人工重组的H5N8流感病毒及其制备方法和应用与流程

人工重组的h5n8流感病毒及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明涉及反向遗传学技术和动物传染病技术领域，具体涉及一种人工重组并致弱的 h5n8亚型重组流感病毒及其制备方法和应用。


背景技术：

2.禽流感病毒(avian influenza virus，aiv)是一种能广泛感染禽类和哺乳动物的分节段的负 链rna病毒。根据病毒的表面蛋白，aiv被分为16个血凝素(ha)和9个神经氨酸酶(na) 亚型。其中，h5和h7亚型aiv可在家禽或野鸟中引起疫情，导致重大经济损失，也可感 染人类，引起公共卫生危害。中国研制出一系列全病毒灭活苗，成功控制了2004年以来的 h5n1和2017年以来h7n9亚型禽流感。
3.为应对我国可能出现的家禽h5n8疫情和公共卫生危害，本发明进行了人工重组的 h5n8禽流感疫苗株的研制。
4.理想的流感病毒疫苗株应具备与流行株良好的抗原匹配性，对鸡胚无致病力及鸡胚高滴 度生长性等条件。然而，很难从自然界分离具备上述条件的流感毒株作为疫苗株。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题为：提供一种人工重组的h5n8流感病毒及其制备方法和应 用。
6.本发明的技术方案为：重组的h5n8禽流感病毒，以高致病性h5n8亚型禽流感病毒 a/swan/shanxi/4-1/2020(h5n8)为表面抗原血凝素(ha)和神经氨酸酶(na)基因供体，但 ha裂解位点具有典型低致病性禽流感病毒分子特征(-retr-)；以流感病毒鸡胚高滴度适 应株a/pr/8/34(h1n1)的pb2，pb1，pa，np，m和ns基因为6个内部基因的供体，通 过反向遗传操作方法，人工重组得到了1株重组的h5n8禽流感病毒，命名为a型流感病 毒a/harbin/h5-re14/2021(h5n8)(简称为h5-re14株)，保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址在中国武汉的武汉大学，其保藏号为cctcc no：v202160，保藏时间为2021年8月 3日。
7.本发明选用流感病毒的可在鸡胚内生长至很高滴度的实验室鸡胚适应株a/pr/8/34 (h1n1)的6个内部基因作为骨架基因，并选用2020年分离得到的高致病性禽流感病毒株 a/swan/shanxi/4-1/2020(h5n8)的ha和na基因作为表面基因，利用反向遗传学人工构建方 法，制备了致弱的重组病毒h5-re14株，该重组毒株将可作为h5n8流感的疫苗株。
8.实验证实，h5-re14株病毒与我国h5n8禽流感病毒流行株a/swan/shanxi/4-1/2020 (h5n8)抗原性一致，制备疫苗免疫鸡后将对h5n8流感病毒流行株a/swan/shanxi/4
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1/2020(h5n8)的攻击产生良好的特异保护效果。该病毒含有流感病毒鸡胚高滴度适应株 a/pr/8/34(h1n1)的6个内部基因，因此具有良好的鸡胚适应性，病毒生长滴度与野毒相 比，可提高9倍以上；以此为疫苗株生产疫苗，可大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量。
9.进一步地，本发明还提出了所述的重组的h5n8禽流感病毒(h5-re14株)在制备预防 h5n8流感病毒所导致疾病的药物中的应用。
10.进一步地，所述h5n8流感病毒为a/swan/shanxi/4-1/2020(h5n8)毒株。
11.更进一步地，本发明还提出了一种构建所述的重组h5n8禽流感病毒的方法，该方法包 括：
12.(1)使用ha基因特异性扩增和突变引物，利用rt-pcr方法，扩增出高致病性h5n8 亚型禽流感病毒a/swan/shanxi/4-1/2020(h5n8)的ha1和ha2基因片段，在扩增ha1片段 的同时将ha基因裂解位点氨基酸由-rekrrkr-突变为-retr-，使其由高致病性禽流感病 毒分子特征突变为典型低致病性禽流感病毒分子特征；再利用重叠延伸反应，扩增出裂解位 点为典型低致病性流感病毒分子特征的ha片段，插入pbd质粒，构建重组ha基因双向 转录载体；
13.(2)利用rt-pcr方法，扩增出h5n8亚型禽流感病毒a/swan/shanxi/4-1/2020(h5n8)的 na基因全基因片段，插入pbd质粒，构建重组na基因双向转录载体；
14.(3)将(1)、(2)所述构建的ha、na基因2个重组pbd双向转录载体质粒和含有流感 病毒鸡胚高滴度适应株a/pr/8/34(h1n1)的pb2、pb1、pa、np、m、ns基因的6个pbd 双向转录载体质粒混合，并与转染试剂一起接种293t细胞，将培养后收获的细胞及上清接 种鸡胚，获得具有ha活性的h5n8禽流感rh5n8-2/6重组病毒株。得到的重组病毒ha和 na来自于高致病性h5n8流感病毒国内分离株a/swan/shanxi/4-1/2020(h5n8)，但ha裂解 位点呈典型低致病性禽流感病毒分子特征(-retr-)，6个内部基因pb2、pb1、pa、np、m及ns来自流感病毒鸡胚高滴度适应株a/pr/8/34(h1n1)。
15.进一步地，扩增ha1基因的引物对如seq id no.9和seq id no.10所示，其中seqid no.10为ha裂解位点的突变引物；扩增ha2基因的引物对如seq id no.11和seq idno.12所示。
16.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
17.1、h5-re14与我国h5n8禽流感病毒流行株a/swan/shanxi/4-1/2020(h5n8)抗原性一 致，制备疫苗免疫鸡后将对h5n8流感病毒流行株a/swan/shanxi/4-1/2020(h5n8)的攻击产 生良好的特异保护效果。该病毒含有流感病毒鸡胚高滴度适应株a/pr/8/34(h1n1)的6个内 部基因，因此具有良好的鸡胚适应性，病毒生长滴度与野毒相比，可提高9倍以上；以此为 疫苗株生产疫苗，可大大降低疫苗生产成本，提高疫苗质量。
18.2、通过对ha基因裂解位点人工修饰，h5-re14株病毒具有典型低致病性流感病毒的 分子特征，h5-re14株重组病毒对鸡胚和鸡均无致病性，生物安全性高。
附图说明
19.图1为rt-pcr扩增基因的凝胶电泳图，图中a为以a/swan/shanxi/4-1/2020(h5n8)毒 株cdna为模板，rt-pcr扩增的ha1、ha2、ha和na基因片段，分别为第1～4泳道， m为dna marker 2000；b为以重组h5n8病毒的cdna为模板，rt-pcr扩增的重组病毒 8个基因片段，第1至第8泳道分别为ha、na、pb2、pb1、pa、np、m、ns基因片 段，m为dna marker 2000。
20.图2为h5-re14病毒ha基因裂解位点区域突变前后序列。
21.图3为重组h5-re14病毒和野生型h5n8流感病毒a/swan/shanxi/4-1/2020(h5n8)的生 长曲线。
具体实施方式
22.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材 料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
23.实验材料
24.1.病毒株
25.a/swan/shanxi/4-1/2020(h5n8)(简称sw/sx/4-1/20)为2020年在我国山西病死天鹅中分 离得到，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所国家禽流感参考实验室分离、鉴定和保存，该 毒株记载文献：“现用重组禽流感病毒(h5 h7)三价灭活疫苗对近期h5和h7病毒抗原变异 株的免疫效力研究”，刘艳晶等，《中国预防兽医学报》，2021年9月知网在线发表。申请人 保证从申请日起二十年内可开放提供该生物材料。
26.2.spf鸡胚及细胞
27.spf鸡胚和spf鸡，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/国家禽类实验动物资源 库，293t细胞(人胚肾细胞，scsp-502)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
28.3.质粒载体
29.pbd载体(zejun li,hualan chen,peirong jiao,guohua deng,guobin tian,yanbing li, erich hoffmann,robert g.webster,yumiko matsuoka,and kangzhen yu.molecular basis ofreplication of duck h5n1 influenza viruses in a mammalian mouse model.j.virol.2005, 79:12058-12064)由陈化兰研究员构建，将单向转录质粒载体ppolisapirib中包含聚合酶i 启动子-sapi克隆位点-鼠源核酶序列的xbai酶切片段，反向插入pci(promega)质粒的 xbai位点，形成rna聚合酶ii启动子(cmv)
→
病毒rna转录终止信号序列rib
→
流感 病毒基因组cdna(5
’→3’
)
→
人rna聚合酶i启动子
→
mrna转录终止polya信号序列 (sv40)构成的双向转录表达质粒载体，利用该载体可同时转录出流感病毒负链vrna和正链 mrna。插入a/pr/8/34(h1n1)毒株pb2，pb1，pa，np，m和ns等6个内部基因的 pbd-pb2、pbd-pb1、pbd-pa、pbd-np、pbd-m和pbd-ns载体由中国农业科学院哈尔 滨兽医研究所国家禽流感参考实验室鉴定和保存(guobin tian,suhua zhang,yanbing li, zhigao bu,peihong liu,jiyong zhou,chengjun li,jianzhong shi,kangzhen yu,hualan chen. protective efficacy in chickens,geese and ducks of an h5n1 inactivated vaccine developed byreverse genetics.virology,2005,341:153-162)。
30.4.主要试剂
31.病毒rna提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；反转录试剂盒(revertra ace rtkit)购自日本toyobo公司；ex-taq酶购自takara公司；pcr产物纯化试剂盒(cycle
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pure-kit)购自omega公司；胶回收试剂盒(wizard sv gel and pcr clean-up system)购自 promega公司；测序试剂盒(abi bigdye terminator v3.1)购自美国thermo fisher公司；质粒 提取试剂盒(qiagen plasmid midi kit)购自qiagen公司。
32.5.引物
33.分析比较，设计合成h5n8流感分离株sw/sx/4-1/20(h5n8)ha1、ha2和na基因的 特异性引物，合成引物序列见表1。
34.表1h5n8禽流感病毒sw/sx/4-1/20(h5n8)的ha和na基因特异性引物序列
[0035][0036][0037]
分析比较，设计合成a/pr/8/34(h1n1)的pb2、pb1、pa、np、m、ns基因的特异性 引物，合成引物序列见表2。
[0038]
表2流感病毒a/pr/8/34(h1n1)的6个内部基因片段的特异性引物序列
[0039][0040]
实施例1：重组h5n8流感病毒h5-re14的制备与鉴定
[0041]
1.重组病毒2个表面基因(ha和na)的构建和鉴定：
[0042]
提取h5n8亚型高致病性禽流感分离株sw/sx/4-1/20(h5n8)的rna，并将其反转录 为cdna，使用ha基因的ha1片段特异性引物(ha1-u：atg gag aac ata gta ctt ctt ctt g； ha1-l-：gcc ccg aac agg cct cta gtt tct ctt aga gga cta ttt ctg agc，其中ha1-l为突变ha裂解 位点为低致病性病毒分子特征的引物)和ha2片段特异性引物(ha2-u：act aga ggc ctg ttc ggggcg ata gca ggg t；ha2-l：tta aat gca aat tct gca ctg taa c)，利用rt-pcr方法，分别扩增出 ha基因的ha1和ha2片段(图1中a)，并在扩增ha1基因片段的同时对ha裂解位点 进行致弱突变修饰；然后以ha1、ha2为模板，ha1-u/ha2-l为引物，用phusion高保真 聚合酶进行重叠延伸反应(soe-pcr)，扩增出裂解位点呈典型低致病性禽流感病毒分子特 征(-retr-)的ha片段(图1中a)。并将其克隆于pbd载体中，构建成pbd-ha重组 质粒。
[0043]
ha基因裂解位点的突变引物(ha1-l)根据ha基因多个连续碱性氨基酸位点的特异 性序列设计，扩增后的ha基因裂解位点由-rekrrkr-突变为-retr-，使其由高致病性禽 流感病毒分子特征突变为典型低致病性禽流感病毒分子特征(图2)。
[0044]
再利用rt-pcr方法，扩增上述高致病性h5n8毒株的na基因全长(图1中a)，按 上述方法插入pbd载体中，构建成pbd-na重组质粒。
[0045]
2.重组病毒的拯救：
[0046]
利用脂质体转染法，将上述ha、na基因2个重组质粒和含有a/pr/8/34(h1n1)病毒内 部基因的pbd-pb2、pbd-pb1、pbd-pa、pbd-np、pbd-m、pbd-ns等6个重组质粒同时 导入单层的293t细胞，48小时后收获细胞及上清，接种9～11日龄鸡胚尿囊腔，48小时后 收获尿囊液并检测血凝(ha)活性。ha阳性样品即为救获的h5n8亚型低致病性重组病毒， 将获得的重组病毒命名为a/harbin/h5-re14/2021(h5n8)，株号为h5-re14，保藏于位于中 国武汉的武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为cctcc no：v202160。
[0047]
3.重组病毒的序列鉴定
[0048]
提取重组病毒h5-re14的rna，利用rt-pcr方法，分别扩增出重组病毒h5-re14全 基因组的8个片段，对pcr产物进行核酸凝胶电泳(图1中b)，胶回收后测定每一片段的 特定序列。
[0049]
h5-re14株ha基因序列如seq id no.1所示，h5-re14株na基因序列如seq idno.2所示，h5-re14株pb2基因序列如seq id no.3所示，h5-re14株pb1基因序列如 seq id no.4所示，h5-re14株pa基因序列如seq id no.5所示，h5-re14株np基因序列 如seq id no.6所示，h5-re14株m基因序列如seq id no.7所示，h5-re14株ns基因序 列如seq id no.8所示。
[0050]
利用dnastar软件(dnastar lasergene v7.1)，对测定的序列与野生毒株h5n8流感病 毒国内分离株sw/sx/4-1/20(h5n8)和流感病毒a/pr/8/34(h1n1)的序列进行序列比较，发 现重组病毒h5-re14的ha和na来自于高致病性h5n8流感病毒国内分离株sw/sx/4
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1/20(h5n8)，但ha裂解位点呈典型低致病性流感病毒分子特征(-retr-)；6个内部基因 pb2、pb1、pa、np、m及ns来自于鸡胚高度适应性的流感病毒a/pr/8/34(h1n1)。
[0051]
4.重组病毒h5-re14生长曲线的测定
[0052]
禽流感疫苗常用鸡胚生产，要求疫苗株在接种的鸡胚中具有良好的生长特性。本研究进 行h5-re14株病毒在鸡胚中的生长特性研究。将亲本病毒h5n8流感病毒流行株sw/sx/4
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1/20(h5n8)和重组病毒h5-re14接种2组spf鸡胚各20枚，在最适36℃条件下分别培养 24、48、72和96小时，分别取上述培养不同时间的各5枚鸡胚进行血凝测定，检测亲本毒 株sw/sx/4-1/20(h5n8)和重组病毒h5-re14的生长曲线。
[0053]
从试验结果可以看出，在36℃培养条件下，重组病毒生长滴度(平均ha滴度最高为 8.6log2，即1:388)较亲本h5n8流感病毒国内分离株sw/sx/4-1/20(h5n8)(平均ha滴度最 高为5.4log2，即1:42.2)有明显提高，血凝效价高出9.19倍(图3)。这说明本发明制备出了 一株高生长滴度的重组病毒，将为以后的疫苗批量生产带来巨大的经济利益。
[0054]
5.重组病毒h5-re14的抗原性分析
[0055]
抗原性是病毒是否可以作为疫苗株的关键指标。本研究将亲本h5n8流感病毒国内分离 株sw/sx/4-1/20(h5n8)与人工重组的h5n8流感病毒灭活后制备油乳剂灭活疫苗，免疫 spf鸡制备抗血清，使用hi试验进行抗原性分析，hi试验方法参考高致病性禽流感诊断技 术国家标准(gb)(gb/t118936-2020))。hi试验结果显示，亲本h5n8流感病毒国内分离株 sw/sx/4-1/20(h5n8)与人工重组的h5n8流感病毒与对应血清之间的交叉hi滴度无差异， 表明h5n8病毒重组为鸡胚适应性的h5-re14株后，病毒依然保持着亲本毒株的抗原性(见 表3)。
[0056]
表3：亲本毒株sw/sx/4-1/20(h5n8)与重组病毒h5-re14株的抗原性分析
[0057][0058]
6.重组病毒h5-re14株对鸡胚和鸡的致病力试验
[0059]
疫苗毒株的低致病性是具有生物安全性的前提条件。9～11日龄spf鸡胚和4～8周龄 sfp鸡经常作为禽流感病毒致病性评估模型。
[0060]
为了解重组毒株的致病性，本发明首先使用spf鸡胚进行病毒致病性的评估。9日龄的 spf鸡胚(购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/国家禽类实验动物资源库)20枚，随机分为 2组，每组10枚，第一组通过尿囊腔接种10-4
倍稀释的重组h5-re14株病毒液，第二组通 过尿囊腔接种10-4
倍稀释的亲本毒株sw/sx/4-1/20(h5n8)的病毒液。接种后72小时内观察 和记录鸡胚死亡情况。
[0061]
本发明同时使用spf鸡进行病毒致病性和感染能力的评估。6周龄的spf鸡20只，随 机分为2组，每组10只，将重组毒株h5-re14和亲本毒株sw/sx/4-1/20(h5n8)尿囊液分别 稀释10倍后，静脉途径接种6周龄spf鸡，接种后每日观察发病死亡情况，连续观察10 日，计算鸡静脉内接种致病指数(ivpi)。若ivpi大于1.2，则表明该毒株为高致病性毒 株；若ivpi小于1.2，ha裂解位点为高致病性禽流感病毒分子特征，则为高致病性禽流感 毒株；若ivpi小于1.2，ha裂解位点为低致病性流感病毒分子特征，则为低致病性禽流感 毒株。
[0062]
6周龄的spf鸡20只，随机分为2组，每组10只，将重组毒株h5-re14和亲本毒株 sw/sx/4-1/20(h5n8)尿囊液分别稀释至106eid
50
/ml后，分别鼻腔途径接种6周龄spf鸡各 10只，0.1ml/只。接种后每日观察发病死亡情况，连续观察14日，同时采集喉头和泄殖腔 拭子进行病毒滴定，评估病毒对鸡的感染能力。
[0063]
所有的试验鸡均在拥有独立通风系统的负压隔离器里饲养，所有涉及h5n8高致病性病 毒的试验均在生物安全三级实验室内进行。
[0064]
spf鸡胚致病试验结果显示，接种亲本毒株sw/sx/4-1/20(h5n8)病毒液的鸡胚在接种 后26～30小时内全部发病死亡，接种重组毒株h5-re14株病毒液的所有鸡胚在接种后72 小时内均全部存活，表明h5-re14株重组病毒对鸡胚无致病性。
[0065]
spf鸡静脉内接种致病指数(ivpi)测定试验结果显示，接种亲本毒株sw/sx/4
‑ꢀ
1/20(h5n8)病毒液的鸡在接种后1日内全部发病死亡，其ivpi为3.0；接种重组毒株h5
‑ꢀ
re14株病毒液的所有鸡10日内均无任何不良反应发生，构建的h5-re14株重组病毒ivpi 为0(见表4)。表明h5-re14株重组病毒为低致病性毒株，对鸡无致病性。
[0066]
spf鸡鼻腔感染试验结果显示，鼻腔接种亲本毒株sw/sx/4-1/20(h5n8)病毒液的所有 鸡在接种后2～3日内全部发病死亡；而鼻腔接种重组毒株h5-re14株病毒液的所有鸡在14 日观察期内均无任何不良反应发生；感染sw/sx/4-1/20(h5n8)病毒死亡的所有鸡喉头和泄 殖腔拭子病毒检测均呈阳性，而感染h5-re14株重组病毒的鸡在3日和5日拭子样品病毒 检测均为阴性，表明h5-re14株重组病毒为对鸡无感染和致病能力(见表4)。
[0067]
以上结果表明，h5-re14株重组病毒对鸡胚和鸡均无致病性，生物安全性高。
[0068]
表4h5-re14株重组病毒的致病性和感染能力测定
[0069][0070]
*该组鸡在攻毒后2～3日内全部发病死亡，所有死亡鸡均排毒均计入攻毒后3日排毒结 果；/该组鸡在攻毒后5日无存活。
[0071]
7.重组病毒h5-re14株的免疫原性评估
[0072]
将ha价为8log2的重组病毒h5-re14株以0.2％甲醛灭活后，以美国sornneborn品
牌
‑ꢀ
40(lytol)白油为佐剂制备油乳剂灭活疫苗，以10只3周龄的spf鸡为模型动物，0.3ml/只肌 肉注射免疫，同时设10只不免疫对照鸡。免疫后21日检测所有鸡血清中hi抗体滴度，同 时以100cld
50
(cld50为鸡半数致死量)的剂量攻击sw/sx/4-1/20(h5n8)强毒，攻毒后观 察14日，观察存活情况，并在攻毒后3日和5日采集喉头和泄殖腔拭子，接种鸡胚检测 排毒情况。死亡鸡拭子样品随时采集。
[0073]
结果显示，免疫21日时，免疫鸡血清中针对h5n8病毒的hi抗体滴度在7.0log2～9.0log2之间，平均滴度为8.0log2，对照鸡血清针对h5n8病毒的hi抗体滴度均＜2.0log2 (hi＜2log2判定为hi抗体阴性)；免疫后21日以鼻腔感染途径100ld
50
的剂量攻击h5n8 亚型禽流感强毒后，所有免疫鸡健活，攻毒后3日和5日拭子样品病毒检测均为阴性；而对 照鸡在攻毒后5日内全部发表死亡，而且死亡鸡喉头和泄殖腔拭子样品病毒分离结果均为阳 性(见表5)。
[0074]
表5h5-re14株重组病毒制备疫苗免疫鸡后hi抗体和攻毒后存活及排毒情况
[0075][0076]
*该组鸡在攻毒后2～4日内全部发病死亡，所有死亡鸡均检测排毒，排毒结果计入攻毒后3日排毒 结果；/该组鸡在攻毒后5日无存活。
[0077]
以上结果表明，人工重组h5n8流感病毒h5-re14具有良好的免疫原性，能够预防 h5n8亚型禽流感。