一种双网络水凝胶及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于组织工程材料制备技术领域，涉及一种双网络水凝胶及其制备方法与应用，具体涉及一种三维的干细胞的培养，并促使所述干细胞进行增殖和分化的、双网络水凝胶及其制备方法与应用。


背景技术：

2.疾病、遗传和衰老等造成的组织、器官缺损和功能障碍是人类健康所面临的主要危害之一，也是人类疾病和死亡最主要的缘由。为了从根本上解决组织、器官缺损和功能障碍这一问题，人们提出了组织工程这一概念，它是指运用工程学和生命科学的原理和方法，研究正常和病理条件下组织结构与功能的关系，开发生物替代品，修复、维持和改善组织功能。随着近几十年的发展，组织工程技术超越了传统的“拆东墙补西墙”疗法，使组织损伤的修复步入“重建、再生、替代”组织器官的新时代，成为了继药物治疗和手术治疗之后的第三种有效治疗途径。
3.组织工程主要方法是将功能相关的活细胞接种于细胞外基质替代物上，这种替代物能为细胞提供一个空间结构，细胞能够在上面生长，通过体外培养一定时间后形成细胞与替代物的复合物，然后将得到的复合物移植到体内受损组织处，修复受损组织。近年来，组织工程的研究内容主要集中在开发研究生物材料、生长因子、种子细胞培养及细胞与支架材料的复合及塑形等方面。
4.目前组织工程中细胞接种的常用方法包括：细胞接种于支架材料上和细胞与材料共混成水凝胶支架，其中细胞与材料共混能更好的控制细胞的分布，而且在细胞粘附、增殖、迁移与立体结构方面有诸多优势；此外通过控制共混水凝胶支架的形状可以提高组织修复的精确度和准确度。但为了确保细胞的活性通常需要寻找具有较高生物相容性的材料。
5.干细胞具有高增殖率、多分化潜能以及低免疫原性等特性，是最理想的组织工程用种子细胞。组织工程常用的包埋细胞的水凝胶材料包括明胶、胶原、透明质酸、壳聚糖、海藻酸盐、聚乳酸、聚乙二醇、聚己内酯等。高分子化合物具有较多的活性官能团，可以对其进行化学修饰，从而用不同的方法形成水凝胶，另外，通过调节水凝胶支架的性质，例如在水凝胶支架中掺杂细胞外基质，可能会增加细胞的黏附和趋化宿主细胞的迁移，同时也可能会增加种子细胞的分化能力。但多数人工合成高分子材料生物相容性低，降解不彻底，而天然的高分子材料降解速率较快，机械性能较差；因此，寻找生物相容性好以及可降解的材料作为三维培养细胞的支架尤为重要。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的在于提供一种双网络水凝胶及其制备方法与应用，以克服现有技术的不足。
7.为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
8.本发明实施例提供了一种双网络水凝胶的制备方法，其包括：
9.(1)提供丝素蛋白；
10.(2)使羟丙基甲基纤维素与甲基丙烯酸酐反应，获得羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物；
11.(3)采用超声处理诱导所述丝素蛋白形成β-折叠，之后与所述羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物混合发生光聚合反应，获得双网络水凝胶。
12.本发明实施例还提供了前述方法制备的双网络水凝胶，所述双网络水凝胶的压缩模量为20～80kpa，并具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为100～300μm。
13.本发明实施例还提供了一种双网络水凝胶的3d打印生物墨水的制备方法，其包括：
14.提供前述的丝素蛋白和羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物；
15.采用超声处理诱导所述丝素蛋白形成β-折叠，之后与所述羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物混合，获得双网络水凝胶的3d打印生物墨水。
16.本发明实施例还提供了前述方法制备的双网络水凝胶的3d打印生物墨水。
17.本发明实施例还提供了一种双网络水凝胶的3d打印制备方法，其包括：
18.提供前述的双网络水凝胶的3d打印生物墨水；
19.采用喷头挤出3d打印法在光照下进行3d打印，获得双网络水凝胶。
20.本发明实施例还提供了由前述3d打印方法备的双网络水凝胶，所述双网络水凝胶的压缩模量为20～80kpa，并具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为100～300μm。
21.本发明实施例还提供了前双网络水凝胶于细胞培养或组织工程领域中的用途。
22.本发明实施例还提供了一种三维细胞培养载体，其包含前述的双网络水凝胶。
23.本发明实施例还提供了一种细胞培养方法，其包括：
24.以前述的双网络水凝胶作为三维细胞培养载体进行细胞的培养，并促使所述细胞进行增殖和分化。
25.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
26.(1)本发明提供的基于丝素蛋白和功能化纤维素体系构建的双网络水凝胶，同时将其应用于细胞的增殖与软骨分化研究，实现了与细胞共混打印与凝胶化。首先，将甲基丙烯酸酯基团修饰到羟丙基甲基纤维素上，获得羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物，然后将丝素蛋白与羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物混合，在光引发下和超声诱导下制备得到丝素蛋白/纤维素双网络水凝胶；
27.(2)本发明提供的双网络水凝胶是一种水凝胶，结合了物理超声和光化学反应两种作用方式，其优点在于光聚合反应快速进行的特性使得水凝胶体系迅速固化；然后，随着时间的延长，丝素蛋白的β-折叠逐渐形成以提高凝胶的机械性能，同时制备方法简单，可大量制备；
28.(3)本发明提供的双网络水凝胶，将常用的天然材料纤维素功能化修饰，获得羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物，将天然蚕茧来源的丝素蛋白进行超声，然后将功能化纤维素溶液与超声诱导后的丝素蛋白溶液混合形成3d打印生物墨水，并包封干细胞，进行3d打印，可以制造出有三维形状的干细胞共混水凝胶，丝素蛋白与功能化纤维素相结合，一方面显著提升了该水凝胶体系的固化速度，另一方面增强了该水凝胶体系的机械性能；本
发明通过超声光固化或3d打印所获的双网络水凝胶的固化时间短、内部孔隙分布均匀、生物相容性好、毒性低，其内部孔径为100～300μm，适合营养物质和细胞代谢废物的流通，为干细胞的存活和增殖提供良好的三维支撑生存环境；同时所述制备的双网络水凝胶与干细胞共培养的方法，通过加入促软骨分化生长因子，可有效促进干细胞分化成软骨细胞以构建软骨组织修复物。
附图说明
29.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
30.图1是本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶的制备示意图；
31.图2是本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶的sem扫描图；
32.图3a-3c是本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶的机械性能图；
33.图4是本发明一典型实施例中所获可打印双网络水凝胶的拉曼光谱图；
34.图5a-5d是本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶的3d打印效果图；
35.图6a-6b分别是骨髓间充质干细胞在本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶中的增殖图和生长共聚焦图。
36.图7a-7c是骨髓间充质干细胞在本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶中于体外培养条件下向软骨细胞分化的mrna表达水平图；
37.图8是骨髓间充质干细胞在本发明一典型实施例中所获双网络水凝胶中于体外培养2周条件下向软骨细胞分化的sem扫描图。
具体实施方式
38.鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.本发明实施例的一个方面提供了一种双网络水凝胶的制备方法，其包括：
40.(1)提供丝素蛋白；
41.(2)使羟丙基甲基纤维素与甲基丙烯酸酐反应，获得羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物；
42.(3)采用超声处理诱导所述丝素蛋白形成β-折叠，之后与所述羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物混合发生光聚合反应，获得双网络水凝胶。
43.在一些较为具体的实施方案中，步骤(1)具体包括：使包含天然丝素蛋白与中性盐溶液的第一混合反应体系于40～50℃反应1～2h，再经后处理，获得纯的可溶于水的丝素蛋白。
44.进一步的，步骤(1)还包括：在所述的反应结束后，将所获反应混合物透析3～4天，其中采用的透析袋的截留分子量为7～14kda，之后冷冻干燥，获得纯的丝素蛋白。
45.进一步的，步骤(1)具体包括：将天然蚕茧脱胶，获得所述的天然丝素蛋白。
46.在一些优选的实施方案中，步骤(1)具体包括：将挑选干净的蚕茧加入0.02mol/l的na2co3溶液中于100℃水浴锅中煮沸2遍，每次至少40min，用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶，60℃烘箱过夜干燥，随后将干燥后的丝素蛋白放入中性盐溶液中形成第一混合体系进行所述的反应，并维持反应体系的温度为40～50℃。
47.进一步的，所述中性盐溶液所含盐包括硝酸镁、硝酸钙、氯化钙、溴化锂中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
48.进一步的，所述中性盐溶液的浓度为9～10mol/l。
49.进一步的，所述天然丝素蛋白与中性盐溶液的质量体积比为1～3:10w/v％。
50.在一些较为具体的实施方案中，步骤(2)具体包括：使包含羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸酐、4-二甲基氨基吡啶的第二混合反应体系于10～50℃反应12～30h，获得所述羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物。
51.进一步的，步骤(2)还包括：在所述反应结束后，对所获反应混合物进行沉淀、纯化、离心、透析、冷冻干燥处理，获得所述羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物。
52.更进一步的，所述沉淀处理采用的沉淀剂包括乙醚或丙酮，且不限于此。
53.进一步的，所述羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸酐与4-二甲基氨基吡啶的质量比为1:(0.06～0.2):(0.06～0.2)。
54.在一些优选的实施方案中，步骤(2)还包括：在所述的反应结束后，将所获反应混合物与无水乙醚按照1:10～20的体积比混合，8000rpm离心5min收集沉淀，按照质量：体积比1:50～100将沉淀物溶于去离子水，装入7～14kda的透析袋，每2～4h换水，透析3天，之后将所得溶液与-80℃冷冻过夜，于-40～-60℃真空干燥3天，获得纯的羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物。
55.在一些较为具体的实施方案中，所述羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物的结构式如式(ⅰ)所示：
[0056][0057]
其中，r选自h、ch3、中的任一者，n为80～100，m为1～3。
[0058]
在一些较为具体的实施方案中，步骤(3)具体包括：
[0059]
将丝素蛋白与磷酸缓冲盐溶液混合，形成丝素蛋白溶液；
[0060]
对所述丝素蛋白溶液进行超声处理，诱导丝素蛋白形成β-折叠；
[0061]
以及，将所述超声处理后的丝素蛋白溶液与羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚
合物、光引发剂混合发生光聚合反应，获得所述双网络水凝胶。
[0062]
在一些较为优选的实施方案中，步骤(3)具体包括：将所述丝素蛋白溶液中丝素蛋白溶解于pbs中形成浓度为5～15w/v％的溶液，然后进行超声诱导形成β-折叠结构。
[0063]
进一步的，步骤(3)还包括：快速地将丝素蛋白溶液与羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物溶液按照体积比1:0.1～10混合均匀。
[0064]
进一步的，所述丝素蛋白溶液中丝素蛋白的浓度为5～15w/v％。
[0065]
进一步的，所述超声处理的条件为：超声功率为180～240w，超声时间为2～5s，暂停2～5s，循环6～10次；用于混合的羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物的浓度为1～5w/v％；加入光引发剂的浓度为0.15～1w/v％
[0066]
进一步的，所述光引发剂包括芳基次膦酸锂(lap)或i2959，优选为芳基次膦酸锂，且不限于此。
[0067]
进一步的，所述光聚合反应使用的波长为350～410nm，光照时间为5-10s，优选为5～8s。
[0068]
在一些更为具体的实施例之中，所述双网络水凝胶的制备方法包括以下步骤：
[0069]
(1)至少将天然蚕茧脱胶，然后与溴化锂混合反应获得再生丝素蛋白；
[0070]
(2)至少将羟丙基甲基纤维素和甲基丙烯酸酐混合反应，获得羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物；
[0071]
(3)至少将丝素蛋白溶液超声诱导形成β-折叠后与羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物溶液混合，并加入光引发剂芳基次膦酸锂；
[0072]
(4)至少将上述溶液于365nm光下照射，并于37℃放置，获得双网络水凝胶。
[0073]
本发明实施例的另一个方面还提供了前述方法制备的双网络水凝胶，所述双网络水凝胶的压缩模量为20～80kpa，并具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为100～300μm，优选为150～250μm。
[0074]
本发明实施例的另一个方面还提供了一种双网络水凝胶的3d打印生物墨水的制备方法，其包括：
[0075]
提供前述的丝素蛋白和羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物；
[0076]
采用超声处理诱导所述丝素蛋白形成β-折叠，之后与所述羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物混合，获得双网络水凝胶的3d打印生物墨水。
[0077]
在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法包括：
[0078]
将丝素蛋白与磷酸缓冲盐溶液混合，形成丝素蛋白溶液；
[0079]
对所述丝素蛋白溶液进行超声处理，诱导丝素蛋白形成β-折叠；
[0080]
以及，将所述超声处理后的丝素蛋白溶液与羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物、光引发剂混合，获得所述双网络水凝胶的3d打印生物墨水。
[0081]
进一步的，所述丝素蛋白溶液中丝素蛋白的浓度为5～15w/v％。
[0082]
进一步的，所述超声处理的条件为：超声功率为180～240w，超声时间为2～5s，暂停2～5s，循环6～10次；用于混合的羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物的浓度为1～5w/v％；加入光引发剂的浓度为0.15～1w/v％。
[0083]
进一步的，所述光引发剂包括芳基次膦酸锂(lap)或i2959，优选为芳基次膦酸锂，且不限于此。
[0084]
在一些较为具体的实施方案中，所述超声处理后获得的3d打印生物墨水在20～60min内进行3d打印，优选为30～40min。
[0085]
在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法还包括：将所述超声处理后的丝素蛋白溶液与羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物、光引发剂、生长因子和细胞混合，获得所述双网络水凝胶的3d打印生物墨水。
[0086]
进一步的，所述细胞包括干细胞，优选为骨髓间充质干细胞，且不限于此。
[0087]
进一步的，所述生长因子包括促软骨分化生长因子，优选为转化生长因子-β1(tgf-β1)转化生长因子-β(tgf-β3)，且不限于此。
[0088]
本发明实施例的另一个方面还提供了前述方法制备的双网络水凝胶的3d打印生物墨水。
[0089]
本发明实施例的另一个方面还提供了一种双网络水凝胶的3d打印制备方法，其包括：
[0090]
提供前述的双网络水凝胶的3d打印生物墨水；
[0091]
采用喷头挤出3d打印法在光照下进行3d打印，获得双网络水凝胶。
[0092]
进一步的，所述喷头挤出3d打印法采用的工艺条件包括：打印喷头的内径为150～250μm，气动压力为50～80kpa，打印速度为15～25mm/s，打印线条间的距离为0.5～1.5mm。
[0093]
进一步的，所述光照处理采用光的波长为365～410nm，光照强度为1.5～2.5mw/cm2，对3d打印的每层线条的照射时间为5～10s，优选为5～8s。
[0094]
在一些更为具体的实施例之中，所述双网络水凝胶的3d打印制备方法包括以下步骤：
[0095]
(1)至少将天然蚕茧脱胶，然后与溴化锂混合反应获得再生丝素蛋白；
[0096]
(2)至少将羟丙基甲基纤维素和甲基丙烯酸酐混合反应，获得羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物；
[0097]
(3)至少将丝素蛋白溶液超声诱导形成β-折叠后与羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物溶液混合，并加入光引发剂芳基次膦酸锂形成双网络水凝胶的3d打印生物墨水；
[0098]
(4)将上述双网络水凝胶的3d打印生物墨水进行3d生物打印，获得双网络水凝胶即细胞支架。
[0099]
本发明实施例的另一个方面还提供了前述3d打印方法备的双网络水凝胶，所述双网络水凝胶的压缩模量为20～80kpa，并具有多孔结构，其中所含孔洞的孔径为100～300μm，优选为150～250μm。
[0100]
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的双网络水凝胶于细胞培养或组织工程领域中的用途。
[0101]
本发明实施例的另一个方面还提供了一种三维细胞培养载体，其包含前述的双网络水凝胶。
[0102]
本发明实施例的另一个方面还提供了一种细胞培养方法，其包括：
[0103]
以前述的双网络水凝胶作为三维细胞培养载体进行细胞的培养，并促使所述细胞进行增殖和分化。
[0104]
进一步的，所述细胞为骨髓间充质干细胞，且不限于此。
[0105]
进一步的，所述细胞于所述双网络水凝胶上的负载量为100～1000万个/ml。
[0106]
进一步的，所述细胞培养方法包括：将前述的双网络水凝胶作为三维细胞培养载体进行细胞的培养，并放置于软骨诱导分化培养基中培养7～28天。
[0107]
藉由上述技术方案，本发明将常用的羟丙基甲基纤维素进行功能化，获得羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物，将天然蚕茧来源的丝素蛋白进行超声，然后与羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物混合，加入光引发剂芳基次膦酸锂，之后与细胞共混，可以3d打印成各种形状。将天然丝素与羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯混合，一方面提供了两重水凝胶网络，能显著提升该水凝胶的机械性能，另一方面由于羟丙基甲基纤维素的打印性能较好，混合物具有很好的可打印性，并且以此法获得的水凝胶固化时间短、内部孔隙分布均匀、生物相容性好、毒性低，其内部孔径100～300μm，适合营养物质和细胞代谢废物的流通，为干细胞的存活和增殖提供良好的三维支撑生存环境。同时，所述的生物墨水可以与干细胞共同打印成各种形状，同时加入生长因子，可以调控干细胞向软骨方向分化，有效促进软骨修复，同时制备方法简单，可大量制备。
[0108]
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0109]
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
[0110]
实施例1
[0111]
步骤一：将挑选干净的蚕茧撕碎，加入0.02mol/l na2co3溶液中于95℃水浴中煮沸2遍，每次至少30min，用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶，60℃烘箱过夜干燥，随后将干燥后的丝素蛋白放入libr溶液中形成第一混合反应体系进行所述的反应，并维持反应体系的温度为40℃，反应1h，其中，libr溶液浓度为9.3mol/l，丝素蛋白与libr溶液的质量：体积比为1:10；步骤一反应结束后用7～14kda截留量透析除去杂质，透析3天，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得纯的丝素蛋白(sf)；
[0112]
步骤二：将1g羟丙基甲基纤维素(hpmc，400mpa
·
s)溶于100ml无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，不停搅拌,待hpmc溶解之后，在溶液中加入60μl(对应0.375mmol)的甲基丙烯酸酐(ma)以及0.2g的4-二甲基氨基吡啶(dmap)，在室温下反应16h；
[0113]
步骤二反应结束后，将混合物滴加入过量乙醚中沉淀，混合物体积与乙醚体积比为1:10，8000rpm离心5min，收集生成的沉淀。收集的沉淀溶解在dmf中，再在过量的乙醚中沉淀两次。再将沉淀溶解于去离子水中，用7～14kda截留量透析除去杂质，透析3天。最后将产物置于-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得纯的羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物，记为hpmc-ma；
[0114]
步骤三：将制备的sf溶解于pbs中，制成8wt％的溶液备用；将hpmc-ma溶解于pbs中，制成5wt％的溶液备用。冰浴中将sf溶液用超声发生仪处理(超声探头直径为3mm，240w功率，超声时间为5s，暂停5s，循环8次)，与hpmc-ma溶液按体积比15:8混合，同时加入光引发剂芳基次膦酸锂(lap，终浓度为0.15wt％)；
[0115]
步骤三结束后，在20min内将溶液转移至模具中，365nm的光固化8s成型，再于37℃放置30min，获得二次固化的双网络水凝胶。
[0116]
实施例2
[0117]
步骤一：将挑选干净的蚕茧撕碎，加入0.02mol/l na2co3溶液中于95℃水浴中煮沸2遍，每次至少30min，用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶，60℃烘箱过夜干燥，随后将干燥后的丝素蛋白放入硝酸钙溶液中形成第一混合反应体系进行所述的反应，并维持反应体系的温度为40℃，反应2h，其中，硝酸钙溶液浓度为10mol/l，丝素蛋白与libr溶液的质量：体积比为1:10；步骤一反应结束后用7～14kda截留量透析除去杂质，透析3天，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得纯的sf；
[0118]
步骤二：将1g hpmc(400mpa
·
s)溶于100ml无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，不停搅拌，待hpmc溶解之后，在溶液中加入120μl(对应0.75mmol)的甲基丙烯酸酐(ma)以及0.2g的4-二甲基氨基吡啶(dmap)，于50℃反应12h；
[0119]
步骤二反应结束后，将混合物滴加入过量乙醚中沉淀，混合物体积与乙醚体积比为1:10，8000rpm离心5min，收集生成的沉淀。收集的沉淀溶解在dmf中，再在过量的乙醚中沉淀两次。再将沉淀溶解于去离子水中，用7～14kda截留量透析除去杂质，透析3天。最后将产物置于-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得纯的羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物，记为hpmc-ma；
[0120]
步骤三：将制备的sf溶解于pbs中，制成8wt％的溶液备用；将hpmc-ma溶解于pbs中，制成5wt％的溶液备用。冰浴中将sf溶液用超声发生仪处理(超声探头直径为3mm，180w功率，超声时间为5s，暂停5s，循环6次)，与hpmc-ma溶液按体积比15:8混合，同时加入光引发剂芳基次膦酸锂(lap，终浓度为0.15wt％)。
[0121]
步骤三结束后，在20min内将溶液转移至模具中，365nm的光固化5s成型，再于37℃放置30min，获得二次固化的双网络水凝胶。
[0122]
实施例3
[0123]
步骤一：将挑选干净的蚕茧撕碎，加入0.02mol/l na2co3溶液中于95℃水浴中煮沸2遍，每次至少30min，用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶，60℃烘箱过夜干燥，随后将干燥后的丝素蛋白放入氯化钙溶液中形成第一混合反应体系进行所述的反应，并维持反应体系的温度为50℃，反应1h，其中，氯化钙溶液浓度为10mol/l，丝素蛋白与libr溶液的质量：体积比为1:10；
[0124]
步骤一反应结束后用7～14kda截留量透析除去杂质，透析4天，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得纯的sf；
[0125]
步骤二：将1g hpmc(400mpa
·
s)溶于100ml无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，不停搅拌。待hpmc溶解之后，在溶液中加入180μl(对应1.125mmol)的甲基丙烯酸酐(ma)以及0.2g的4-二甲基氨基吡啶(dmap)，于10℃反应30h；
[0126]
步骤二反应结束后，将混合物滴加入过量乙醚中沉淀，混合物体积与乙醚体积比为1:10，8000rpm离心5min，收集生成的沉淀。收集的沉淀溶解在dmf中，再在过量的乙醚中沉淀两次。再将沉淀溶解于去离子水中，用7～14kda截留量透析除去杂质，透析3天。最后将产物置于-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获纯羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物，记为hpmc-ma；
[0127]
步骤三：将制备的sf溶解于pbs中，制成8wt％的溶液备用；将hpmc-ma溶解于pbs中，制成5wt％的溶液备用，冰浴中将sf溶液用超声发生仪处理，(超声探头直径为3mm，240w
功率，超声时间为2s，暂停2s，循环10次)，与hpmc-ma溶液按体积比15:8混合，同时加入光引发剂芳基次膦酸锂(lap，终浓度为0.15wt％)；
[0128]
步骤三结束后，在20min内将溶液转移至模具中，365nm的光固化10s成型，再于37℃放置30min，获得二次固化的双网络水凝胶。
[0129]
实施例4
[0130]
步骤一：将挑选干净的蚕茧撕碎，加入0.02mol/l na2co3溶液中于95℃水浴中煮沸2遍，每次至少30min，用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶，60℃烘箱过夜干燥，随后将干燥后的丝素蛋白放入libr溶液中形成第一混合反应体系进行所述的反应，并维持反应体系的温度为45℃，反应1.5h，其中，libr溶液浓度为9.3mol/l，丝素蛋白与libr溶液的质量：体积比为1:10；
[0131]
步骤一反应结束后用7～14kda截留量透析除去杂质，透析3.5天，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得纯的sf；
[0132]
步骤二：将1g hpmc(400mpa
·
s)溶于100ml无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，不停搅拌。待hpmc溶解之后，在溶液中加入60μl(对应0.375mmol)的甲基丙烯酸酐(ma)以及0.2g的4-二甲基氨基吡啶(dmap)，在室温下反应16h；
[0133]
步骤二反应结束后，将混合物滴加入过量乙醚中沉淀，混合物体积与乙醚体积比为1:10，8000rpm离心5min，收集生成的沉淀。收集的沉淀溶解在dmf中，再在过量的乙醚中沉淀两次；再将沉淀溶解于去离子水中，用7～14kda截留量透析除去杂质，透析3天，最后将产物置于-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得纯的羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物，记为hpmc-ma；
[0134]
步骤三：将制备的sf溶解于pbs中，制成8wt％的溶液备用；将hpmc-ma溶解于pbs中，制成5wt％的溶液备用，冰浴中将sf溶液用超声发生仪处理(超声探头直径为3mm，200w功率，超声时间为4s，暂停4s，循环8次)，与hpmc-ma溶液按体积比5:8混合，同时加入光引发剂芳基次膦酸锂(lap，终浓度为0.15wt％)；
[0135]
步骤三结束后，在20min内将溶液转移至模具中，365nm的光固化8s成型，再于37℃放置30min，获得二次固化的双网络水凝胶。
[0136]
实施例5
[0137]
步骤一：将挑选干净的蚕茧撕碎，加入0.02mol/l na2co3溶液中于95℃水浴中煮沸2遍，每次至少30min，用去离子水清洗多次并拧干以除去丝胶，60℃烘箱过夜干燥，随后将干燥后的丝素蛋白放入libr溶液中形成第一混合反应体系进行所述的反应，并维持反应体系的温度为40℃，反应1h，其中，libr溶液浓度为9.3mol/l，丝素蛋白与libr溶液的质量：体积比为1:10，
[0138]
步骤一反应结束后用7～14kda截留量透析除去杂质，透析3天，-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得纯的sf；
[0139]
步骤二：将1g hpmc(400mpa
·
s)溶于100ml无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)中，不停搅拌。待hpmc溶解之后，在溶液中加入60μl(对应0.375mmol)的甲基丙烯酸酐(ma)以及0.2g的4-二甲基氨基吡啶(dmap)，在室温下反应16h，
[0140]
步骤二反应结束后，将混合物滴加入过量乙醚中沉淀，混合物体积与乙醚体积比为1:10，8000rpm离心5min，收集生成的沉淀。收集的沉淀溶解在dmf中，再在过量的乙醚中
沉淀两次。再将沉淀溶解于去离子水中，用7～14kda截留量透析除去杂质，透析3天。最后将产物置于-80℃冷冻过夜，-50℃冷冻干燥3天，获得纯的羟丙基甲基纤维素-甲基丙烯酸酯聚合物，记为hpmc-ma；
[0141]
步骤三：将制备的sf溶解于pbs中，制成8wt％的溶液备用；将hpmc-ma溶解于pbs中，制成5wt％的溶液备用。冰浴中将sf溶液用超声发生仪处理(超声探头直径为3mm，240w功率，超声时间为5s，暂停5s，循环10次)，与hpmc-ma溶液按体积比24:5混合，同时加入光引发剂芳基次膦酸锂(lap，终浓度为0.15wt％)，
[0142]
步骤三结束后，在20min内将溶液转移至模具中，365nm的光固化8s成型，再于37℃放置30min，获得二次固化的双网络水凝胶。
[0143]
上述步骤一至步骤三可通过图1表示。
[0144]
性能测试一
[0145]
在场环扫描电镜测试仪上测试本实施例所获双网络水凝胶内部结构及孔径大小，其操作方法包括：
[0146]
将上述双网络水凝胶液氮冷冻，-50℃冷冻干燥24h，0.2ma喷金3min，扫描电镜观察水凝胶微观形貌图(如图2所示)。通过扫描电镜可以看出，该双网络水凝胶微观结构多孔，孔径约150～250μm。
[0147]
性能测试二
[0148]
将上述sf溶解于pbs中形成浓度为8wt％的溶液，随后将sf溶液于冰浴中进行超声处理(超声探头直径为3mm，功率240w，超声时间为5s，暂停5s，循环6次)，处理完毕后，加入预先配制好的hpmc-ma溶液和光引发剂lap，最终的溶液含有3wt％sf、1wt％hpmc-ma和0.15wt％lap，将溶液混合均匀后转移至模具，使用强度为2.5mw/cm2波长为365nm的光照射8s，初步固化成型，再于37℃下放置30min，获得双网络水凝胶。
[0149]
随后对该水凝胶进行流变学测试。用模具将水凝胶制成直径为8mm、高度为4mm的圆柱体，通过直径为8mm平行板的执行频率扫描模式(0.1～10hz，1％应变)进行测试。通过流变结果图3a可以看出，g’》g”且呈线性关系，说明已成凝胶状态，而且g’在20kpa左右。
[0150]
将上述双网络水凝胶材料试验机检测本实施例所获双网络水凝胶的压缩性能，采用单轴压缩测试方法。模具将水凝胶制成直径为8mm、高度为4mm的圆柱形。每个水凝胶以1mm/min的速率压缩至其原始高度的50％，进行3个压缩循环。压缩性能结果如图3b，可以看出，将水凝胶循环压缩至50％时，水凝胶的压缩模量约为250kpa。
[0151]
将上述双网络水凝胶材料试验机检测本实施例所获双网络水凝胶的拉伸性能。用模具将水凝胶制成长15mm、厚2mm、宽5mm的长方体条块。测量时夹具间距离为10mm，拉伸速率固定为10mm/min，结果如图3c，可以看出拉伸的断裂强度约在22kpa，拉伸模量约为60kpa。
[0152]
性能测试三
[0153]
将上述sf溶解于pbs中形成浓度为8wt％的溶液，随后将sf溶液于冰浴中进行超声处理(超声探头直径为3mm，功率240w，超声时间为5s，暂停5s，循环6次)，处理完毕后，加入预先配制好的hpmc-ma溶液和光引发剂lap，最终的溶液含有3wt％的sf、1wt％的hpmc-ma和0.15wt％的lap。将溶液混合均匀后转移至模具，使用强度为2.5mw/cm2波长为365nm的光照射8s，初步固化成型，再于37℃下放置30min，获得双网络水凝胶。将该水凝胶置于液氮冻结
成，冻干2天。将冻干的产物制成薄膜，使用renishaw invia拉曼显微镜聚焦，氦氖激光(785nm，10mw)激发并记录拉曼光谱数据。结果如图4所示，可以观察到，在酰胺i区，该水凝胶又特征峰1665cm-1
，酰胺iii区有特征峰1230cm-1
及1275cm-1
，以上三个峰都属于β-折叠的特征峰，说明该双网络水凝胶中sf的主要构象为β-折叠结构。
[0154]
性能测试四
[0155]
将上述sf溶解于pbs中形成浓度为8wt％的溶液，随后将sf溶液于冰浴中进行超声处理(超声探头直径为3mm，功率240w，超声时间为5s，暂停5s，循环6次)，处理完毕后，加入预先配制好的hpmc-ma溶液和光引发剂lap，最终的溶液含有3wt％sf、1wt％的hpmc-ma和0.15wt％lap的生物墨水；
[0156]
使用cad软件进行建模，再使用德国gesim公司的3d生物打印机bioscaffolder 3.2对生物墨水进行打印实验。配备美国thorlabs公司的4通道led驱动器，选取365nm的光源，输出功率为0.5mw(选定的输出电流为100ma，而输出电压额定为5v)，光源与预聚液的间距为8cm。实测光源的聚焦直径约为0.5cm，假设输出的光没有发生损耗则用于固化支架的光源功率约2.5mw/cm2，设定打印的每层内每个点的光照时间小于8s以防止后期混入细胞时uv光对细胞的损伤过大。配备了内径为160μm的喷嘴，喷嘴长度固定为13mm。确定以上参数后，生物墨水的挤出流量通过调节气动压力大小来控制，考虑到生物墨水的粘度和挤出过程中细胞的损伤可能，选取的气动压力为30～80kpa。打印出的线条宽度除了由挤出流量控制，还由印刷速度来调控，选取15mm/s，线间距选取0.5mm以控制模型的整体尺寸，3d打印效果图见图5a-5d。可以观察到整体尺寸的误差不超过1mm，误差率不超过10％，有较好的可打印性。
[0157]
性能测试五
[0158]
将上述sf溶解于pbs中形成浓度为8wt％的溶液，随后将sf溶液于冰浴中进行超声处理(超声探头直径为3mm，功率240w，超声时间为5s，暂停5s，循环6次),处理完毕后，加入预先配制好的hpmc-ma溶液和光引发剂lap，最终的溶液含有3wt％sf、1wt％的hpmc-ma和0.15wt％lap的生物墨水。在每毫升生物墨水中加入200万个骨髓间充质干细胞，使用该含有干细胞的生物墨水用上述条件进行打印。打印的细胞支架在完全培养基中培养10天，每两天更换一次培养基。用wst-1法评估支架中细胞的增殖：将打印的支架碾碎，在培养基中10％v/v的浓度wst-1试剂，孵育3小时后用酶标仪读取450nm下的吸光度，用作细胞活力的比较。用活/死染色法评估细胞毒性，样品用激光共聚焦显微镜进行成像和观察。结果如图6a和6b所示，可以观察到骨髓间充质干细胞在早期增殖缓慢，第7天后增殖急剧加速，由于使用了365nm的光照射，早期有不可避免的细胞死亡现象，但随着培养天数的增加，死亡细胞明显减少，第7天死亡细胞比例小于15％，第10天死亡细胞比例小于3％。与此同时，活细胞数量激增，尤其是第10天。说明该生物墨水良好的生物相容性促进了细胞的高增殖率，进一步证明了该生物墨水为骨髓间充质干细胞提供良好的细胞微环境。
[0159]
性能测试六
[0160]
将上述sf溶解于pbs中形成浓度为8wt％的溶液，随后将sf溶液于冰浴中进行超声处理(超声探头直径为3mm，功率240w，超声时间为5s，暂停5s，循环6次)，处理完毕后，加入预先配制好的hpmc-ma溶液和光引发剂lap，最终的溶液含有3wt％sf、1wt％的hpmc-ma和0.15wt％lap的生物墨水。在每毫升生物墨水中加入1000万个骨髓间充质干细胞，使用该含
有干细胞的生物墨水用上述条件进行打印。
[0161]
打印完成后将含有干细胞的水凝胶分别置于完全培养基(包含10v/v％培养基胎牛血清、1v/v％青/链霉素和dmem/f12培养基)和诱导培养基(包含10v/v％胎牛血清、1v/v％青/链霉素、10ng/ml转化生长因子-β1、胰岛素-转铁蛋白-硒补剂、1mm丙酮酸钠、100nm地塞米松磷酸钠、50μg/ml抗坏血酸、2mm l-谷氨酸、40μg/mll-羟脯氨酸和dmem/f12培养基)中培养。用rt-pcr检测软骨生成相关基因mrna的表达水平来判断干细胞的是否分化：将细胞负载的水凝胶放入5％co2、37℃培养箱中培养，隔天换新鲜培养基，培养14天，弃去培养基，pbs洗3次，在每个时间点通过trizol plus rna纯化试剂盒从双网络水凝胶中提取总细胞rna。使用a260/280nm评估rna的纯度。之后，使用primescripttm rt试剂盒将500ng rna逆转录成cdna。使用sybr green i pcr试剂盒rt-pcr检测，选取三种标志物：聚集蛋白聚糖(agg)、ii型胶原蛋白(col ii)、高机动性分组基因9(sox9)。将培养皿中没有经过诱导分化培养基培养细胞设为校准品对照，并通过非调节参考基因表达(β-actin)将目标基因表达标准化。结果如图7a-7c所示，所有标志物的表达量均呈现逐步增长的现象。于本实施例所获双网络水凝胶内共培养时能有效促进各标志基因的表达，即说明该生物墨水的生物相容性及促进软骨修复的能力十分优秀。
[0162]
性能测试七
[0163]
将上述sf溶解于pbs中形成浓度为8wt％的溶液，随后将sf溶液于冰浴中进行超声处理(超声探头直径为3mm，功率240w，超声时间为5s，暂停5s，循环6次)。处理完毕后，加入预先配制好的hpmc-ma溶液和光引发剂lap，最终的溶液含有3wt％sf、1wt％的hpmc-ma和0.15wt％lap的生物墨水。在每毫升生物墨水中加入1000万个骨髓间充质干细胞，使用该含有干细胞的生物墨水用上述条件进行打印。打印完成后将含有干细胞的水凝胶置于诱导培养基培养14天，依次用10％、30％、50％、70％、90％、和100％的乙醇进行脱水处理后再冷冻干燥，用场发射环境扫描电子显微镜观察细胞形态。结果如图8所示，在水凝胶诱导分化培养2周后，骨髓间充质干细胞呈圆形，显示出干细胞的良好状态和分化趋势，充分说明了该生物墨水良好的生物相容性。
[0164]
对照例1
[0165]
一般情况下，利用纯的sf形成高强度水凝胶时需要借助有机化学试剂，但有机试剂具有细胞毒性，不利于细胞包埋，从而限制了其在生物医学中的应用。
[0166]
与对照例1相比，本发明实施例所获生物墨水采用简单的物理超声诱导sf形成β-折叠进而固化形成高强度水凝胶，较上述方法而言，采用物理超声交联形成的水凝胶有更广泛的生物应用，例如，本发明实现与干细胞共混打印，较上述其他三维支架材料更易于干细胞负载。
[0167]
对照例2
[0168]
一般情况下，利用纯的sf采用简单的物理超声诱导sf形成β-折叠进而固化形成高强度水凝胶的速度较慢，根据超声的强度，其成胶时间从几十分钟到几小时，甚至数天不等，不利于支架的快速形成以及共混负载细胞，此外纯的sf形成的水凝胶内部孔径较小，不利于营养物质以及代谢废物的交换。
[0169]
与对照例2相比，本发明实施例所获双网络水凝胶，通过诱导sf缓慢形成β-折叠结构即一层网络，利用hpmc-ma的广光交联反应形成另一层网络，提升水凝胶的性能以满足软
骨需求，形成的双网络水凝胶有更强的力学性能，更适宜的孔径和三维微环境以及生物学应用，例如，本发明结合了单一网络水凝胶的优点构建了即可快速固化又具有较强力学性能的双网络水凝胶，且实现与干细胞共混打印，较上述其他三维支架材料交联速度更快，性能更好。
[0170]
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
[0171]
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
[0172]
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
[0173]
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
[0174]
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
[0175]
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。