一种糖基转移酶及其在Tn抗原的标记、成像和检测中的应用的制作方法

一种糖基转移酶及其在tn抗原的标记、成像和检测中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医学领域，具体涉及一种糖基转移酶及其在tn抗原的标记、成像和检测中的应用


背景技术：

2.癌症是全世界最为关心的公共健康问题，也是对人类健康威胁最大的疾病之一。尽管传统的手术、化疗药、放射等疗法取得了巨大的成功，但是癌症仍然是难以预防和完全治愈的，尽早发现并及时治疗是最为有效的办法。
3.肿瘤相关糖类抗原(tumor-associated carbohydrate antigens，tacas)，也被称作肿瘤相关碳水化合物抗原，指并非某一种肿瘤所特有,在其他肿瘤细胞上也存在的糖类抗原分子，是肿瘤细胞表面高丰度的多糖标志物，可用于区别肿瘤细胞和正常细胞。临床上除了我们熟知的甲胎蛋白，癌胚抗原，还利用taca作为血液中的肿瘤标志物筛查，例如cancer antigen19-9(简称ca199)用于检测胰腺癌、结肠癌和胃癌，cancer antigen 12-5(简称ca125，muc16)用于检测卵巢癌，cancer antigen 15-3(简称ca153，muc1)用于检测转移性乳腺癌。此外，有一种聚糖抗原(黏蛋白型o-聚糖抗原)，是单个乙酰胺基半乳糖胺(galnac)连接到苏氨酸(thr)或者丝氨酸(ser)残基上，又称tn antigen(简称tn抗原)，在癌症组织中广泛表达，已有研究表明约有90％的实体乳腺癌肿瘤高表达tn抗原。tn抗原的高表达使肿瘤细胞的抗原性和黏附能力发生改变，促进肿瘤细胞的恶性增生与转移，其作为靶点为肿瘤的研究和治疗提供了新的方向。
4.现有的tn抗原检测手段局限于传统的凝集素方法和抗体法。凝集素虽然被广泛使用，但是由于凝集素与糖的结合力仅仅是μm级别，当使用高浓度、长时间孵育的凝集素方法进行蛋白富集时，难免会产生非特异性吸附。而且，有报道凝集素的产品批次间的差异大、且选择性差，其对糖链的识别并不是一一对应关系，通常都是一种凝集素识别一类糖链，因此导致对其他种类的糖型存在交叉识别的缺陷。抗体法也存在低亲和力的缺点，而且使用成本高昂，市场上没有稳定性良好的糖基化抗体。因此，现有tn抗原检测方法的缺陷很大成程度上限制了tn抗原在癌症检测体系中的应用。实现tn抗原的特异、高效、快速地检测，对肿瘤的筛查、诊断与抗肿瘤药物或疫苗的开发具有重要的意义，不仅可以推动人类对于癌症发生、发展的认知，更具有广泛的临床应用前景。研究和开发一种高效、稳定、快速、特异性强的方法实现对tn抗原的检测是亟需解决的问题，对临床上癌症相关的糖抗原的标记具有极大的推动作用。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是如何基于化学酶法技术方便、快速、特异地实现对tn抗原的标记、检测和成像。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
6.为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质，名称为b3gnt6(43-384)，所述蛋
384)。
25.本文所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna。
26.本发明还提供了生物材料，所述生物材料可为下述e1)至e4)中的任一种：
27.e1)含有b1)或b2)或b3)所述核酸分子的表达盒；
28.e2)含有b1)或b2)或b3)所述核酸分子的重组载体、或含有e1)所述表达盒的重组载体；
29.e3)含有b1)或b2)或b3)所述核酸分子的重组微生物、或含有e1)所述表达盒的重组微生物、或含有e2)所述重组载体的重组微生物；
30.e4)含有b1)或b2)或b3)所述核酸分子的细胞、或含有e1)所述表达盒的细胞、或含有e2)所述重组载体的细胞；
31.本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或m13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、人工染色体(如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)、p1人工染色体(pac)或ti质粒人工染色体(tac)等)、病毒载体(如逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒或疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)等)，具体可为载体pflag-cmv-3。
32.本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(escherichia),欧文氏菌(erwinia),根癌农杆菌属(agrobacterium)、黄杆菌属(flavobacterium),产碱菌属(alcaligenes),假单胞菌属(pseudomonas),芽胞杆菌属(bacillus)等。
33.本文所述细胞可为动物细胞，具体可为哺乳动物细胞hek293f。
34.所述重组载体具体可为重组载体pflag-cmv-3-b3gnt6(43-384)，重组载体pflag-cmv-3-b3gnt6(43-384)是将pflag-cmv-3载体的hind iii和not i识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中seq id no.2的dna片段，保持pflag-cmv-3载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。所述重组载体pflag-cmv-3-b3gnt6(43-384)表达带有flag标签的蛋白质b3gnt6(43-384)(融合蛋白flag-b3gnt6(43-384))。
35.本发明还提供了所述蛋白质b3gnt6(43-384)和/或所述核酸分子的下述任一种应用：
36.c1)所述蛋白质b3gnt6(43-384)和/或所述核酸分子在制备tn抗原标记试剂或试剂盒中的应用；
37.c2)所述蛋白质b3gnt6(43-384)和/或所述核酸分子在制备检测tn抗原的产品中的应用；
38.c3)所述蛋白质b3gnt6(43-384)和/或所述核酸分子在制备诊断或辅助诊断癌症的产品中的应用；
39.c4)所述蛋白质b3gnt6(43-384)和/或所述核酸分子在制备癌症的预后判断或疗效观察的产品中的应用；
40.c5)所述蛋白质b3gnt6(43-384)和/或所述核酸分子在制备用于tn抗原成像的试剂中的应用；
41.c6)所述蛋白质b3gnt6(43-384)和/或所述核酸分子在临床免疫学检验技术中的应用；
42.c7)所述蛋白质b3gnt6(43-384)和/或所述核酸分子在标记免疫技术中的应用。
43.上述应用中，所述tn抗原可为癌症细胞(癌细胞)表面tn抗原。
44.进一步地，c3)中所述在制备诊断或辅助诊断癌症的产品中的应用可为在制备诊断或辅助诊断早期癌症的产品中的应用。
45.上述应用中，所述产品可为酶联免疫试剂盒或免疫组化试剂盒。
46.本发明还提供了一种tn抗原检测试剂盒，所述试剂盒包括所述蛋白质b3gnt6(43-384)。
47.所述tn抗原检测试剂盒可为酶联免疫试剂盒或免疫组化试剂盒。
48.进一步地，所述试剂盒还包括糖基转移酶供体底物叠氮糖、含炔烃的检测试剂和点击化学反应催化剂。
49.进一步地，所述试剂盒还包括酶促反应催化剂，所述酶促反应催化剂可为含金属离子的化合物。所述金属离子可为锰离子、钴离子和/或锌离子。
50.具体地，在本发明的一个实施方案中，所述酶促反应催化剂为mncl2。
51.进一步地，所述试剂盒还包括铜离子配体(催化剂稳定剂)。所述铜离子配体可为bttaa、bttes、tbta或thpta。
52.具体地，在本发明的一个实施方案中，所述铜离子配体为bttaa。
53.上述试剂盒中，所述糖基转移酶供体底物叠氮糖可为udp-glcnaz。
54.上述试剂盒中，所述含炔烃的检测试剂(即含有炔烃的标记分子)可为炔基修饰的小分子标记物，所述小分子标记物可为染料或半抗原。
55.具体地，在本发明的一个实施方案中，所述含炔烃的检测试剂为alkyne-cy5。
56.上述试剂盒中，所述点击反应催化剂可为亚铜离子(cu

)化合物，如溴化亚铜或碘化亚铜但不限于此。
57.具体地，在本发明的一个实施方案中，所述点击反应催化剂为硫酸铜(cuso4)和抗坏血酸钠(vcna)。
58.进一步地，所述试剂盒还包括溶剂，所述溶剂可为水、四氢呋喃、dmso、乙腈、或四氢呋喃与水的混合物、或dmso与水的混合物、或上述化合物的混合物。
59.本发明还提供了所述试剂盒在癌症筛查中的应用。
60.本发明还提供了一种tn抗原的标记方法，所述方法包括如下步骤：
61.(1)采用所述蛋白质b3gnt6(43-384)作为糖基转移酶，以糖基转移酶供体底物叠氮糖为酶促反应底物，对含有tn抗原的样本进行酶促反应处理。
62.(2)步骤(1)处理后的样本与含炔烃的检测试剂在点击反应催化剂的作用下进行点击反应，得到被所述含炔烃的检测试剂标记的tn抗原。
63.上述方法中，所述糖基转移酶供体底物叠氮糖可为udp-glcnaz。
64.上述方法中，所述酶促反应可以金属离子作为催化剂，所述金属离子可为锰离子、钴离子和/或锌离子；和/或，所述酶促反应的最适ph值可为7-8。
65.进一步地，所述酶促反应的最适ph值可为7.5。
66.上述方法中，所述含炔烃的检测试剂(即含有炔烃的标记分子)可为下述任一种：
67.d1)炔基修饰的小分子标记物；
68.d2)炔基修饰的染料；
69.d3)炔基修饰的半抗原；
70.d4)alkyne-cy5。
71.进一步地，所述点击反应可为铜离子催化的点击反应(铜催化的叠氮-炔基环加成反应)但不限于此。
72.进一步地，所述点击反应催化剂可为亚铜离子(cu

)化合物，如溴化亚铜、碘化亚铜等。
73.在本发明的一个实施方案中，所述点击反应催化剂为硫酸铜(cuso4)和抗坏血酸钠(vcna)，抗坏血酸钠(vcna)将cu
2
还原为cu

并催化叠氮和炔基发生点击反应(铜催化的叠氮-炔基husigen环加成反应)。
74.进一步地，在本发明的一个实施方案中，所述铜离子催化的点击反应是在铜离子配体存在下进行。
75.所述铜离子配体包括bttaa、bttes、tbta或thpta但不限于此，铜离子配体的存在可以稳定一价铜盐，保护一价铜离子免受氧化或者歧化作用，增强对点击反应的催化效果，降低一价铜的毒性。
76.在本发明的一个实施方案中，铜离子配体为bttaa。bttaa是一种铜盐催化的“叠氮-炔基"生物正交反应的加速配体，同时也是一种超低毒性的配体，生物相容。
77.进一步地，上述方法中，步骤(1)进行酶促反应处理条件为：1mm mncl2，100μmudp-glcnaz，1mg/ml b3gnt6(43-384)，在37℃条件下反应30分钟。
78.进一步地，上述方法中，步骤(2)进行点击反应的条件为：50μm炔基修饰的染料(alkyne-cy5),200μm硫酸铜(cuso4),1mm配体bttaa，10mm vcna，37℃条件下反应5分钟。
79.上述方法中，所述样本可为蛋白、细胞或组织切片。
80.进一步地，所述细胞可为癌细胞，如乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、胰腺癌细胞、卵巢癌细胞或胃食管癌细胞等。
81.本发明还提供了上述方法在对癌细胞或肿瘤进行检测、标记和/或成像中的应用。
82.本领域技术人员应当理解，本文所述点击反应(click reaction)是指通过小单元的拼接，完成各种分子的化学合成。点击反应的代表反应为铜催化的叠氮-炔基husigen环加成反应(copper-catalyzed azide
–
alkyne cycloaddition)，其基本反应原理是cu

催化叠氮化物基团和炔基发生点击反应，使叠氮化物(azide)和炔烃(alkyne)作用形共价键，从而形成环加成产物五元三唑环。因此，利用点击反应对tn抗原进行标记时，叠氮化物和炔烃部分是可互换的，即本发明所述的含有炔烃的标记分子(alkyne-cy5)和糖基转移酶供体底物叠氮糖(udp-glcnaz)也可以替换为含有叠氮基团的标记分子(如荧光基团叠氮化物或半抗原叠氮化物)和含有炔烃的糖基转移酶供体底物(如udp-glcnal)，同样能够实现本发明的目的，没有脱离本发明的保护宗旨。
83.本文所述tn抗原是癌细胞表面的一种特异性糖类抗原，在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌等恶性细胞表面以簇状的形式过量表达。作为乙酰氨基半乳糖衍生物，tn抗原在正常细胞中能进一步延长糖链形成复合的低聚糖，所以对于正常细胞而言，它是隐形的。而在大多数癌细胞中，由于其糖链延伸受阻，tn抗原就暴露在细胞表面，因此tn抗原的过量表达对于某些癌细胞有高度的专一性，在癌症的早期诊断方面是重要的参考数据。
84.本发明为癌症标志物tn抗原的标记新方法的开发，首次提供一种全新的化学酶法
策略，实现了对tn抗原的化学选择性标记。具体地，本发明提供了一种基于化学酶法的快速、简单、高效地对体内或体外tn抗原进行标记的方法和试剂盒，该方法和试剂盒可用于方便、准确、快速地对体内或体外的tn抗原进行标记和/或成像，进一步地可以快速检所述tn抗原。
85.本发明首次克隆并表达了糖基转移酶b3gnt6的截短体(seq id no.1)，构建了糖基转移酶b3gnt6(43-384)，该酶能够将乙酰胺基葡萄糖(glcnac)以β1-6的方式连接到tn抗原上，特异性识别tn抗原。糖基转移酶b3gnt6(43-384)还可以高效地利用核酸形式的非天然糖，通过酶促反应和生物正交反应(如点击反应)将非天然糖携带的生物正交基团以共价键的形式转移到tn抗原上，可以快速、特异地实现对癌症细胞表面的tn抗原标记和成像。被标记的tn抗原可以多种方式在分子、细胞、组织水平上被准确的分离鉴定、检测和分析，从而对癌症的早期诊断以及靶向治疗提供有效帮助。
86.本发明所述应用和方法的目的可以是疾病诊断目的、疾病预后目的和/或疾病治疗目的，它们的目的也可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和非疾病治疗目的；它们的直接目的可以是获取疾病诊断结果、疾病预后结果和/或疾病治疗结果的中间结果的信息，它们的直接目的可以是非疾病诊断目的、非疾病预后目的和/或非疾病治疗目的。
87.实验证明，本发明与现有技术相比，具有以下优点：
88.1、发掘了全新的工具酶，可以实现对tn抗原的特异性标记。本发明首次开发并探究了的人源化的糖基转移酶工具b3gnt6(43-384)，利用哺乳动物细胞分泌蛋白纯化体系，优化了人源化糖基转移酶的表达和纯化，并对其酶活、酶的底物特异性进行了详细的探究，证明了该酶能够高效的识别tn抗原。
89.2、发展了一种高效的化学酶法标记策略，可以实现对癌症细胞表面tn抗原的检测。本发明借助新兴的生物正交反应，结合高度选择性的工具酶，可以实现靶向标记癌症细胞表面的多糖抗原，为癌症的早期诊断和靶向治疗提供技术平台。
附图说明
90.图1为b3gnt6(43-384)蛋白纯化sds-page分析图。
91.图2为不同金属离子对b3gnt6(43-384)酶促反应的影响结果图。
92.图3为不同ph值对b3gnt6(43-384)酶促反应的影响结果图。
93.图4为共聚焦荧光显微镜拍摄的利用化学酶法对细胞表面tn抗原的标记情况示意图。“ ”表示添加该物质，
“‑”
表示不添加该物质。图4中b3gnt6表示b3gnt6(43-384)。
94.图5为流式细胞术检测利用化学酶法对细胞表面tn抗原的标记情况示意图。
具体实施方式
95.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
96.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
no.2所示(由1026个核苷酸组成)；
115.seq id no.2所示的糖基转移酶b3gnt6(43-384)cdna基因编码氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质b3gnt6(43-384)(糖基转移酶b3gnt6(43-384))。seq id no.1由342个氨基酸残基组成。
116.2、pcr产物的验证、连接及测序
117.(1)利用全式金快速pcr产物回收试剂盒进行pcr产物回收，并进行dna浓度测定。
118.(2)将载体pflag-cmv-3和pcr产物进行hind iii和not i酶切，然后利用t4连接酶进行连接反应，构建重组载体，将连接产物进行转化并通过菌落pcr进行阳性单克隆筛选。
119.(3)挑取阳性单克隆进行测序验证，确定载体构建成功，将序列正确的重组载体(重组质粒)命名为pflag-cmv-3-b3gnt6(43-384)，选取序列正确的单克隆，进行质粒大提操作。
120.测序结果表明，重组载体pflag-cmv-3-b3gnt6(43-384)是将pflag-cmv-3载体的hind iii和not i识别位点间的片段(小片段)替换为核苷酸序列是序列表中seq id no.2的dna片段，保持pflag-cmv-3载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。
121.所述重组载体pflag-cmv-3-b3gnt6(43-384)表达带有flag标签的蛋白质b3gnt6(43-384)(flag-b3gnt6(43-384))。
122.实施例2糖基转移酶b3gnt6(43-384)的分泌表达及纯化
123.利用哺乳动物细胞hek293f分泌蛋白体系纯化人源的糖基转移酶b3gnt6(43-384)。具体操作如下：
124.1、hek293f悬浮细胞培养及转染
125.(1)取用hek293f细胞进行悬浮培养(5％co2和85rpm/min)，细胞密度长到106个/ml后进行细胞转染。
126.(2)取大提质粒pflag-cmv-3-b3gnt6(43-384)约20μg，加入到500μl细胞培养基中，再取用转染试剂(pei，浓度为1mg/ml)60μl，加入到500μl细胞培养基中，混匀。然后将包含质粒的培养基加入到包含pei转染试剂的培养基中，混匀，静置20分钟。将混匀的含有转染试剂和质粒的培养基加入到20ml的细胞中，悬浮培养5天(即转染5天)。
127.2、b3gnt6(43-384)的蛋白纯化
128.(1)收取步骤1中转染5天后的悬浮细胞，800
×
g离心，去掉细胞沉淀，收取上层细胞培养基。
129.(2)收取的上层细胞培养基利用0.45μm的滤膜进行过滤，除掉细胞碎片。
130.(3)过滤后的上层细胞培养基利用flag-beads(flag标签抗体磁珠)进行4℃下振荡孵育2小时，用pbs清洗beads三次，然后再利用包含3
×
flag多肽(1mm)的pbs缓冲液进行竞争洗脱，从flag-beads上洗脱b3gnt6(43-384)蛋白，收集目标蛋白(b3gnt6(43-384)蛋白)，最后进行离心浓缩、进行sds-page鉴定，结果如图1所示，蛋白胶第四泳道约50kda左右为带有flag标签的蛋白质b3gnt6(43-384)(即糖基转移酶b3gnt6(43-384)，氨基酸序列为seq id no.1)。
131.实施例3糖基转移酶b3gnt6(43-384)的活性研究
132.本实施例是对糖基转移酶b3gnt6(43-384)的酶活性质进行探究，从酶的供体底物、金属离子依赖、ph敏感性等方面进行探究。具体操作如下：
133.1、b3gnt6(43-384)的供体底物探究
134.采用商业化购买的苄基-2-乙酰胺基-2-脱氧-α-d-吡喃半乳糖苷(α-galnac-bn，cas:3554-93-6，上海麦克林生化科技有限公司)作为受体底物，分别利用供体底物5
’‑
二磷酸尿嘧啶核苷-n-乙酰半乳糖胺(udp-glcnac)(cas:91183-98-1，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司)及其叠氮衍生物(udp-glcnaz)(cas:1611490-64-2，青岛曙格生物技术有限公司)和炔基衍生物(udp-glcnal)(青岛曙格生物技术有限公司)对实施例2制备的糖基转移酶b3gnt6(43-384)(带有flag标签)进行酶活性差异的比较。酶促反应为体系30ul，包含ph＝8.0tris-hcl(100mm),mncl2(2mm),α-galnac-bn(10mm),udp-glcnac或者udp-glcnaz或udp-glcnal(15mm)，b3gnt6(43-384)(0.2mg/ml),用去离子水补齐，37℃水浴条件下反应60分钟，95摄氏度加热2分钟终止反应，反应液进行hplc检测分析。hplc检测中，hplc分析中采用agilent zorbax c18分析柱，柱温40℃，进样量20μl,流动相为由乙腈和水组成的液体，梯度乙腈为10％-40％(20分钟)，流速为1ml/min,利用uv检测器在波长220nm处检测并自动形成分离图谱。
135.检测分析结果见表3：
136.表3 酶促反应的产率
137.供体底物udp-glcnacudp-glcnazudp-glcnal产率100％96.3％82.7％
138.结果表明，b3gnt6(43-384)能将udp-glcnac的glcnac基团转移到α-galnac-bn上，得到产物glcnac-galnac-bn，产率是100％；b3gnt6(43-384)能将udp-glcnaz的glcnaz基团转移到α-galnac-bn上，得到产物glcnaz-galnac-bn，产率是96.3％；b3gnt6(43-384)能将udp-glcnal的glcnal基团转移到α-galnac-bn上，得到产物glcnal-galnac-bn，产率是82.7％。说明b3gnt6(43-384)是一种糖基转移酶，b3gnt6(43-384)可以高效利用天然核酸糖及其类似物，具有高效的生物催化活性。
139.2、b3gnt6(43-384)的金属离子依赖性和ph敏感性范围的探究
140.(1)金属离子依赖性：该部分实验操作使用苄基-2-乙酰胺基-2-脱氧-α-d-吡喃半乳糖苷(α-galnac-bn，cas:3554-93-6)作为受体底物，5
’‑
二磷酸尿嘧啶核苷-n-乙酰半乳糖胺(udp-glcnac)作为供体底物，采用不同种类的二价金属离子作为酶促反应催化剂，如镁离子(mg
2
)、锰离子(mn
2
)、钙离子(ca
2
)、钴离子(co
2
)或锌离子(zn
2
)，考察不同金属离子对酶促反应的影响。酶促反应体系为30ul，包含ph＝8.0tris-hcl(100mm),金属离子(2mm),α-galnac-bn(10mm),udp-glcnac(15mm)，b3gnt6(43-384)(0.2mg/ml),用去离子水补齐，37℃水浴条件下反应60分钟，95摄氏度加热2分钟终止反应(相同反应条件下，同时设置了加入5mm edta的实验组和空白对照组)，反应液进行hplc检测分析。检测分析结果如图2所示。
141.结果表明，在没有金属离子作为酶促反应催化剂时，b3gnt6(43-384)不具有酶活力；不同的金属离子对b3gnt6(43-384)的催化作用也不同，催化作用由大到小依次为锰离子(mn
2
)、钴离子(co
2
)、锌离子(zn
2
)，而镁离子(mg
2
)和钙离子(ca
2
)对b3gnt6(43-384)不具有催化作用。可以看出，锰离子(mn
2
)作为催化剂时，酶活最大，酶促反应相对产率可以达到100％。表明b3gnt6(43-384)催化需要mn等金属离子，表现为金属离子依赖性。
142.(2)ph敏感性范围的探究：该部分实验操作使用苄基-2-乙酰胺基-2-脱氧-α-d-吡
vcna，37℃条件下反应5分钟(点击反应)。反应完成后，去掉反应溶液，用pbs缓冲液清洗三遍，最后进行流式细胞仪的荧光分析检测。其它两组也进行上述相同的处理。结果如图5所示：与对照组(b ，u-组和b-，u 组)相比，被标记组(b ，u )的mcf7细胞表面有明显的荧光信号。
152.以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。