一种利用凝结芽孢杆菌生产γ-氨基丁酸的方法及其应用与流程

一种利用凝结芽孢杆菌生产
γ-氨基丁酸的方法及其应用
技术领域
1.本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种利用凝结芽孢杆菌生产γ-氨基丁酸的方法及其应用。


背景技术：

2.γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，gaba)，别名4-氨基丁酸，是一种天然存在的小分子非蛋白氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统内重要的抑制性神经递质，具有镇定安神、改善脑机能、降血压、调节激素分泌等生理功能，广泛应用于食品、医药、饲料等领域。gaba的天然存在量较低，目前获得gaba的主要方法有化学合成法和生物法，其中化学合成法反应迅速，但反应条件苛刻、能耗大、成本高、不易控制，且污染严重，存在一定安全隐患。生物法又包括植物富集法、微生物发酵法和生物酶解法三种，植物富集法是利用植物内源性的谷氨酸脱羧酶在代谢过程中生产gaba，该方法操作简单、副作用小，但生产的gaba含量较低，不适合规模化生产；生物酶解法是以谷氨酸为底物，在特定条件下利用谷氨酸脱羧酶将谷氨酸转化为gaba，生物酶解法生产的产品单一、效率高，但相对成本较高；微生物发酵法是以产谷氨酸脱羧酶的微生物为生产菌发酵，在代谢过程中将谷氨酸转化为gaba，再经分离纯化得到gaba纯品。最早的微生物发酵法是利用大肠杆菌的脱羧酶来生产gaba，但由于大肠杆菌本身的生物安全性问题，限制了其在食品、药品行业中的应用。随着技术的发展，一些绿色、安全的微生物，如乳酸菌、酵母菌等，被用来替代大肠杆菌生产gaba。
3.乳酸菌是通常认为安全的微生物，与人和动物的生命活动密切相关。目前已报道的可用于合成gaba的乳酸菌，包括植物乳杆菌、短乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳酸乳球菌、鸟肠球菌等，但这些乳酸菌天然合成gaba的能力较低，限制了其工业生产和应用。凝结芽孢杆菌是一类“普遍认为安全”的芽孢乳酸菌，不携带任何肠毒素、呕吐毒素、抗生素耐药性基因，对所有抗生素敏感，抗逆性强，耐酸、耐盐、耐高温，产酶能力强，能分泌多种消化酶和酶促因子，具有很强的益生功能。目前针对凝结芽孢杆菌的益生机制和代谢产物的研究较少，在发酵工业和畜牧养殖业中的应用范围有限。


技术实现要素：

4.本发明的目的是克服现有技术中存在的生物安全性问题。
5.为此，本发明提供了一种利用凝结芽孢杆菌生产γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：
6.(1)配制培养基，将凝结芽孢杆菌接种到培养基中活化，得到活化菌种；
7.(2)配制种子培养基，将活化菌种接入种子培养基中扩大培养，得到种子培养液；
8.(3)配制发酵罐培养基，将种子培养液接种至发酵罐内进行分批补料发酵培养，得到发酵液；
9.(4)发酵液经过滤、离心、干燥后得到γ-氨基丁酸。
10.具体的，上述步骤(1)中培养基为斜面培养基，其制备方法为将小麦粉加水煮沸1
小时以上，过滤得到滤液，冷却后每100ml滤液添加1～2％琼脂粉，灭菌后制成斜面培养基。
11.具体的，上述步骤(2)中种子培养基的配方为葡萄糖5～10g/l、酵母膏5～15g/l、蛋白胨10～20g/l，余量以水补足。
12.具体的，上述步骤(2)中扩大培养条件为40～45℃、100～300rpm下摇床培养8～10小时。
13.具体的，上述步骤(3)中种子培养液的接种量为2～10％。
14.具体的，上述步骤(3)中发酵罐培养基的配方为葡萄糖5～20g/l、酵母膏10～30g/l、味精渣10～30g/l、乙酸钠5～10g/l、硫酸镁0.1～0.5g/l、硫酸锰0.05～0.5g/l、吐温-80 0.5～1.0ml/l、消泡剂0.01～0.05g/l，余量以水补足，ph为5.0～5.5。
15.具体的，上述步骤(3)中分批补料的补料培养基配方为葡萄糖10～20g/l、酵母膏10～30g/l、l-谷氨酸钠10～30g/l，余量以水补足。
16.具体的，上述步骤(3)中发酵罐分批补料发酵培养具体条件为：培养温度40～45℃，ph值5.0～7.0，发酵罐罐压0.05～0.1mpa，搅拌速度100～200rpm，溶氧10～20％，培养4～8小时后开始补料，培养周期36～48小时。
17.本发明还提供一种γ-氨基丁酸饲料添加剂，其包括由上述任意一项所述方法生产的γ-氨基丁酸和载体；所述饲料添加剂中γ-氨基丁酸的含量为10～40％，载体优选为玉米淀粉。
18.具体的，上述饲料添加剂用于动物饲料时，添加量为200～400g/t。
19.与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
20.天然乳酸菌由于其高活性的谷氨酸脱羧酶，成为gaba生产的主要菌种。凝结芽孢杆菌又叫做芽孢乳酸菌，是一种兼性厌氧的革兰氏阳性菌，兼具有乳酸菌和芽孢杆菌的双重特性，本发明提供的这种方法首次使用凝结芽孢杆菌来发酵生产γ-氨基丁酸，安全性高、产量高，为γ-氨基丁酸的富集提供了新的菌种选择；在利用味精渣作为发酵罐培养底物，实现了资源的充分利用；在发酵罐阶段，采用分批补料方法，连续补充谷氨酸，改善了菌体生长环境，提高了菌体生长速度，同时消除底物浓度过高产生的抑制作用。
具体实施方式
21.下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变，因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
22.本发明提供了一种利用凝结芽孢杆菌生产γ-氨基丁酸的方法，包括以下步骤：
23.(1)配制培养基，将凝结芽孢杆菌接种到培养基中活化，得到活化菌种；
24.其中，培养基为斜面培养基，其制备方法为将小麦粉加水煮沸1小时以上，过滤得到滤液，冷却后每100ml滤液添加1～2％琼脂粉，灭菌后得到斜面培养基；活化培养条件优选为37℃恒温培养箱培养48小时；
25.(2)配制种子培养基，将活化菌种接入种子培养基中扩大培养，得到种子培养液；
26.其中，种子培养基的配方为葡萄糖5～10g/l、酵母膏5～15g/l、蛋白胨10～20g/l，
余量以水补足；扩大培养条件为40～45℃、100～300rpm下摇床培养8～10小时；
27.(3)配制发酵罐培养基，将种子培养液接种至发酵罐内进行分批补料发酵培养，得到发酵液；
28.其中，种子培养液的接种量为2～10％；发酵罐培养基的配方为葡萄糖5～20g/l、酵母膏10～30g/l、味精渣10～30g/l、乙酸钠5～10g/l、硫酸镁0.1～0.5g/l、硫酸锰0.05～0.5g/l、吐温-80 0.5～1.0ml/l、消泡剂0.01～0.05g/l，余量以水补足，ph为5.0～5.5；分批补料的补料培养基配方为葡萄糖10～20g/l、酵母膏10～30g/l、l-谷氨酸钠10～30g/l，余量以水补足；发酵罐分批补料发酵培养具体为培养温度40～45℃，ph值5.0～7.0，发酵罐罐压0.05～0.1mpa，搅拌速度100～200rpm，溶氧10～20％，培养4～8小时后开始补料，培养周期36～48小时；
29.(4)发酵液经过滤、离心、干燥后得到γ-氨基丁酸。
30.下面通过具体实施例对本发明的利用凝结芽孢杆菌生产γ-氨基丁酸的方法的效果进行研究。
31.本发明实施例中使用的凝结芽孢杆菌(bacillus coagulans)hy2a，于2014年10月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2014536。短乳杆菌购自中国微生物保藏中心普通微生物菌种管理中心，保藏编号cgmcc 1.2028。除非特别说明，本发明所使用的试剂和设备都可通过常规市场购买。
32.实施例1：
33.本实施例提供了一种γ-氨基丁酸的生产方法，其包括以下步骤：
34.(1)配制斜面培养基：称取小麦粉10g，加入90ml水煮沸1小时，用纱布过滤得滤液，冷却后定容到100ml，加入2％琼脂粉，115℃高压灭菌30min；将保藏的凝结芽孢杆菌接入斜面培养基中，37℃恒温培养箱培养48小时，获得活化菌种；
35.(2)配制种子培养基：葡萄糖10g/l、酵母膏10g/l、蛋白胨20g/l，余量为水；从活化菌种中挑一环菌泥接入种子培养基中，在40℃、150rpm下摇床培养8小时，得到种子培养液；
36.(3)配制发酵罐培养基：葡萄糖10g/l、酵母膏10g/l、味精渣20g/l、乙酸钠10g/l、硫酸镁0.5g/l、硫酸锰0.5g/l、吐温-80 1.0ml/l、消泡剂0.05g/l，余量为水；在30l发酵罐中装入18l发酵罐培养基，115℃灭菌30min，注水冷却降温至40℃，调节ph值为5.0，将种子培养液以5％的接种量接种至发酵罐内，通气量设置为1.0m3/小时，搅拌速度为150rpm，发酵培养4小时后，培养基ph值上升到6.5，开始补料，每次补入0.2％补料培养基，补料培养基配方为：葡萄糖20g/l、酵母膏20g/l、l-谷氨酸钠20g/l，余量为水；补料过程中凝结芽孢杆菌能够通过自身代谢维持发酵培养基ph在5.0-7.0，发酵40小时后，培养基中葡萄糖耗尽，发酵结束，将发酵液离心、真空浓缩、喷雾干燥后得到发酵产物，经hplc检测发酵产物中γ-氨基丁酸含量为65.6％。
37.比较例1：
38.本比较例采用与实施例1相同的γ-氨基丁酸的生产方法，区别在于步骤(1)中接入斜面培养基中的是短乳杆菌。
39.发酵结束，将发酵液离心、真空浓缩、喷雾干燥后得到发酵产物，经hplc检测发酵产物中γ-氨基丁酸含量为23.2％，低于凝结芽孢杆菌发酵产物中γ-氨基丁酸的含量。
40.实施例2：
41.本实施例研究了利用凝结芽孢杆菌生产的γ-氨基丁酸在肉鸡养殖方面的应用。
42.将实施例1中得到的发酵产物与玉米淀粉混合制得饲料添加剂，其中gaba的含量为10％。
43.选用400只健康的1日龄爱拔益加肉鸡，公母各半，随机分成4个处理组(对照组和试验组1-3)，每组5个重复，每重复20羽。使用基础日粮和本实施例制备的饲料添加剂(10％gaba)，如表1所示设计试验喂养爱拔益加肉鸡，试验为期42天。基础日粮组分随饲喂过程中肉鸡日龄增长更改，具体组成及营养成分如表2和表3所示。
44.表1试验分组
[0045][0046]
表2基础日粮的组成(风干基础)
[0047]
[0048][0049]
其中玉米粗蛋白含量为7.8％；豆粕粗蛋白含量为43％；进口鱼粉粗蛋白含量为68％；每公斤肉鸡多维可提供：维生素a乙酸酯5000-10000kiu，维生素d3 2000-5000kiu，dl-α-生育酚乙酸酯≥25000mg，甲萘醌≥2400mg，硝酸硫胺≥2000mg，核黄素≥6000mg，盐酸吡哆醇≥3500mg，氰钴胺≥12mg，烟酰胺≥30000mg，d-生物素≥75mg，d-泛酸钙≥8000mg，叶酸≥950mg；每公斤肉鸡多矿可提供：铜6000-18000mg，铁30000-150000mg，锰60000-125000mg，锌50000-100000mg，碘400-900mg，硒150-300mg。
[0050]
表3基础日粮中的营养成分(风干基础)
[0051]
[0052][0053]
肉鸡采用地面平养，自由采食饮水，免疫程序和驱虫程序按照鸡场常规同步进行。保持固定的饲喂时间，每天3次，保证水源充足、干净。随时观察，记录每日的投料量及剩余料量、鸡死亡淘汰情况，计算平均日采食量、平均日增重、耗料增重比。
[0054]
试验第20、41天晚上21:00停止供料，第22、43天早上7:00停水1h后，以每个重复为单位称取体重；试验第43天在每个重复中随机取1只鸡称其活体重，然后屠宰，打开腹腔，迅速分离选取的十二指肠、空肠、回肠、盲肠段。取十二指肠、空肠、回肠中段1-2cm肠段置于装有甲醛固定液的10ml离心管中，用于做切片检测，观察肠道形态。
[0055]
(1)不同饲喂条件对肉鸡生产性能的影响
[0056]
试验期间记录每天喂料量、剩料量、死淘鸡只数，计算平均日采食量、死淘率，并根据试验结束体重计算平均日增重和耗料增重比，结果如表4所示。
[0057]
表4肉鸡生长性能
[0058]
[0059][0060]
由表4可见，基础日粮中添加本发明提供的gaba饲料添加剂后，提高了肉鸡平均日采食量、平均日增重，降低了耗料增重比和死淘率；添加300g/t的10％gaba，显著提高了1-21日龄肉鸡平均日增重，显著降低1-21日龄耗料增重比；添加400g/t的10％gaba，显著提高了1-21日龄肉鸡平均日采食量、平均日增重，显著提高了1-42日龄平均日增重，显著降低了1-21日龄、1-42日龄耗料增重比。
[0061]
(2)不同饲喂条件对肉鸡肠道结构的影响
[0062]
取出甲醛中固定的十二指肠、空肠、回肠肠段，用石蜡包埋，采用伊红-美蓝对连续切片(5mm)进行染色。切片在光镜下观察测量，从每张切片中随机选取15根绒毛，分别测定绒毛高度和隐窝深度，并计算绒毛高度/隐窝深度。绒毛高度是指绒毛顶端到隐窝入口处，隐窝深度是指绒毛基部到黏膜下层做切片，观察肠道形态，结果如表5所示。
[0063]
表5肉鸡肠道结构检测结果
[0064][0065]
由表5可见，肉鸡日粮中添加本发明提供的gaba饲料添加剂后，提高了肉鸡十二指肠、空肠、回肠绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度比；添加300g/t的10％gaba，显著提高了十二指肠绒毛高度、空肠绒毛高度与隐窝深度比；添加400g/t的10％gaba，显著提高了十二指肠、空肠绒毛高度及绒毛高度与隐窝深度比。
[0066]
在每吨肉鸡日粮中添加200-400g功能性添加剂10％gaba能够改善肉鸡生长性能，提高平均日增重，降低耗料增重比和死淘率，改善肠道结构，从而提高肉鸡养殖效益。
[0067]
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。