一种鉴定三疣梭子蟹氨氮耐受性状的分子标记C49及其应用的制作方法

一种鉴定三疣梭子蟹氨氮耐受性状的分子标记c49及其应用
技术领域
1.本发明属于dna分子标记技术领域，具体涉及一种鉴定三疣梭子蟹氨氮耐受性状的分子标记c49及其应用。


背景技术：

2.三疣梭子蟹（portunus trituberculatus）属节肢动物门，甲壳纲，十足目，梭子蟹科，梭子蟹属，为主要分布于渤海、黄海、东海的重要海产经济蟹类。因其肉味鲜美，营养丰富，含蛋白质、维生素a、b1、b12和尼克酸，以及钙、磷、铁等元素，深受国内外消费者喜爱。自上世纪90年代开始，三疣梭子蟹人工养殖在我国迅速发展，至2019年养殖年产量已达11.38万吨。然而，随着养殖集约化程度的提高，养殖密度不断增大，饵料投入不断增加，致使养殖水体中的氮源过剩。过剩的有机氮能够被转化无机氮。氨氮被认为是养殖水体中毒性最高的无机氮。氨氮积累能够显著抑制三疣梭子蟹生长，造成组织损伤，甚至导致个体的大量死亡。因此，氨氮耐受性状是三疣梭子蟹重要的选育性状之一，对于提高养殖成活率和提升养殖效益至关重要。
3.分子标记是指反映个体间dna分子水平上遗传多态性的遗传标记。作为第三代分子标记，单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, snp）具有丰富度高、密度大、稳定性强、共显性等特点，已在分子标记辅助育种中得到了广泛的应用。目前，关于三疣梭子蟹氨氮耐受的分子标记还未见报道。因此，开发耐氨氮性状相关的分子标记对三疣梭子蟹遗传选育具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种鉴定三疣梭子蟹氨氮耐受性状的分子标记c49及其应用。所述分子标记c49能够准确高效的鉴定出三疣梭子蟹的氨氮耐受性状。
5.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：本发明提供了一种鉴定三疣梭子蟹氨氮耐受性状的分子标记c49，所述分子标记c49的核苷酸序列如seq id no.1所示。
6.进一步的，所述分子标记c49的核苷酸序列中第550位碱基为a或者g。
7.进一步的，所述分子标记c49的氨氮耐受基因型为ag基因型。
8.进一步的，所述分子标记c49为snp标记。
9.本发明还提供了所述的分子标记c49的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列如seq id no.2和seq id no.3所示。
10.本发明还提供了所述的分子标记c49在用于筛选具有氨氮耐受性状的三疣梭子蟹品种中的应用。
11.进一步的，所述筛选的步骤为：提取三疣梭子蟹待测样品的dna作为模板，利用所述分子标记c49的扩增引物c49-forward和c49-reverse进行pcr扩增，得到的pcr产物进行测序，若测序结果中所述分子标记c49的基因型为ag，则该三疣梭子蟹待测样品具有氨氮耐
受性状。
12.进一步的，所述pcr扩增的条件为：94 ℃预变性30 sec；98 ℃变性10 sec，55 ℃退火15 sec，72 ℃延伸10 sec，重复35个循环。
13.本发明还提供了所述的扩增引物在用于制备筛选三疣梭子蟹氨氮耐受品种的试剂中的应用。
14.本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：1. 本发明所述的snp标记c49与三疣梭子蟹耐氨氮的性状紧密关联，通过分子标记c49能够从分子水平对耐氨氮的三疣梭子蟹个体进行鉴定和筛选，且方法简单、准确可靠，且不受外界环境条件以及个体所处的生长发育阶段限制，还能够在早期进行选择，从而有效加快耐氨氮三疣梭子蟹新品种的选育进程。
15.2. 本发明的鉴定方法实用性强，对于三疣梭子蟹基因组dna的提取方法和dna测序的方法没有特定的要求，方法简单、高效，且检测的成本低，适用性广，可用于大范围筛选具有耐氨氮性状的个体，有效降低选育成本。因此，所述分子标记c49和通过该分子标记设计得到的引物对，以及鉴定方法均具有广阔的应用前景。
附图说明
16.图1为分子标记c49的部分测序结果。
具体实施方式
17.以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
18.本发明所用的三疣梭子蟹均取自中国水产科学研究院下营增殖站，选择体重为50
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5g，且活力好、无伤痕的梭子蟹200只，放置于4个室内养殖池（500cm
×
300cm
×
150cm）中暂养7d。暂养期间，水温保持在23
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1℃，盐度为30
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1，ph为8.0
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0.3，氨氮浓度低于0.01 mg/l，水深20 cm，持续供氧。每天上午8点更换已过滤的海水约1/2，下午投喂新鲜杂鱼，投喂量约为三疣梭子蟹总重量的1/5。
19.暂养结束后，将200只梭子蟹随机分配到4个室内养殖池中，每个养殖池放置50只。池内海水氨氮浓度已用氯化铵（nh4cl）调至80 mg/l，其他水质条件均与暂养期间保持一致。氨氮胁迫的前48h，海水氨氮维持在80 mg/l，每2h记录三疣梭子蟹的死亡时间。48h后，逐渐将海水的氨氮浓度升高，每两天提升40 mg/l，记录养殖池中三疣梭子蟹的存活个体数量，直至剩余20只三疣梭子蟹时终止实验。氨氮胁迫过程中，最先死亡的20个三疣梭子蟹个体认为是氨氮敏感组（记为as组），最后存活的20个个体认为是氨氮耐受组（记为ar组）。解剖上述三疣梭子蟹个体，取肌肉组织放置于冻存管中，在液氮中速冻，保存于-80℃冰箱备用。
20.实施例1一、耐氨氮性状相关分子标记筛选1. 建库、测序和数据分析采用天根生化科技有限公司的海洋动物组织基因组dna提取试剂盒，通过硅基质材料吸附柱进行基因组dna提取。具体步骤为：（1）取25 mg左右的三疣梭子蟹个体的肌肉组织，放入装有200 μl缓冲液ga的离心
管中，涡旋振荡15 sec，加入20 μl proteinase k（20 mg/ml）溶液，涡旋混匀后，于56℃放置至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
21.（2）加入200 μl缓冲液gb，充分颠倒混匀，70℃放置10 min，至溶液变清亮，加入200 μl无水乙醇，充分颠倒混匀。
22.（3）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中，12,000 rpm离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放回收集管中；向吸附柱cb3中加入500 μl缓冲液gd，12,000rpm离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中。
23.（4）向吸附柱cb3中加入600 μl漂洗液pw，12,000 rpm离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中，重复该步骤。
24.（5）将吸附柱cb3放回收集管中，12,000 rpm (~13,400
×
g) 离心2 min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μl洗脱缓冲液te，室温放置5 min，12,000 rpm离心2 min，将dna溶液收集到离心管中。
25.（6）通过琼脂糖凝胶电泳分析dna的完整性是否有rna、蛋白质污染；利用nanodrop检测dna的纯度和浓度（od260/280比值）；利用qubit对dna浓度进行精确定量。
26.将检验合格的基因组dna样品等量混合为两个混合池，即氨氮耐受组dna混合池（ar）和氨氮敏感组dna混合池（as）。将基因组dna用covaris 破碎仪随机打断成长度为350 bp的片段，末端修复和加a尾后在片段两端分别连接上接头制备dna文库。文库构建完成后，先使用qubit 2.0 进行初步定量，随后使用agilent2100对文库的insertsize进行检测，insertsize符合预期后，使用qpcr方法对文库的有效浓度进行准确定量，以保证文库质量。库检合格后进行illumina hiseq2500平台pe150 测序。高通量测序得到的原始图像数据文件经casava 碱基识别（base calling）分析转化为raw reads。将raw reads进行过滤，将含有接头的reads和n的比例大于10%的reads去掉，得到clean reads，用于后续数据分析，测序数据结果详见表1。
27.表1 测序数据质量汇总表组别原始数据(bp)过滤后数据(bp)有效率(%)错误率(%)q30(%)as29,420,319,90028,274,686,50099.650.03286.77ar24,673,666,80023,884,505,70099.720.03287.002. 标记检测和注释采用burrows-wheeler alignment tool（bwa）软件将clean reads与参考基因组做比对，利用samtools软件进行格式转换并排序。采用genome analysis toolkit（gatk）软件call snp，利用annovar 软件对snp位点进行注释，确定变异位点及对应的基因等信息。获得的snp位点信息如表2所示。
28.表2 snp检测统计及位点信息种类snp数量上游6,458下游5,168外显子5,227内含子80,316
基因间区274,726合计371,8953. snp频率差异分析和标记筛选分别计算氨氮耐受组和敏感组每个位点的snp-index，为尽可能减少测序错误和比对错误造成的影响，过滤多态性位点，过滤标准如下：（1）snp-index小于0.2，并且snp深度小于7的位点；（2）深度小于7且基因型是杂合的位点。
29.同时计算snp频率差异分布，过滤
△
index 小于0.4的位点，
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index=index（氨氮耐受性状）
‑ꢀ
index（氨氮敏感性状），最后得到组间差异的snp 362个。将
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index按从高到低顺序排列，选择前50个snp进行验证。
30.二、耐氨氮性状相关分子标记验证采用pcr产物dna测序的方法在氨氮耐受群体和氨氮敏感群体中对相关分子标记进行验证。利用primer 3.0在线系统在标记位点两侧设计特异性引物，确保至少有一条引物距离标记位点不低于80 bp。利用设计的特异性引物，以氨氮耐受群体和氨氮敏感群体的混合基因组dna为模板，进行pcr扩增。pcr反应体系为25μl，包含：模板（浓度约为100 ng/μl）1 μl，正向引物（10 μm）0.5 μl，反向引物（10 μm）0.5 μl，2x apexhf fs pcr master mix 12.5 μl，rnase free h2o 10.5 μl。pcr扩增程序设置为：94 ℃预变性30 sec；98 ℃变性10 sec，55 ℃退火15 sec，72 ℃延伸10 sec，重复35个循环。pcr产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，选择条带单一且清晰的样品送至生工生物工程股份有限公司进行dna测序。
31.利用contigexpress软件分析测序峰图，选择敏感群体混合模板和耐受群体混合模板两组对应位置差异明显的引物，并继续用该引物，以个体dna为模板进行pcr扩增，扩增条件保持不变，然后挑选大小符合且明亮的条带送去测序。通过spss 19.0软件，利用卡方检验对氨氮耐受群体和氨氮敏感群体差异snp位点的基因型频率进行差异检验，p＜0.05视为存在显著性差异，反之则认为不存在显著差异。
32.根据表3和图1所示，在c49位点存在3种基因型，其中，基因型为ag的在氨氮耐受群体中的比例为65.0%，在氨氮敏感组的比例为30.0%。氨氮耐受组和敏感组在该位点存在显著性差异（p《0.05），表明该标记与氨氮耐受性状存在显著相关性。因此，可认为在该位点基因型ag为氨氮耐受基因型。由此得到三疣梭子蟹耐氨氮的分子标记c49。分子标记c49的核苷酸序列如seq id no.1所示，部分测序结果如图1所示，其中扩增分子标记c49的引物c49-forward和c49-reverse的核苷酸序列如seq id no.2和seq id no.3所示（详见表4）。
33.表3 c49分子标记的基因型结果表4 分子标记的扩增引物
本发明获得的分子标记c49能够用来辅助选育三疣梭子蟹氨氮耐受品种，且应用步骤简单，只需提取三疣梭子蟹待测样品的dna并将其作为模板，使用分子标记c49的扩增引物核苷酸序列如seq id no.2和seq id no.3所示的c49-forward和c49-reverse进行pcr扩增，并将pcr产物进行测序，若测序结果中分子标记c49的基因型为ag，则待测样品可以选择作为培育三疣梭子蟹氨氮耐受品种的亲本。
34.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。