一种高盐稀态酿造酱油的减盐发酵方法与流程

1.本发明涉及一种高盐稀态酿造酱油的减盐发酵方法，属于发酵工程技术领域。


背景技术：

2.酱油起源于中国，由酱演变而来，生产历史悠久且具有民族特色，其发展凝聚着我国劳动人民的智慧。近年来，酱油因其味道鲜美、口感醇厚，其消费市场从亚洲扩张到欧美国家，深受各国人民喜爱。酱油是在丝状真菌(酱油曲霉或米曲霉)产生的复杂酶系作用下，把富含蛋白质和淀粉的原料(大豆和小麦)水解、催化成各种小分子物质，然后经过酱醪中多种微生物的发酵酿制而成。
3.高盐稀态酱油以丰厚的酯香和醇香闻名，但是其16g-18g
·
100ml-1
的盐含量与低盐健康饮食的发展趋势不相符。盐的过度消费是一个全球性的健康问题，并被广泛认为是导致心血管疾病、中风和肾脏疾病的原因(rhee,m.y.sodium intake reduction in real world，korean circ.j.2020,50(5),441-442.)。如今，中国人平均每天人均消费10.5克盐，而欧洲消费水平为人均7-13克，均高于世界卫生组织(2012年)建议的5克。因此，《中国工业减盐计划》建议2030年前人均食盐摄入量减少20％(中国营养学会，2018)。目前国内以高盐稀态工艺生产的低盐酱油减盐幅度为25％-30％，个别可达45％，酱油中盐含量为≤12g
·
100ml-1
，达≤9g
·
100ml-1
超低水平的较少见。综合来看，添加防腐剂、减盐25％-30％、标示盐分≤12g
·
100ml-1
的产品属于低盐酱油，而不使用防腐剂、减盐40％以上或标示盐分≤9g
·
100ml-1
的酱油产品为最高水平。虽然酱油可以用低盐固态发酵工艺来生产，但此方法酿造的酱油与高盐稀态酿造酱油在风味组成、理化特性和烹饪需求等方面有显著差异，是两种不同类型的酱油。因此，低盐固态法生产的酱油不能替代高盐稀态酿造酱油，而高盐稀态酱油的酿造也不能采用低盐固态酱油减少水活度和进行高温发酵的方式来实现减盐发酵。因此，低盐分的高盐稀态酱油往往通过发酵后脱盐、在发酵过程中调整发酵度、降低发酵温度或提高环境无菌程度来实现，且需要通过添加防腐剂来保证产品货架期的质量稳定性。无论是脱盐处理还是调整发酵度和控制发酵条件，都会显著增加生产成本，还可能使产品的风味、质量指标和食品安全性有所下降。因此，利用有益微生物协同作用发酵进行酱油的减盐发酵对于推动如高盐稀态酿造酱油这类高端酱油的低盐发酵技术的开发和应用以及实现低盐高端酱油的量产和推广具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种低盐酱油的发酵技术，通过变革高盐稀态酱油的微生物发酵工艺，在不改变酱油风味和质量的同时保证酱油低盐发酵正常进行，减少酱油中的杂菌与腐败菌数量，降低酱油中生物胺含量和提高酱油货架期质量稳定性。
5.本发明提供了一株类肠膜魏斯氏菌(weissella paramesenteroides)jl-5，已于2021年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2021707。
6.本发明还提供所述类肠膜魏斯氏菌jl-5的培养方法，是将所述类肠膜魏斯氏菌jl-5在含碳源、氮源和无机盐的培养基中，于适宜的温度下培养。
7.在一种实施方式中，所述方法是将所述类肠膜魏斯氏菌jl-5接种至mrs培养基中，在30～40℃，或35～37℃，或37℃静置培养。
8.本发明还提供一株解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)jdf-2，已于2021年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2021737。
9.本发明还提供了含类肠膜魏斯氏菌jl-5和/或解淀粉芽孢杆菌jdf-2的发酵剂、麦曲、麸曲或其它类型的发酵用曲。
10.本发明还提供所述类肠膜魏斯氏菌jl-5、解淀粉芽孢杆菌jdf-2在单独或共同用于酿造调味品生产中的应用。
11.在一种实施方式中，所述调味品是酱油。
12.在一种实施方式中，所述应用包括但不限于(a)～(e)中的至少一方面：
13.(a)减少酱油体系中腐败菌的数量；
14.(b)使酱油中盐含量≤12g
·
100ml-1
；
15.(c)降低酱油体系中生物胺的含量；
16.(d)提高酱油货架期的质量稳定性；
17.(e)促进酱油体系中风味物质的形成。
18.在一种实施方式中，所述酱油包括但不限于不添加防腐剂的酱油。
19.在一种实施方式中，所述腐败菌包括但不限于：枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、耐盐芽孢杆菌(bacillus halodurans)、巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)、腐生葡萄球菌(staphylococcus saprophytics)、佐氏库特氏菌(kurthia zopfii)和吉氏库特氏菌(kurthia gibsonii)、破布子乳杆菌(lactobacillus pobuzihii)中的至少一种。
20.本发明还提供一种高盐稀态酱油的减盐发酵方法，是将制好的成曲与盐水以体积比1:(2～3)的比例混合，使体系内盐含量终浓度≤12g
·
100ml-1
，再于25～30℃发酵至少30天，发酵期间每天进行搅拌。
21.在一种实施方式中，所述方法是将制好的成曲与盐水以体积比1：(2-3)的比例混合，使体系内盐含量终浓度9～12g
·
100ml-1
，再于25～30℃发酵30天，发酵期间进行至少一次的搅拌。
22.在一种实施方式中，所述方法具体是：将含200g
·
l-1
nacl的盐水以体积比1：(2～3)的比例混合，使酱醪体系内盐含量终浓度达到12g
·
100ml-1
，于发酵第5d添加107cfu
·
g-1
的鲁氏接合酵母zq01，于30℃发酵40天，发酵期间每天搅拌一次。
23.本发明还提供所述方法在高盐稀态酱油生产中的应用。
24.在一种实施方式中，所述高盐稀态酱油生产包括制曲工艺和发酵工艺。
25.在一种实施方式中，所述制曲工艺是：将脱脂大豆和小麦粉以6：4比例混合均匀，再将酱油曲精以占物料(脱脂大豆与小麦粉混合后)总质量的1.5
‰
的量加入并混匀，在30℃培养48h，适时翻曲，直至曲料表面长满黄绿色菌丝即为成曲。
26.在一种实施方式中，所述高盐稀态酱油生产包括如下步骤：
27.(1)制曲：将脱脂大豆用1.2倍的水混合均匀，在121℃下灭菌15min，冷却至室温，
再与适量炒熟的小麦粉以6:4的质量比混合均匀，再加入占脱脂大豆与小麦粉混合后总重1.5
‰
的酱油曲精，充分拌匀，在30℃培养，适时翻曲，制曲48h，曲料表面长满黄绿色菌丝即为成曲；
28.(2)发酵：将制好的成曲与含200g
·
l-1
nacl的盐水以体积比1：(2～3)的比例混合，使混合均匀后的酱醪体系内盐含量终浓度达到12g
·
100ml-1
，并在开始发酵前添加107cfu
·
g-1
的鲁氏接合酵母zq01，30℃发酵40天，发酵期间每天搅拌一次。
29.在一种实施方式中，步骤(2)还接种类肠膜魏斯氏菌jl-5和/或解淀粉芽孢杆菌jdf-2；所述类肠膜魏斯氏菌jl-5和解淀粉芽孢杆菌jdf-2在发酵体系中的终浓度为1.0
×
106～1.0
×
108cfu
·
g-1
。
30.在一种实施方式中，所述类肠膜魏斯氏菌jl-5在含12g
·
100ml-1
的酱醪环境中的浓度至少为1.0
×
107cfu
·
g-1
。
31.在一种实施方式中，所述类肠膜魏斯氏菌jl-5或含类肠膜魏斯氏菌jl-5的发酵剂与所述解淀粉芽孢杆菌jdf-2同时添加。
32.在一种实施方式中，所述类肠膜魏斯氏菌jl-5与所述解淀粉芽孢杆菌jdf-2的菌体数量比为1：1。
33.本发明还提供了所述方法发酵获得的原油，其盐含量为≤12g
·
100ml-1
，钠含量为380～420mg
·
10ml-1
，氨基酸态氮≥1.2g
·
100ml-1
。
34.在一种实施方式中，所述发酵获得的原油中的盐含量达9.8g
·
100ml-1
，钠含量为412mg
·
10ml-1
，氨基酸态氮≥1.2g
·
100ml-1
。
35.本发明还提供一种提高低盐酱油货架期稳定性的方法，是在低盐酱油酿造前加入解淀粉芽孢杆菌与类肠膜魏斯氏菌协同发酵，在低盐酱油发酵体系中解淀粉芽孢杆菌的浓度至少在1.0
×
106～1.0
×
108cfu
·
g-1
，类肠膜魏斯氏菌的浓度至少在1.0
×
107cfu
·
g-1
以上。
36.有益效果：
37.1、本发明通过对酱醪微生物分离纯化，得到一株能显著抑制低盐酱油发酵过程中巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)、耐盐芽孢杆菌(bacillus halodurans)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、腐生葡萄球菌(staphylococcus saprophytics)等杂菌或腐败菌的类肠膜魏斯氏菌jl-5，和能显著抑制低盐酱油发酵过程中佐氏库特氏菌(kurthia zopfi)、吉氏库特氏菌(kurthia gibsonii)、破布子乳杆菌(lactobacillus pobuzihii)等腐败菌生长的解淀粉芽孢杆菌jdf-2；本发明筛选获得的菌株可单独或共同用于制备调味品发酵剂或酿造食品用曲。
38.2、本发明将类肠膜魏斯氏菌(w.paramesenteroides)jl-5单独或与解淀粉芽孢杆菌(b.amyloliquefaciens)jdf-2共同用于酱油发酵，能够很好地抑制12g
·
100ml-1
盐浓度的低盐酱油发酵体系中杂菌和腐败菌的生长，并可使发酵制得低盐酱油的风味物质与18g
·
100ml-1
高盐稀态酱油相比，在酯类物质含量方面有显著提高。
39.3、本发明通过调节类肠膜魏斯氏菌(w.paramesenteroides)jl-5的添加量及添加方式，开发了新的高盐稀态酱油的微生物发酵工艺，使发酵获得的低盐酿造酱油风味物质含量不减少的情况下，生物胺含量、腐败菌和杂菌数量及盐含量均得到了显著降低。
40.4、本发明提供的高盐稀态酱油的微生物发酵工艺能够使获得的酱油盐含量低至
9.8g
·
100ml-1
，钠含量412mg
·
10ml-1
，氨基酸态氮≥1.2g
·
100ml-1
，在不添加任何防腐剂的情况下储存60d的酱油中微生物总数与传统的高盐稀态酱油无显著差异，符合国家卫生标准，具有良好的货架期质量稳定性。
41.生物材料保藏
42.类肠膜魏斯氏菌，分类命名为类肠膜魏斯氏菌(weissella paramesenteroides)jl-5，已于2021年6月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2021707，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心。
43.解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)jdf-2，已于2021年6月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no:m 2021737，保藏地址为中国，武汉，武汉大学，中国典型培养物保藏中心。
附图说明
44.图1为不同盐浓度发酵过程酱醪理化指标变化。
45.图2为不同盐浓度发酵制得酱油中生物胺含量的变化。
46.图3为不同盐浓度发酵制得酱油的风味物质含量及组成。
47.图4为不同盐浓度发酵过程酱醪中腐败生物含量的变化。
48.图5为不同发酵方法对酱油模拟发酵体系中腐败菌数量的影响。
49.图6为不同发酵方法对酱油理化指标的影响。
50.图7为不同发酵方法生产的酱油生物胺含量。
51.图8为不同发酵方法生产的酱油风味物质含量。
具体实施方式
52.菌种与材料：
53.鲁氏接合酵母zq01：公开于《酱油中氨基甲酸乙酯的产生机制和消除策略研究》，申请人承诺自申请日起20年内向公众发放该生物材料。
54.酱油曲精：酱油曲精是采用蛋白酶活力和糖化酶活力较高的米曲霉和黑曲霉经过干燥、分离提取有效的孢子，孢子含量≥10000个
·
g-1
。
55.培养基：
56.mrs培养基：蛋白胨10g
·
l-1
，牛肉浸粉8g
·
l-1
，酵母浸粉4g
·
l-1
，葡萄糖20g
·
l-1
，磷酸氢二钾2g
·
l-1
，柠檬酸氢二铵2g
·
l-1
，乙酸钠5g
·
l-1
，硫酸镁0.2g
·
l-1
，硫酸锰0.04g
·
l-1
，吐温80 1g
·
l-1
。
57.孟加拉红培养基：蛋白胨5g
·
l-1
，葡萄糖10g
·
l-1
，磷酸氢二钾1g
·
l-1
，硫酸镁0.5g
·
l-1
，琼脂20g
·
l-1
，1/3000孟加拉红溶液100ml
·
l-1
。
58.ypd培养基：酵母提取物10g
·
l-1
,蛋白胨20g
·
l-1
，葡萄糖20g
·
l-1
。
59.lb培养基：酵母提取物5g
·
l-1
，蛋白胨10g
·
l-1
，氯化钠10g
·
l-1
。
60.酱醪发酵培养基：将用于生产酱油的原料豆粕与小麦粉按1：1比例混合，添加4倍水(w/v)和高温淀粉酶(50u
·
kg-1
)蒸煮糊化1h，迅速冷却至60℃后加入糖化酶(120u
·
kg-1
)，于60℃条件下糖化2h，121℃、灭菌20min，即为模拟发酵培养基。
61.检测方法：
62.总酸浓度通过氢氧化钠滴定法测量。酱油酱醪样品的ph是使用ph计测量的。使用甲醛滴定法测量氨基酸氮浓度(测定方法参考文献《酱油发酵过程强化嗜盐四联球菌对酱油品质的影响》中的方法进行)。还原糖含量采用3,5-二硝基水杨酸法(dns)测定。盐含量测定使用硝酸银滴定法(参考《gb 5009.44-2016食品安全国家标准食品中氯化物的测定》)，钠含量测定使用原子吸收法(参考《gb 5009.91-2017食品安全国家标准食品中钾、钠的测定》)
63.生物胺含量的检测：
64.(1)标准溶液的配制生物胺(混标)标准溶液：分别从腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、色胺、组胺、酪胺和苯乙胺等8种生物胺溶液中(质量浓度为1000mg
·
l-1
)吸取1ml，置于10ml容量瓶中，用0.1mol
·
l-1
盐酸溶液定容至10ml，混匀，配制成质量浓度为100mg
·
l-1
生物胺标准混合液。生物胺标准系列溶液：用0.1mol
·
l-1
的盐酸将生物胺标准混合液稀释为质量浓度为5mg
·
l-1
、10.0mg
·
l-1
、25.0mg
·
l-1
、50.0mg
·
l-1
、100.0mg
·
l-1
的生物胺标准系列溶液，现用现配。内标标准使用液：称取适量1,7-二氨基庚烷，用0.1mol
·
l-1
的hcl溶液配制，质量浓度为100mg
·
l-1
。丹磺酰氯衍生剂：称取适量丹磺酰氯用丙酮溶解，配制的溶液质量浓度为10mg
·
ml-1
，现配现用。
65.(2)样品预处理：将准确量取10ml的酱油样品，置于50ml离心管中，加入20ml5％(w/v)三氯乙酸溶液，混匀，振荡提取60min，8000r
·
min-1
的离心10min取上清，连续提取两次，合并上清液，定容至25ml，滤纸过滤。精确吸取酱油样品提取液2ml于15ml离心管中，加入3ml正己烷，振荡2min，静置分层，8000r
·
min-1
的离心10min取上清液。
66.(3)样品衍生化：分别吸取500μl样品预处理液和生物胺标准系列溶液，各加入50μl内标(100mg
·
l-1
)，naoh溶液(2mol
·
l-1
)100μl和150μl饱和nahco3缓冲液，再加入75μl丹磺酰氯衍生溶液，混匀后置于45℃水浴锅避光反应50min，然后加入50μl氨水终止反应，在暗处静置30min后用乙腈定容至2.5ml，8000r
·
min-1
离心10min，取上清液用0.22um孔径滤膜过滤，供测定使用。
67.(4)生物胺的定量测定采用高效液相色谱(hplc)法。流动相a为乙腈、流动相b为超纯水，柱温为30℃，流速为0.8ml
·
min-1
，进样量为10μl，紫外检测波长为254nm。洗脱程序：0
–
7min，流动相a为55％，7
–
14min，流动相a为65％，然后在70％下保持6min，最后1min流动相a由70％恢复到55％。
68.挥发性风味物质采用固相微萃取联合气质联用技术(spme-gc-ms)进行测定，具体方法参考2020年公开的论文《强化嗜盐四联球菌对模拟低盐酱油发酵的影响》。
69.实施例1：高盐稀态酱油的减盐酿造
70.(1)制曲：
71.制曲用的原料包括：质量比为6:4的脱脂大豆和小麦粉；
72.具体步骤为：将脱脂大豆用1.2倍的水混合均匀，在121℃下灭菌15min，冷却至室温。然后再将脱脂大豆与小麦粉充分拌匀，再加入占混合后原料总质量1.5
‰
的酱油曲精，混合均匀后在生化培养箱中于28℃～30℃培养，适时翻曲，制曲40h～48h，曲料表面长满黄绿色菌丝即为成曲。
73.(2)发酵：将步骤(1)制好的成曲与含200g
·
l-1
nacl的盐水以体积比1:(2～3)的比例混合。将混合均匀酱醪分装入5l烧杯中，使体系内盐含量终浓度达到12g
·
100ml-1
,再添
加终浓度为107cfu
·
g-1
的鲁氏接合酵母zq01，于30℃发酵40天。发酵期间每天搅拌一次。
74.按照步骤(1)～(2)的方法，分别调整加入的盐水浓度，使用于发酵的体系的初始盐浓度分别为18g
·
100ml-1
，15g
·
100ml-1
，12g
·
100ml-1
和9g
·
100ml-1
，分别在第0，5，10，15，20，25，30，35和40天进行取样。
75.(a)高盐稀态酱油减盐酿造过程理化指标：
76.采集5g不同盐浓度的酱醪样品研磨并溶解在100ml的生理盐水中，检测理化指标。如图1所示，发酵40天后，在12g
·
100ml-1
及9g
·
100ml-1
的盐浓度下发酵的酱醪的氨基酸态氮含量显著下降为0.31g
·
100ml-1
及0.22g
·
100ml-1
，不符合酱油卫生标准(0.4g
·
100ml-1
)。总酸含量显著增高为10.5g
·
l-1
与10.1g
·
l-1
,ph值显著下降。在18g
·
100ml-1
与15g
·
100ml-1
的盐浓度下，发酵40天后的酱油的氨基酸态氮为1.18g
·
100ml-1
与1.08g
·
100ml-1
均符合国家特级酱油标准1g
·
100ml-1
，总酸含量为5.9g
·
l-1
与5.5g
·
l-1
。
77.(b)高盐稀态酱油减盐酿造原油中生物胺含量：
78.用高效液相色谱检测各盐浓度酱油中的生物胺含量。结果如图2所示，12g
·
100ml-1
及9g
·
100ml-1
盐浓度下发酵的酱油中生物胺含量及种类都显著高于18g
·
100ml-1
与15g
·
100ml-1
盐浓度发酵的酱油，发酵40天后的生物胺总量分别为612.423mg
·
l-1
与904.49mg
·
l-1
。而18g
·
100ml-1
与15g
·
100ml-1
盐浓度下，生物胺含量为18.99mg
·
l-1
与39.79mg
·
l-1
。
79.(c)减盐酿造酱油的风味变化：
80.发酵结束时(第40d)每个样品取三个平行样，过滤混匀后准确量取5ml酱油样品放置于20ml顶空进样瓶中，添加83.36μg
·
l-1
的2-辛醇作为内标，混匀后立刻密封，进行测定。测定后将样品质谱图与nist 2.0标准谱库比对鉴定。根据保留指数(ri)对挥发性物质进行定性。根据内标2-辛醇的面积对挥发性物质进行定量分析。
81.结果如图3所示，在盐浓度为12g
·
100ml-1
的条件下制备的低盐酱油的风味物质总含量有上升。酱油主体风味物质醇类和酯类含量有着显著下降，4-乙基愈创木酚含量下降32.3％；呋喃酮(hemf)含量下降25.4％；1-辛烯-3-醇含量下降18.4％；醇类物质含量下降了39.2％，为732.15μg
·
l-1
；酯类物质含量下降了44.59％，为92.33μg
·
l-1
。
82.(d)高盐稀态酱油减盐酿造过程腐败微生物的变化
83.宏基因组制备：称取适量酱醪样品置于烧杯中，用无菌生理盐水洗涤两次。将洗涤后的酱醪转移至研钵中，加入液氮，充分研磨使细胞破碎。然后使用powersoil dna isolation kit试剂盒，按照说明书操作提取微生物基因组。使用nano drop2000超微量分光光度计测定微生物基因组dna浓度并评估纯度。以巨大芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、库特氏菌、葡萄球菌、破布子乳杆菌的16s rdna序列设计特异性引物用于rt-pcr扩增。微生物的定量采用绝对定量法，即采用已知浓度的标准品制备标准曲线，对未知浓度的样品进行其拷贝数的测定。对标准品进行10倍梯度稀释，然后以标准品为模板进行rt-qpcr反应。反应完成时，以阈值循环数ct为横坐标，标准浓度的对数为纵坐标绘制标准曲线。
84.表1本专利所用引物
[0085][0086]
以枯草芽孢杆菌(bacillus.subtilis)，耐盐芽孢杆菌(bacillus halodurans)，巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)，腐生葡萄球菌(staphylococcus saprophytics)，佐氏库特氏菌(kurthia zopfii)，破布子乳杆菌(lactobacillus pobuzihii)作为腐败菌的代表微生物，结果如图4所示，在发酵初始，不同盐浓度酱油发酵体系中腐败菌的总量≤50cfu
·
g-1
。在盐浓度为12g
·
100ml-1
的酱醪样品中，发酵结束时枯草芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、腐生葡萄球菌、佐氏库特氏菌和破布子乳杆菌含量分别为5.3
×
104cfu
·
g-1
、1.1
×
104cfu
·
g-1
、8.3
×
105cfu
·
g-1
、3.4
×
104cfu
·
g-1
、1.4
×
105cfu
·
g-1
、2.5
×
104cfu
·
g-1
。在9g
·
100ml-1
盐浓度下发酵结束(40天)时枯草芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、腐生葡萄球菌、佐氏库特氏菌和破布子乳杆菌含量分别为9.5
×
104cfu
·
g-1
，2.1
×
104cfu
·
g-1
，1.1
×
106cfu
·
g-1
，4.4
×
105cfu
·
g-1
，2.5
×
105cfu
·
g-1
，3.6
×
104cfu
·
g-1
。在18g
·
100ml-1
盐浓度下发酵结束时枯草芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、腐生葡萄球菌、佐氏库特氏菌和破布子乳杆菌含量分别为2.8
×
102cfu
·
g-1
、1.3
×
102cfu
·
g-1
、1.6
×
103cfu
·
g-1
、1.5
×
102cfu
·
g-1
、6.1
×
102cfu
·
g-1
、1.1
×
102cfu
·
g-1
。在15g
·
100ml-1
盐浓度下发酵结束时的枯草芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、腐生葡萄球菌、库特氏菌和破布子乳杆菌含量分别为4.1
×
102cfu
·
g-1
，1.4
×
102cfu
·
g-1
，1.8
×
102cfu
·
g-1
，1.7
×
102cfu
·
g-1
，6.3
×
102cfu
·
g-1
，2.4
×
102cfu
·
g-1
。以上结果表明，将高盐稀态酱油的盐浓度降低后发酵制得的酱油中腐败菌含量显著上升。
[0087]
实施例2:抑制腐败菌微生物的筛选鉴定及抑菌谱
[0088]
(1)魏斯氏菌的筛选
[0089]
用含万古霉素(0.2g
·
l-1
)和纳他霉素(0.1g
·
l-1
)的mrs培养基从酱醪中分离和筛选魏斯氏菌。选取发酵第5、20、35天的酱醪样品，取15g酱醪置于烧杯中，加入135ml无菌生理盐水并加入适量的玻璃珠，100r
·
min-1
振荡5min，室温静止5min后取1ml菌悬液，梯度
28、t.halophilus r44、b.amyloliquefaciens jdf-2上清液，以加入无菌水作为对照，然后将平板置于培养箱中培养20h，考察菌株的发酵也对各指示菌是否有抑制作用。每个指示菌做3个平行。其中指示菌为来源于酱油的各种细菌。
[0103]
结果如表2所示，类肠膜魏斯氏菌jl-5对芽孢杆菌属(b.subtilis、b.megaterium、b.halodurans)的微生物有显著的抑制作用，其中对耐盐芽孢杆菌(b.halodurans)抑制效果最明显，抑菌圈直径达1.77cm。解淀粉芽孢杆菌jdf-2对佐氏库特氏菌(k.zopfii)吉氏库特氏菌(k.gibsonii)与破布子乳杆菌(l.pobuzihii)的抑制效果最明显。
[0104]
表3酱醪来源细菌对酱油中常见腐败菌的抑制作用
[0105][0106]
*，表中数据为抑菌圈直径(cm)
[0107]
实施例3：魏斯氏菌与解淀粉芽孢杆菌协同发酵制备高盐稀态法的减盐酱油
[0108]
类肠膜魏斯氏菌的培养：挑取实施例2筛选获得的类肠膜魏斯氏菌jl-5单菌落接种到mrs培养基中，37℃静置培养24h，按1％(v/v)比例转接至新鲜mrs培养基，于37℃培养至od
600
达到3.0。
[0109]
解淀粉芽孢杆菌的培养：挑取解淀粉芽孢杆菌jdf-2单菌落接种到液体lb培养基中，37℃静置培养24h，按1％(v/v)比例转接至新鲜lb培养基，于37℃培养至od
600
达到3.0。
[0110]
鲁氏接合酵母的培养：挑取鲁氏接合酵母单菌落接种到液体ypd培养基中，37℃、220r
·
min-1
培养30h，按1％(v/v)比例接种至新鲜ypd培养基，培养至od
600
达到4.0。
[0111]
低盐稀态酱油发酵工艺：
[0112]
(1)制曲工艺：将脱脂大豆用1.2倍的水混合均匀，在121℃下灭菌15min，冷却至室温。将脱脂大豆、小麦粉以6:4的质量比充分拌匀，再加入占混合后原料总质量1.5
‰
的酱油曲精，混合均匀后，于30℃培养，适时翻曲，制曲48h，曲料表面长满黄绿色菌丝即为成曲。
[0113]
(2)发酵工艺：将步骤(1)制好的成曲与nacl的盐水以体积比1:2.5的比例混合，在发酵开始前添加107cfu
·
g-1
鲁氏接合酵母zq01，于30℃发酵40天。发酵期间每天搅拌一次。
[0114]
共设置6组酱醪用于发酵，具体如下：
[0115]
(a)a组：控制步骤(2)混合盐水后酱醪的盐浓度为18g
·
100ml-1
；
[0116]
(b)b组：控制步骤(2)混合盐水后酱醪的盐浓度为12g
·
100ml-1
；
[0117]
(c)c组：控制步骤(2)混合盐水后酱醪的盐浓度为12g
·
100ml-1
，并向酱醪体系中添加终浓度为1.0
×
107cfu
·
g-1
类肠膜魏斯氏菌jl-5；
[0118]
(d)d组：控制步骤(2)混合盐水后酱醪的盐浓度为12g
·
100ml-1
，并向酱醪体系中添加终浓度为1.0
×
107cfu
·
g-1
解淀粉芽孢杆菌jdf-2；
[0119]
(e)e组：控制步骤(2)混合盐水后酱醪的盐浓度为12g
·
100ml-1
，并向酱醪体系中
添加终浓度为1.0
×
107cfu
·
g-1
类肠膜魏斯氏菌jl-5和终浓度为1.0
×
107cfu
·
g-1
的解淀粉芽孢杆菌jdf-2；
[0120]
(f)f组:控制步骤(2)混合盐水后酱醪的盐浓度为12g
·
100ml-1
，省略鲁氏接合酵母的添加，并向酱醪体系中添加终浓度为1.0
×
107cfu
·
g-1
类肠膜魏斯氏菌jl-5和终浓度为1.0
×
107cfu
·
g-1
的解淀粉芽孢杆菌jdf-2。
[0121]
分别对a～f组酱油样品进行理化指标的检测。结果表明：a组与e组可以使氨基酸态氮含量达到为1.2g
·
100ml-1
和1.16g
·
100ml-1
，总酸含量达到8.1g
·
l-1
和7.5g
·
l-1
。c组与f组的氨基酸态氮含量分别可达1.08g
·
100ml-1
和1.04g
·
100ml-1
，d组氨基酸态氮含量较低，仅为0.85g
·
100ml-1
，但以上各组发酵的酱油均符合国家标准。b组氨基酸态氮含量为0.38g
·
100ml-1
不符合国家标准。
[0122]
对不同菌株添加方式酱油样品中的挥发性物质含量进行检测，结果如图8所示：e组风味物质总含量为2674.39μg
·
l-1
，与b组相比增加20.64％；其中酯类物质含量为437.72μg
·
l-1
，与b组相比提高3.74倍；醇类物质含量为1181.66μg
·
l-1
与b组相比提高70.72％。这表明类肠膜魏斯氏菌jl-5和解淀粉芽孢杆菌jdf-2可以共同促进酱油中风味物质的形成。单独添加类肠膜魏斯氏菌的c组和单独添加解淀粉芽孢杆菌的d组的风味物质含量分别为2283.84μg
·
l-1
与2252.86μg
·
l-1
，酯类物质含量相比于b组分别提高2.9倍与2.7倍，但醇类物质分别降低了26％与14.4％；f组发酵的酱油中风味物质总量提高至2430.7μg
·
l-1
，酯类物质提高3.3倍，醇类物质含量降低了9.7％。
[0123]
对不同添加方式的酱油样品中生物胺含量进行检测，结果表明e组与b组相比，生物胺总量为93.365mg
·
l-1
，降低了84.65％；其中组胺和酪胺含量为21.21mg
·
l-1
和12.332mg
·
l-1
，分别下降90.06％和92.53％。c组与f组生物胺总量分别为179.8mg
·
l-1
、216.1mg
·
l-1
，与b组比分别降低了70.6％与64.7％。
[0124]
实施例4：应用类肠膜魏斯氏菌抑制酱油体系中的腐败菌
[0125]
在酱醪发酵培养基中，将盐浓度控制在10g～12g
·
100ml-1
后，将杂菌和腐败菌(枯草芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，耐盐芽孢杆菌，腐生葡萄球菌，破布子乳杆菌，佐氏库特氏菌)以等比例且总浓度为1.0
×
106cfu
·
ml-1
的添加量加入酱醪发酵培养基中，用于模拟发酵，然后按照如下方式将能够抑制腐败菌生长的菌株接入模拟发酵体系，以验证菌株在体系内抑制腐败菌生长的情况。
[0126]
菌株添加方式：
[0127]
(1)以1.0
×
107cfu
·
g-1
的终浓度，菌体数量比为1：1添加类肠膜魏斯氏菌jl-5与解淀粉芽孢杆菌jdf-2。
[0128]
(2)以1.0
×
107cfu
·
g-1
的终浓度单独添加嗜盐四联球菌(tetragenococcus halophilus)r44；所述嗜盐四联球菌r44公开于2020年公开的论文《强化嗜盐四联球菌对模拟低盐酱油发酵的影响》；
[0129]
(3)以1.0
×
107cfu
·
g-1
的终浓度单独添加类肠膜魏斯氏菌lcw-28；所述类肠膜魏斯氏菌lcw-28公开于2020年公开的专利《一种提高酱油风味物质含量的方法》；
[0130]
(4)以1.0
×
107cfu
·
g-1
的终浓度分别单独添加窦氏魏斯氏菌35和融合魏斯氏菌20；所述食窦魏斯氏菌35与融合魏斯氏菌20公开于2018年公开的论文《魏斯氏菌在酱油发酵过程的含量变化及特性研究》。
[0131]
结果如图5所示，单独添加类肠膜魏斯氏菌jl-5后，发酵第20d时，巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌以及腐生葡萄球菌的含量分别为1.2
×
103cfu
·
g-1
、6.3
×
103cfu
·
g-1
、1.1
×
104cfu
·
g-1
与1.3
×
103cfu
·
g-1
，与对照组相比以上腐败菌受到了明显的抑制，而佐氏库特氏菌与破布子乳杆菌数量未显著减少。
[0132]
单独添加解淀粉芽孢杆菌jdf-2可显著抑制发酵体系中的破布子乳杆菌与佐氏库特氏菌，使发酵第20d时菌体浓度分别降低至1.0
×
104cfu
·
g-1
与2.3
×
105cfu
·
g-1
，对其它腐败菌与杂菌无显著抑制作用。
[0133]
共同接种类肠膜魏斯氏菌jl-5与解淀粉芽孢杆菌jdf-2可以显著抑制6种腐败菌的生长，在发酵第20d，巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、腐生葡萄球菌、佐氏库特氏菌以及破布子乳杆菌含量分别降低至1.0
×
103cfu
·
g-1
、6.1
×
103cfu
·
g-1
、6.7
×
103cfu
·
g-1
、1.0
×
103cfu
·
g-1
、8.2
×
103cfu
·
g-1
与5.3
×
103cfu
·
g-1
。
[0134]
实施例5：应用魏斯氏菌和/或解淀粉芽孢杆菌制备低盐酱油
[0135]
制曲工艺：将脱脂大豆用1.2倍的水混合均匀，将脱脂大豆在100～121℃下灭菌至少15min，冷却至室温。再将脱脂大豆与小麦粉以6:4的质量比充分拌匀，加入占原料总质量1.5
‰
的酱油曲精与其混合均匀，于30℃培养，适时翻曲，制曲40～48h，曲料表面长满黄绿色菌丝即为成曲。
[0136]
发酵工艺：将制好的成曲与含150～250g
·
l-1
nacl的盐水以体积比1:(2～3)的比例混合。将混合均匀后的酱醪进行发酵，使体系内盐含量终浓度达到(10g～12)g
·
100ml-1
,于30℃发酵40d-60d天。发酵前期每天搅拌一次，发酵后期每周搅拌两次。
[0137]
菌株的添加：向拌入盐水后的酱醪中以3％～5％接种量加入类肠膜魏斯氏菌jl-5与解淀粉芽孢杆菌jdf-2，使接种后的菌体数量级不低于1
×
107cfu
·
g-1
，当酱醪ph为5.0-5.5时以3％的接种量加入鲁氏接合酵母，使接种后的菌体数量级不低于1
×
108cfu
·
g-1
。
[0138]
发酵过程中的指标监控：腐败菌(枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、耐盐芽孢杆菌、佐氏库特氏菌、破布子乳杆菌、腐生葡萄球菌)含量≤1.0
×
104cfu
·
g-1
，氨基酸态氮含量控制在≥1g
·
100ml-1
,总酸含量≤12g
·
l-1
，ph控制在5～5.5。
[0139]
发酵后成品：氨基酸态氮≥1.2g
·
100ml-1
，各种腐败菌低于1.0
×
103cfu
·
g-1
，nacl浓度为10g～12g
·
100ml-1
，钠含量为380mg～420mg
·
10ml-1
。
[0140]
实施例6：应用类肠膜魏斯氏菌和解淀粉芽孢杆菌提高低盐酱油货架期质量稳定性
[0141]
按照实施例3的方法制备酱油，并按如下方法将酱油分为4组，分别是：
[0142]
a组：按照实施例3中b组的方法制备发酵初始盐浓度为12g
·
100ml-1
的酱油；
[0143]
b组：在a组制备的酱油的基础上添加终浓度为1g
·
l-1
的山梨酸钾；
[0144]
c组：按照实施例3中a组的方法制备发酵初始盐浓度为18g
·
100ml-1
的酱油；
[0145]
d组：按照实施例3中e组的方法制备酱油。
[0146]
将发酵结束后酱醪用纱布挤压过滤制得原油，将原油在121℃灭菌20min，装入1l无菌玻璃瓶，密封后在常温下放置0-60d。在第0d，10d，30d，60d时取样。
[0147]
根据酱油卫生标准(gb2717-2018)规定，酱油中的菌落总数应该低于5
×
103cfu
·
ml-1
，大肠菌群低于10cfu
·
ml-1
。结果表明：在储存第10d时，a组菌落总数为3.2
×
104cfu
·
ml-1
，不符合酱油卫生标准。储存第30d时a组微生物总数达到6.8
×
107cfu
·
ml-1
，超过酱油
卫生标准4个数量级；b组达到4.1
×
104cfu
·
ml-1
，不符合酱油卫生标准；c组和d组均符合酱油卫生标准。在储存第60d，c组与d组菌落总数均低于5
×
103cfu
·
ml-1
，符合酱油卫生标准；而a组菌落总数为6.2
×
109cfu
·
ml-1
，b组也达3.5
×
105cfu
·
ml-1
，均已超过酱油卫生标准。以上结果证实，类肠膜魏斯氏菌与解淀粉芽孢杆菌协同发酵制得的低盐酱油，在不添加任何防腐剂的情况下保持良好的货架期质量稳定，对延长不添加防腐剂低盐酱油的货架期具有重要意义。用此方法制备的酱油储存60d时其微生物总数与高盐稀态酱油无显著差异，符合酱油卫生标准。本专利添加类肠膜魏斯氏菌jl-5与解淀粉芽孢杆菌jdf-2协同发酵的低盐酱油比添加防腐剂的低盐酱油的货架期质量稳定性更好。
[0148]
表4不同储存时间低盐酱油微生物变化
[0149][0150]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。