一种阳离子铱配合物及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种阳离子铱配合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.脊髓损伤（spinal cord injury，sci）是脊髓组织受到外力作用导致结构与功能发生改变，使得损伤平面以下出现运动、感觉和自主神经功能的短暂或永久性丧失。其病理生理过程经常被分为原发性损伤与继发性损伤。其中氧化应激（oxidative stress，os）是继发性损伤主要机制之一。os是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，倾向于氧化，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。
3.正常情况下，机体内产生的氧化物质与抗氧化物质处于平衡状态，一旦机体受到损伤，氧化物质产生过多，比如过多的超氧阴离子（.o
2-）、羟自由基（.oh）和过氧化氢（h2o2）等产生，对机体产生损伤。sci后，大量的活性氧产生，氧化还原平衡状态被打破，是的脊髓在原发性损伤的基础上进一步加重。如果能有效抑制sci急性期氧自由基的产生或清除氧自由基，能有效的减少损伤的进展。
4.目前，铱（iii）配合物，由于其高发射效率、较长的激发态寿命、光和热稳定性以及发射波长的易调谐性而受到广泛关注。因此，铱（iii）配合物在化学传感器、生物探针、光催化水还原、有机发光二极管和发光电化学电池等方面有着广阔的应用前景。此外，多种阳离子铱复合物亦被报道，如[（η
5-cp
*
）ir（c^n）cl]pf61，其表现出较强的抗癌作用，其主要作为一种氧化剂促进ros产生，进而抑制肿瘤细胞的增殖。然而截至目前，并无一种ir（iii）复合物被合成并报道其具有抗氧化作用，其在脊髓损伤修复方面的应用更是未有研究。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于解决现有技术中所存在的技术问题，从而提供了一种阳离子铱配合物及其制备方法和应用。所述阳离子铱配合物可以有效清除氧自由基，对抗氧化应激诱导的损伤，促进脊髓损伤修复。
[0006]
为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。
[0007]
本发明第一方面提供了一种阳离子铱配合物，其结构式如下所示：
，所述阳离子铱配合物命名为d79。
[0008]
作为优选地，所述阳离子铱配合物由如下方法制备而得：（1）将2-氰吡啶加热熔化，加入一水合肼，再加入乙醇，搅拌过夜；减压蒸发溶剂，所得固体悬浮于石油醚中，冰浴冷却，过滤，甲苯重结晶提纯，得到（吡啶-2-基）酰胺腙；（2）将步骤（1）中所得（吡啶-2-基）酰胺腙置于schlenk管中，加入碳酸钠，35
±
2℃加热5分钟，再加入二甲乙酰胺（dmaa）和四氢呋喃（thf），然后冷却到0℃，得到混合物；另取间氟苯甲酰氯和二甲乙酰胺混合液，加入到混合物中，搅拌5小时，关闭制冷，恢复至室温；反应结束后过滤，冲洗，所得固体加入到乙二醇中，加热至190℃，反应30分钟，冷却后收集白色固体，得到3fphtz配体；（3）将[（η
5-cp
*
）ircl2]2和3fphtz配体加入到二氯甲烷（ch2cl2）中，在氮气下搅拌16小时，加入六氟磷酸铵，减压下去除所有溶剂，得到的黄色固体用ch2cl2饱和溶解并在其上方铺上正己烷进行结晶，即得。
[0009]
作为优选地，步骤（1）中所述2-氰吡啶、一水合肼、乙醇、石油醚的用量比为0.05mol：0.05mol：2.5ml：25ml。
[0010]
作为优选地，步骤（2）中所述（吡啶-2-基）酰胺腙、碳酸钠、二甲乙酰胺、四氢呋喃、间氟苯甲酰氯和二甲乙酰混合液的用量比为7.5mmol：7.5mmol：7.5ml：2.5ml：10ml。
[0011]
作为优选地，步骤（2）中所述间氟苯甲酰氯和二甲乙酰混合液中间氟苯甲酰氯和二甲乙酰的体积比为3:1。
[0012]
作为优选地，步骤（3）中所述[（η
5-cp
*
）ircl2]2、3fphtz配体、二氯甲烷、六氟磷酸铵的用量比为0.2mmol：0.44mmol：15ml：0.8mmol。
[0013]
本发明第二方面提供了一种阳离子铱配合物的制备方法，包括如下步骤：（1）将2-氰吡啶加热熔化，加入一水合肼，再加入乙醇，搅拌过夜；减压蒸发溶剂，所得固体悬浮于石油醚中，冰浴冷却，过滤，甲苯重结晶提纯，得到（吡啶-2-基）酰胺腙；（2）将步骤（1）中所得（吡啶-2-基）酰胺腙置于schlenk管中，加入碳酸钠，35
±
2℃加热5分钟，再加入二甲乙酰胺（dmaa）和四氢呋喃（thf），然后冷却到0℃，得到混合物；另取间氟苯甲酰氯和二甲乙酰胺混合液，加入到混合物中，搅拌5小时，关闭制冷，恢复至室温；反应结束后过滤，冲洗，所得固体加入到乙二醇中，加热至190℃，反应30分钟，冷却后收集白色固体，得到3fphtz配体；（3）将[（η
5-cp
*
）ircl2]2和3fphtz配体加入到二氯甲烷（ch2cl2）中，在氮气下搅拌
16小时，加入六氟磷酸铵，减压下去除所有溶剂，得到的黄色固体用ch2cl2饱和溶解并在其上方铺上正己烷进行结晶，即得。
[0014]
作为优选地，步骤（1）中所述2-氰吡啶、一水合肼、乙醇、石油醚的用量比为0.05mol：0.05mol：2.5ml：25ml。
[0015]
作为优选地，步骤（2）中所述（吡啶-2-基）酰胺腙、碳酸钠、二甲乙酰胺、四氢呋喃、间氟苯甲酰氯和二甲乙酰混合液的用量比为7.5mmol：7.5mmol：7.5ml：2.5ml：10ml。
[0016]
作为优选地，步骤（2）中所述间氟苯甲酰氯和二甲乙酰混合液中间氟苯甲酰氯和二甲乙酰的体积比为3:1。
[0017]
作为优选地，步骤（3）中所述[（η
5-cp
*
）ircl2]2、3fphtz配体、二氯甲烷、六氟磷酸铵的用量比为0.2mmol：0.44mmol：15ml：0.8mmol。
[0018]
本发明第三方面提供了一种预防和/或治疗与氧化应激相关的疾病的药物组合物，包括阳离子铱配合物，其结构式如下所示：。
[0019]
作为优选地，所述与氧化应激相关的疾病包括但不限于继发性脊髓损伤。
[0020]
本发明第四方面提供了一种阳离子铱配合物在制备用于预防和/或治疗与氧化应激相关的疾病的药物中的应用。
[0021]
作为优选地，所述与氧化应激相关的疾病包括但不限于继发性脊髓损伤。
[0022]
本发明相对于现有技术具有如下技术效果：（1）本发明所提供的阳离子铱配合物d79能够有效清除氧自由基。经d79处理后可促进分支形成和神经突生长，表明d79可修复海马神经元细胞，对抗氧化应激诱导的损伤，同时对于细胞或组织无明显的毒性产生。
[0023]
（2）体内研究表明，d79能够显著增强小鼠的行为功能降低脊髓损伤后的氧化应激反应，从而促进脊髓损伤的修复，为脊髓损伤药物助治疗提供一种新的研究思路和药物来源。
附图说明
[0024]
图1为3fphtz配体的合成工艺示意图图2为3fphtz配体的1h nmr图。
[0025]
图3为d79的合成工艺示意图。
[0026]
图4为d79的1h nmr图。
[0027]
图5为d79的自由基清除能力检测结果示意图；其中，左：abts自由基清除法;右：dpph自由基清除法。
[0028]
图6为d79对海马神经元的毒性检测结果示意图。
[0029]
图7为d79对损伤的海马神经元的作用研究结果示意图（*表示与control组比较，#表示与injury组比较）。
[0030]
图8为d79对脊髓损伤后动物的的行为学功能影响研究结果示意图；其中，左：运动功能评分（bbb score），右：gale联合评分（bms score）。
[0031]
图9为小鼠活体成像典型图。
[0032]
图10为小鼠活体成像荧光强度示意图。
具体实施方式
[0033]
为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0034]
在无特别说明的情况下，本发明上下文中所使用的试剂中，均通过市售获得。对于动物实验，相关程序及方法符合医学伦理学要求。本发明所使用的实验方法均为本领域的常规方法和技术。
[0035]
生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean
±
sd和mean
±
sem展示。所有实验至少重复三次。数据采用graphpad prism 5.0或spss 22.0软件进行分析。采用t检验、卡方检验、方差分析等常规医学统计学方法比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05被认为是一个显著的差异。
[0036]
实施例1 阳离子铱配合物（d79）的制备及表征一种阳离子铱配合物的制备方法，包括如下步骤：（1）合成（吡啶-2-基）酰胺腙：将2-氰吡啶（5.2g，0.05mol）缓慢加热熔化，然后加入一水合肼（2.6ml，2.7g，0.05mol），得到混浊混合物。加入乙醇（2.5ml），搅拌过夜，形成凝胶状产物，减压蒸发溶剂，悬浮于石油醚（25ml）中，冰浴冷却，过滤，甲苯重结晶提纯，得（吡啶-2-基）酰胺腙（5.3g，77.4%）；（2）合成3fphtz配体：取（吡啶-2-基）酰胺腙（1.0g，7.5mmol），将其置于火焰干燥、氮气净化的50ml schlenk管中，加入碳酸钠（0.8g，7.5mmol），35
±
2℃加热5分钟，加入7.5ml干燥的二甲乙酰胺（dmaa）和2.5ml干燥的四氢呋喃（thf），然后冷却到0℃，得到淡黄色的悬浮液。用一个新的50ml干schlenk烧瓶，加入7.5mmol 间氟苯甲酰氯和2.5ml dmaa，将该溶液滴加到预冷的酰胺氮酮混合物中，制得亮黄色溶液。将亮黄色溶液搅拌5小时，关闭制冷，使之恢复到室温。反应结束后过滤得到淡黄色固体，用水和乙醇冲洗。所得固体加入到10ml乙二醇中，加热至190℃，反应30分钟，冷却后形成的白色固体即为3fphtz配体，收集，无需进一步纯化即可使用。
[0037]
所述3fphtz配体的合成工艺及1h nmr图如图1-2所示。
[0038]
（3）合成阳离子铱配合物：将0.2mmol的[（η
5-cp
*
）ircl2]2和0.44mmol的3fphtz配体分散在15ml ch2cl2中，在氮气下搅拌16小时，加入0.143g（0.88mmol）六氟磷酸铵。反应完成后，在减压下去除所有溶剂，得到的黄色固体用ch2cl2饱和溶解并在其上方铺上正己烷进
行结晶，得阳离子铱配合物（d79）。
[0039]
所述阳离子铱配合物d79的合成工艺及1h nmr图如图3-4所示。
[0040]
实施例2 d79对氧自由基的清除能力研究采用abts法与dpph法测定d79自由基清除能力，具体如下：（1）将abts原液（5mmol/l，溶解于pbs中）与氧化锰溶液反应形成abts自由基（abts
•
）；（2）将不同浓度的d79与步骤（1）中abts自由基溶液混合；（3）使用细胞成像多模式阅读器（cytation 5，biotek instruments inc.）检测120分钟内734 nm的吸光度。
[0041]
检测结果如图5所示。结果显示，d79明显抑制abts自由基的形成，且呈时间和剂量依赖性，表明d79具有较高的清除ros的活性，从而可以作为有效的自由基清除剂，防止ros对神经元的损伤。
[0042]
进一步地，采用同样的方法进行了dpph（1，1-二苯基-2-苦肼）的体外自由基清除试验，结果与abts实验相同。
[0043]
实施例3 d79对神经元细胞的毒性研究（1）取sprague-dawley（sd）大鼠脑海马组织，加入0.25%胰酶，于37℃下消化15分钟；（2）用牛血清蛋白终止胰蛋白酶作用后，清洗组织并轻轻研磨；（3）将分离的海马神经元以20000细胞/ml的浓度接种在35毫米培养皿（costar，cambridge，ma）中，用含10%胎牛血清、10%营养混合物f-12的dmem培养基（含谷氨酰胺，gibco，carlsbad，ca，cat#12430054），置于37℃、95% o2、5% co2的培养箱中培养培养24h；（4）用含5% b-27（gibco）的neurobasal培养基替代原培养基，置于37℃、95% o2、5% co2的培养箱中培养24h；（5）细胞粘附后，分别在每孔中加入不同浓度的d79，再孵育24小时；（6）使用cck8试剂盒（abnova（walnut，ca））进行检测，评估培养中的海马神经元的生存能力。
[0044]
结果如图6所示。结果显示，所研究的d79浓度均显示出细胞生存能力与空白对照组相比无显著性差异，细胞存活率均超过80%，即便是在高浓度25.0μmol/l时，细胞存活率仍然接近90%，说明d79治疗对神经元细胞没有明显的细胞毒性。
[0045]
实施例4 d79对神经元的修复作用研究（1）取sprague-dawley（sd）大鼠脑海马组织，加入0.25%胰酶，于37℃下消化15分钟；（2）用牛血清蛋白终止胰蛋白酶作用后，清洗组织并轻轻研磨；（3）将获得的海马神经元中加入含120μm的谷氨酸的培养基中，孵育12小时行成海马神经元的损伤模型；（4）加入不同浓度的d79观察其对神经元的影响。
[0046]
结果如图7所示，通过量化分支神经突的长度和总数来评估复合物d79对神经突生长的影响。结果显示，d79在6.25μmol/l时的分支明显多于损伤组；同时还发现d79处理后的一、二分支数量远高于损伤组，且随浓度增加而增加。树突的长度与树突的数量相似。d79在
6.25μmol/l时的分支总长度显著高于其他各组，而d79在1.56μmol/l时相对于损伤组也与神经元长度增加有关。d79在6.25μmol/l时的一次支和二次支长度也较损伤组显著提高。
[0047]
实施例5 d79的体内功能研究（1）选取24只6周龄雌性小鼠，分为四组，每组6只，包括空白对照组（control组，6只）、假处理对照组（sham组，6只）（只切除椎板，不损伤脊髓）、模型组（injury组，6只）、d79组（injury d79组，6只）（脊髓损伤后第二天开始腹腔注射d79 10
µ
l，浓度为6
µ
g/
µ
l，每日1次），构建脊髓损伤的小鼠模型的方法如下：a.剔除小鼠背部的毛发，显露小鼠背部的皮肤；b.麻醉：用1.25%三溴乙醇以200μg/20g的剂量腹腔注射麻醉，呼吸平稳、四肢肌力明显减弱、疼痛反射与角膜反射消失表示麻醉成功；c.显露脊髓：用碘伏棉球擦拭2遍消毒皮肤；确定胸椎第9-11段（t9-t11）水平，并在t9-t11水平在背部正中作一个2.5cm长的纵向切口。钝性剥离椎旁肌，用咬骨钳去除棘突和椎板，彻底暴露t9-t11节段脊髓，操作过程中要小心避免额外的组织损伤。随后用固定器撑开固定，以充分暴露脊髓；d.将小鼠固定到路易斯维尔损伤系统装置上（louisville injury system apparatus，lisa），将脊髓调调整至冲击器下，并同时由其监测激光束确认冲击位置，以冲击深度来确定脊髓损伤程度，本实施例中冲击深度为0.6mm；e.关闭切口，术后皮下注射庆大霉素2000u，每日1次，连续3d，每8h进行1次人工膀胱排空。
[0048]
（2）监测：从损伤后第六天开始，每3天进行一次bbb评分和bms评分，第3周与第4周进行矿场试验。结果如图8所示。结果显示，开始时，所有sci小鼠的后肢运动完全丧失。d79治疗组在损伤后6～30天出现行为功能剪切恢复指标，随后随着时间的推移bbb与bms评分逐渐改善。损伤后30天，d79治疗组小鼠bbb与bms评分明显高于损伤组小鼠，差异具有统计学意义。
[0049]
（3）小动物活体成像：损伤后第3天，第7天进行小动物活体成像。先腹腔注射0.1ml/20g l-012（化学发光（chl）探针），l-012的浓度为4mg/ml。5分钟后，用1.25%三溴乙醇以200
µ
g/20g的剂量腹腔注射麻醉，待麻醉成功后，进行小动物活体成像。
[0050]
结果如图9-10所示。结果显示，在正常小鼠脊髓中很少见ros的生物发光,而脊髓损伤小鼠脊髓中ros的生物发光强度明显提高，并随时间增加而增加。d79处理7d后，ros的生物发光强度显著降低，且随时间变化不大，进一步证实了d79在体内具有显著的氧自由基清除以及脊髓损伤修复作用。
[0051]
综合上述可知，d79能够有效清除氧自由基。经d79处理后可促进分支形成和神经突生长，表明d79可修复海马神经元细胞，对抗氧化应激诱导的损伤。此外，体内研究表明，d79处理明显增强了小鼠的行为功能。同时对使用d79处理组小鼠行为的视频分析发现，移动的总距离、到点区域的距离平均值、到点的距离和移动频率明显高于损伤组，与正常组和假手术组相似。结果表明，d79治疗有效改善了小鼠的功能和行为，ros生物发光强度的定量值则说明静脉注射d79可以促进脊髓损伤的修复。
[0052]
以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对
相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。