显示，模式植物拟南芥的叶部内生细菌数量约为105cfu/g(鲜重)。此外，多项研究表明，种子内生细菌的数量在不同植物之间差异较大，从55cfu/g到107cfu/g不等。这些研究对植物不同组织的内生细菌进行了定量分析，但是，这些研究对植物内生细菌的定量都是基于对内生菌的分离培养然后菌落计数的可培养方法。然而，一方面，由于微生物分离培养技术的限制，一项研究很难保证将植物组织内部的可培养菌全部分离培养出来，这就导致培养法对植物内生菌定量存在误差；另一方面，自然界中，大多数细菌仍然是不可培养的，植物组织内部不可培养细菌的丰度仍然是未知的。因此，植物组织内部的实际含菌量(包括可培养和不可培养细菌)仍然是未知的。
4.了解植物组织内部的含菌量(包括可培养和不可培养细菌)将有助于认识植物全功能体中宿主与内生菌的互作，并为从内生菌角度开发植物营养、抗病、育种等的新策略提供理论基础。因此，急需一种基于非培养法的植物内生细菌定量分析方法，以从核酸水平上定量植物组织的含菌量(包括可培养和不可培养细菌)。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种通过非培养法对植物组织内生细菌进行定量检测的方法。
6.第一方面，本发明要求保护一种通过非培养法对植物组织内生细菌进行定量检测的方法。
7.本发明所要求保护的通过非培养法对植物组织内生细菌进行定量检测的方法，可包括如下步骤：
8.(a1)制作植物组织内生细菌含量测定的标准曲线：向从无菌愈伤组织中提取的基因组dna中添加不同拷贝数梯度的细菌dna(含有16s rrna基因)，得到系列细菌dna含量已
知的模板，然后以细菌16s rrna基因特异性引物对进行荧光定量pcr，根据扩增结果得到植物组织细菌含量与荧光定量pcr反应ct值的标准曲线。
9.(a2)植物组织内生细菌含量测定：将待测植物组织进行表面除菌后，提取总dna；以所述总dna为模板，采用(a1)中所述细菌16s rrna基因特异性引物对进行荧光定量pcr(除模板外其他条件均与步骤(a1)相同)，将荧光定量pcr反应所得的ct值代入(a1)所得标准曲线，进而得到所述待测植物组织中内生细菌含量。
10.进一步地，所述细菌16s rrna基因特异性引物对为由seq id no.1和seq id no.2所示的单链dna组成的引物对。
11.该引物对能够从植物材料中特异性扩增细菌的16s序列而不引入植物细胞器dna污染，从而实现对植物内生细菌的精准扩增。
12.在本发明的具体实施方式中，所述细菌dna为大肠杆菌基因组dna。所述愈伤组织为以水稻种子为材料诱导脱分化得到的愈伤组织。
13.在本发明的具体实施方式中，步骤(a1)中，在所述系列细菌dna含量已知的模板中，所述细菌dna的含量为10
3-107拷贝数。
14.所述标准曲线的两个坐标分别可为细菌细胞数的lg值和荧光定量pcr反应ct值。
15.在本发明的具体实施方式中，所述标准曲线具体为y＝-3.571x 37.68(r2＝0.9989)；其中，x为细菌细胞数的lg值；y为荧光定量pcr反应ct值。
16.在本发明的具体实施方式中，所述荧光定量pcr为sybr green荧光定量pcr。进行所述荧光定量pcr时，扩增体系中，来自于愈伤组织的基因组dna的含量为100ng；上下游引物等摩尔；反应程序为：预热(95℃3min)；变性(95℃15s)、退火(56℃30s)、链延伸(72℃30s)，44个循环；再预热(95℃30s)；生成熔解曲线(从65℃到95℃，间隔0.5℃)。
17.步骤(a2)中，将所述待测植物组织的荧光定量pcr反应所得的ct值代入(a1)所得标准曲线后，得到1μl所述植物组织(如根或叶)dna中的细菌含量n，植物组织绝对含菌量n(细菌细胞数/g(鲜重))＝n*(组织样品dna体积总数xμl/1μl))*(1g/植物组织dna提取所以组织样本的鲜重)。
18.第二方面，本发明要求保护一种制作植物组织内生细菌含量测定的标准曲线的方法。
19.本发明所要求保护的制作植物组织内生细菌含量测定的标准曲线的方法，可包括前文所述的步骤(a1)。
20.第三方面，本发明要求保护前文第二方面所述方法或利用前文第二方面所述方法制备得到的标准曲线在通过非培养法对植物组织内生细菌进行定量检测中的应用。
21.在上述各方面中，所述植物组织可为根或叶等。
22.在上述各方面中，所述植物可为水稻、玉米、小麦、高粱、大麦、拟南芥、花生、大豆、葡萄或番茄等多种植物。
23.本发明的创新点在于：1、基于核酸检测的非培养法检测，不需要对细菌进行分离培养，操作简便，省时高效；2、基于细菌16srrna基因的核酸检测覆盖到植物组织内部的全部细菌，包括可培养和不可培养细菌；3、提供了植物组织内生细菌核酸定量检测的标准曲线(含菌量与荧光定量pcr反应ct值的标准曲线)，使得相关研究可根据待检测样品的荧光定量pcr反应ct值代入该标准曲线直接得出待检测植物组织的含菌量。
24.其中，核酸检测采用的技术方法为荧光定量pcr，这是分子核酸检测的通用技术方法。核酸检测使用的引物对为发明专利zl201711057190.0中设计的细菌16s rrna基因特异性引物对：322f-1(5
’-
acgghccaractcctacggaa-3’)和796r(5
’-
ctaccmgggtatctaatcckg-3’)，该引物对能够从植物材料中特异性扩增细菌的16s序列而不引入植物细胞器dna污染，从而实现对植物内生细菌的精准扩增。植物内生细菌总量与荧光定量pcr反应ct值的标准曲线是基于在植物愈伤组织dna中添加不同拷贝数梯度的细菌(e.coli)dna，然后通过荧光定量pcr实验、根据实验数据得出的。并且根据引物对322f-1/796r的适用范围，该定量分析方法可应用于水稻、玉米、小麦、高粱、大麦、拟南芥、花生、大豆、葡萄及番茄等多种植物组织含菌量的测定。
附图说明
25.图1为植物组织内生细菌非培养法定量的标准曲线。
26.图2为水稻组织含菌量绝对定量结果。
27.图3为水稻组织含菌量相对定量结果。
具体实施方式
28.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
29.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
30.实施例1、植物愈伤组织总dna提取实验方案
31.1)取愈伤组织(以水稻种子为材料诱导脱分化得到的愈伤组织)块约50mg置于2ml离心管中，加液氮充分研磨。
32.2)加567μl te缓冲液(配方：溶剂为水，溶质为10mm tris，1mm edta；ph 8.0)，涡旋振荡，充分混匀。
33.3)加入30μl 10％(10g/100ml)sds和20μl的蛋白酶k(100μg/ml，amresco，solon，usa)(相当于0.76u蛋白酶k)，涡旋振荡，混匀。
34.4)加入2μl rnase(100mg/ml，天根生化科技公司，北京)，颠倒混匀于37℃温育1小时。
35.5)加入100μl 5m nacl，颠倒混匀后，加入80μl ctab/nacl溶液(配方：溶剂为水，溶质为0.7m nacl，10％(10g/100ml)ctab)，颠倒混匀后再65℃温育10min。
36.6)加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，体积比)，混匀，10000g离心5min，取上清。
37.7)加入等体积氯仿/异戊醇(1∶1，体积比)，混匀，10000g离心5min，取上清。
38.8)加入0.7倍体积的异丙醇，轻轻混匀，10000g离心5min，弃上清收集dna沉淀.
39.9)沉淀用1ml的70％(体积百分含量)乙醇洗涤后，10000g离心5min，弃上清。
40.10)晾干后加ddh2o溶解dna。
41.11)nanodrop测dna浓度后，加ddh2o稀释至100ng/μl，-20℃保存。
42.实施例2、制作植物组织绝对含菌量测定的标准曲线
43.愈伤组织由表面除菌后的植物组织在无菌环境下培养而来，因此，默认愈伤组织为无菌状态。本发明以愈伤组织(以水稻种子为材料诱导脱分化得到的愈伤组织)dna为基础、添加不同拷贝数梯度的e.coli基因组dna作为模板，然后以322f-1/796r引物对进行荧光定量pcr(qpcr)，并根据结果绘制植物组织含菌量与qpcr反应ct值的标准曲线。
44.322f-1：5
’-
acgghccaractcctacggaa-3’(seq id no.1)；
45.796r：5
’-
ctaccmgggtatctaatcckg-3’(seq id no.2)。
46.其中，h表示a或c或t；r表示g或a；m表示a或c；k表示g或t。
47.具体步骤如下：
48.1.e.coli dh5α菌株于lb平板上划线培养，37℃，12h；
49.2.从平板上挑取e.coli dh5α的单个菌落于lb液体培养基中，37℃培养8-12h，获得菌液；
50.3.检测菌液的od
600
，并用无菌lb培养基将菌液的od
600
调至1.0；
51.4.取1ml菌液离心(od
600
＝1.0时，1ml菌液含有109个细菌细胞)，13000g，1min，弃上清；
52.5.清洗：加入100μl ddh2o重悬后再次离心，13000g，1min，弃上清；
53.6.加入100μl ddh2o重悬菌体，沸水煮10min以释放e.coli基因组dna；
54.7.13000g，离心1min，取上清作为细菌dna模板(此时，1μl上清含有107个细菌细胞的基因组dna)；
55.8.上清用ddh2o 10倍梯度稀释：每10μl原液加90μl ddh2o稀释，依次得到含有107、106、105、104、103、102个细菌细胞的dna模板；
56.9.准备愈伤组织dna，并用ddh2o将dna浓度调至100ng/μl(同实施例1)；
57.10.1μl 100ng/μl的愈伤组织dna分别加1μl含有107、106、105、104、103、102个细菌细胞的上清dna作为模板，做qpcr，引物对为细菌16s rrna基因特异性引物对322f-1/796r(见上文)，每个浓度梯度均设置3个重复反应，并设置空对照(模板用等体积ddh2o代替)。其中，qpcr反应(bio rad)体系为：2
×
iq
tm sybr green mix 12.5μl；dna模板2μl(1μl愈伤组织dna 1μl细菌dna)；引物322f-1和796r各0.5μl(浓度为10μm)；ddh2o补足至25μl。qpcr反应程序为预热(95℃3min)；变性(95℃15s)、退火(56℃30s)、链延伸(72℃30s)，44个循环；再预热(95℃30s)；生成熔解曲线(从65℃到95℃，间隔0.5℃)。
58.11.以细菌细胞数的lg值和对应的qpcr反应ct值做标准曲线(放弃最后一个点，防止细菌细胞数过低时影响反应结果)，由此得到待测组织含菌量与qpcr反应反应ct值的标准曲线，如图1所示。标准曲线方程为：y＝-3.571x 37.68(r2＝0.9989)。标准曲线的qpcr原始数据如表1所示。
59.表1标准曲线的qpcr原始数据
[0060][0061]
实施例3、水稻组织内生细菌绝对含量测定
[0062]
实施例2得出的标准曲线可以通过对用于dna提取的植物组织称重进而计算出单位重量植物组织的含菌量，本发明以模式植物水稻为例，对水稻根、叶两种组织的内生细菌的绝对含量进行了测定。
[0063]
1)水稻组织表面除菌：先用75％(体积百分比)乙醇清洗5min，然后将所述水稻叶片转移至加有表面活性剂tween20(amresco，solon，usa)的无菌水中(ddh2o和tween20按1000:1的体积比加入，涡旋震荡2-5min)，最后用灭菌ddh2o清洗4遍。
[0064]
2)水稻组织dna提取方法同实施例1。
[0065]
3)qpcr反应(bio rad)体系为：2
×
iqtm sybr green mix 12.5μl；模板1μl(水稻根或叶组织dna)；引物322f-1和796r(具体序列见前文)各0.5μl(浓度为10μm)；ddh2o补足至25μl。qpcr反应程序为：预热(95℃3min)；变性(95℃15s)、退火(56℃30s)、链延伸(72℃30s)，44个循环；再预热(95℃30s)；生成熔解曲线(从65℃到95℃，间隔0.5℃)。
[0066]
4)将qpcr反应的ct值代入实施例2的标准曲线y＝-3.571x 37.68(r2＝0.9989)，得到1μl水稻组织(根或叶)dna中的细菌含量n，水稻根或叶组织含菌量n(细菌细胞数/g(鲜重))＝n*(组织样品dna体积总数xμl/1μl))*(1g/50mg)。
[0067]
水稻叶部和根部样本均作了6个重复，结果取各重复的均值。
[0068]
最终得到水稻叶部、根部内生细菌的细胞密度分别约为106/g(鲜重)、109/g(鲜重)，如图2所示。
[0069]
根据引物对322f-1/796r的适用范围(发明专利zl 201711057190.0中分析得出)，该定量分析方法可应用于水稻、玉米、小麦、高粱、大麦、拟南芥、花生、大豆、葡萄及番茄等多种植物组织含菌量的测定，具体地，将本实施例中的水稻替换为其它植物即可。
[0070]
实施例4、水稻组织内生细菌相对含量测定
[0071]
引物对由于能够特异性扩增细菌16s rrna基因，除用于对植物内生细菌绝对含量的测定，还可用于植物内生细菌相对含量的测定(以植物特异性基因为内参基因)。
[0072]
1)水稻组织的表面除菌、dna提取同实施例3。
[0073]
2)qpcr反应(bio rad)体系为：2
×
iqtm sybr green mix 12.5μl；模板1μl(水稻根或叶组织dna)；水稻内参引物对osactin-f和osactin-r、细菌引物对322f-1和796r(具体序列见前文)各0.5μl(浓度为10μm)；ddh2o补足至25μl。
[0074]
osactin-f：5
’-
atccttgtatgctagcggtcga-3’；
[0075]
osactin-r：5
’-
atccaaccggaggatagcatg-3’。
[0076]
qpcr反应程序为：预热(95℃3min)；变性(95℃15s)、退火(56℃30s)、链延伸(72℃30s)44个循环；再预热(95℃30s)；生成熔解曲线(从65℃到95℃，间隔0.5℃)。
[0077]
3)根据qpcr反应的ct值计算水稻组织(根或叶)的相对含菌量＝2-(ct(osactin)-ct(322f-a/796r))
。
[0078]
水稻叶部和根部样本均作了6个重复，结果取各重复的均值。
[0079]
最终得到水稻叶部、根部内生细菌与水稻细胞数的比值分别约为0.006、12.56，如图3所示。
[0080]
将osactin的引物对替换为其它植物的特异性引物对，采用上述方法即可得到其它植物组织内生细菌的相对含量(内生细菌与植物细胞数的比值)。
[0081]
实施例3和实施例4的结果表明，不论绝对定量还是相对定量，水稻叶部内生细菌均比根部内生细菌低3个数量级，这一一致性印证了通过标准曲线检测植物组织内生细菌绝对含量的准确性。
[0082]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。